一種特異靶向her2蛋白的多肽的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種特異靶向HER2(人表皮生長因子受體2)蛋白的多肽，所述多肽如以下通式1所示：X1X2X3X4X5X6X7RX8YWX9X10X11X12X13X14X15X16X17RX18X19X20X21YX22；本發明還涉及一種編碼多肽的核苷酸序列，以及表達該多肽的表達載體及宿主細胞；本發明還涉及了該多肽、其形成的二價體或多價體及其作為靶向多肽與能殺傷癌細胞的制劑和顯像制劑形成的藥物組合物及其用途，本發明的多肽能對HER2陽性細胞起靶向作用，選擇性強，且本發明涉及的肽可以采用化學合成的方法制備得到，純度高，分子量小，特異性強，無免疫原性，安全可靠。
【專利說明】—種特異靶向HER2蛋白的多肽
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物化學領域，具體涉及一種多肽，尤其涉及一種特異靶向HER2蛋白的多肽和由該肽所衍生的且能與HER2蛋白結合的產品及上述多肽或其衍生的產品在制備靶向HER2抗腫瘤藥物或顯像制劑中的用途。
【背景技術】
[0002]癌癥是全球一個主要死亡原因，數據顯示:2012年全球新增約1410萬例癌癥病例，癌癥死亡人數達820萬，與之相比，2008年的數據分別為1270萬和760萬。世界范圍內診斷的最常見癌癥依次為肺癌(180萬，13% )、乳腺癌(170萬，11.9% )和結直腸癌(140萬,9.7% ),最主要致死癌癥為肺癌(160萬，19.4% )、肝癌(80萬,9.1% )和胃癌(70萬，
8.8% ) ο
[0003]國際癌癥研究機構根據現有數據預計，由于全球人口增長和老齡化，到2025年前，全球每年新增癌癥病例數將高達1930萬例。2012年，全球總數的一半以上癌癥新增病例和癌癥死亡人數發生在欠發達地區，分別為56.8%和64.9%，而這些比例將在2025年進一步增加。
[0004]目前惡性腫瘤的治療方法主要有手術治療、化療、放療三種，其中化療是近年來在腫瘤治療中進步最快的治療方法。但是化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，也殺傷了人體正常細胞，毒副作用大。因此，靶向抗腫瘤藥物及分子探針研究勢在必行。
[0005]癌癥靶向治療成功的前提是找準治療的靶點。HER2 (人表皮生長因子受體2，又名ErbB2)蛋白，是一個185 kDa的跨膜糖蛋白受體酪氨酸激酶，定位于細胞膜，具有胞外配體結合區，單跨膜區和胞內酪氨酸激酶活性區。HER2參與信號轉導途徑，激活后引起磷酸化激酶級聯反應，導致細胞生長和分化。乳腺癌、卵巢癌，胃癌和子宮等多種腫瘤中都有HER2的過度表達。HER2已經成為治療癌癥的重要靶標。
[0006]多肽易于大量合成，分子量小，組織滲透性強，同時可防止網狀內皮系統的非特異性攝取。此外，多肽可被化學改性以改變其親和力、電荷、疏水性、穩定性和溶解性，可通過反復的優化修改在體內使用。在腫瘤靶向療法中，多肽類藥物及診斷探針顯示出很強的優越性，是抗體的一種有吸引力的替代物。在應用方面，多肽與放射性核素的配合，可作為探針應用于分子成像；一些天然存在的多肽已被用作輸送劑；生殖激素的肽和它們的衍生物可用于腫瘤靶向治療。因此高效率發現有價值的活性多肽已成為癌癥診斷與治療面臨的重要任務。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種多肽，特別是一種特異靶向HER2蛋白的多肽、和由該肽所衍生的且能與HER2蛋白結合的產品及上述多肽或其衍生產品在制備靶向HER2抗腫瘤藥物或顯像制劑中的用途。
[0008]為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案:
[0009]第一方面，本發明提供了一種靶向HER2蛋白的肽，其氨基酸序列通式I為:
[0010]X1X2X3X4X5X6X7Rx8Yffx9X10X11X12X13X14X15Xi6Xi7RXi8Xi9X2OX2IYX22 ；
[0011]上述肽鏈中單字母符號代表的氨基酸殘基定義如下:R為精氨酸，Y為賴氨酸，W為色氨酸，X1^22為可變的氨基酸殘基。
[0012]作為優選技術方案，X1是酰胺類氨基酸或酸性氨基酸殘基，優選為天冬酰胺或天冬氨酸；x2是堿性氨基酸殘基，優選為賴氨酸或精氨酸；x3是芳香類氨基酸殘基，優選為苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸-J4是極性氨基酸殘基，優選為天冬酰胺或精氨酸；x5是堿性氨基酸殘基，優選為賴氨酸或精氨酸；x6是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；x7是含硫氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甲硫氨酸或亮氨酸；x8是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；x9是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；xi(l是脂肪族氨基酸殘基，優選為丙氨酸或亮氨酸；Xn是脂肪族氨基酸殘基，優選為亮氨酸或異亮氨酸；x12是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；x13是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；x14是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸-J15是酰胺類氨基酸或酸性氨基酸殘基，優選為天冬酰胺或天冬氨酸；x16是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；X17是堿性氨基酸殘基，優選為賴氨酸或精氨酸；x18是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；x19是脂肪族氨基酸殘基，優選為異亮氨酸或亮氨酸；χ2。是含硫氨基酸或堿性氨基酸殘基，優選為甲硫氨酸或精氨酸；x21是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；x22是脂肪族氨基酸或極性氨基酸殘基，優選為亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸。
[0013]作為優選技術方案，本發明所述肽的氨基酸序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。
[0014]第二方面，本發明還提供了一種DNA片段，其包含編碼上述本發明通式I的肽的氨基酸序列。
[0015]作為優選技術方案，所述DNA片段包含編碼上述本發明SEQ ID N0.1或SEQ IDN0.2的肽的氨基酸序列。
[0016]第三方面，本發明還提供了一種表達載體，包括至少一個拷貝的編碼氨基酸序列為通式I所示肽的本發明第二方面所述的DNA片段。
[0017]作為優選技術方案，本發明的表達載體，包括至少一個拷貝的編碼氨基酸序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示肽的本發明第二方面所述的DNA片段。
[0018]第四方面，本發明還提供了一種原核或真核宿主細胞，該宿主細胞含有如本發明第三方面所述的表達載體。
[0019]第五方面，本發明還提供了一種二價體或多價體，由本發明第一方面的通式I所述肽及SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所述肽組裝而成。
[0020]如上所述的二價體或多價體是具有靶向HER2陽性的腫瘤細胞的特性。
[0021]作為優選技術方案，本發明的二價體或多價體是通過連接分子共價連接形成或通過與多聚體混合，非共價連接形成的。
[0022]優選地，所述多聚體為聚乙二醇(PEG)或環糊精。
[0023]第六方面，本發明還進一步提供了一種藥物組合物，包括本發明第一方面的氨基酸序列為通式I所述肽、SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2所述的肽或所述肽的二價體或多價體作為靶向多肽，和能殺傷癌細胞的制劑。
[0024]作為優選技術方案，本發明所述肽、二價體或多價體作為靶向多肽，與能殺傷癌細胞的制劑相綴合或混合。
[0025]優選地，所述的制劑為能殺傷癌細胞的化學藥物、生物藥物、納米藥物、放射性藥物、光熱治療或光動力治療藥物或包裹這些藥物的載體中的任意一種；
[0026]進一步優選地，所述的制劑為烷化劑、抗代謝藥物、抗腫瘤天然藥物、抗腫瘤抗生素、激素及金屬絡合物或腫瘤放射靶向標記物中的任意一種。
[0027]進一步優選地，所述載體為納米材料，脂質體或油性化合物中的任意一種，或者由多種油性化合物所組成的混合物。
[0028]本發明采用將通式1、SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所述肽、及所述肽的二價體或多價體和納米材料、脂質體等高分子材料綴合，本發明涉及的肽、二價體或多價體可以使綴合后生成的化合物在機體內更穩定地被運輸到靶細胞。本發明涉及的肽、二價體或多價體也可以和油性化合物或多種油性化合物的混合物相混合，本發明涉及的肽也可以使所得到的混合物在機體內更穩定地被運輸到靶細胞。
[0029]第七方面，本發明還進一步提供了另外一種藥物組合物，所述藥物組合物包括本發明第一方面的氨基酸序列為通式I所述肽、SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2所述的肽或所述肽的二價體或多價體；和顯像制劑。
[0030]優選地，所述肽、二價體或多價體與顯像制劑相綴合或混合。
[0031]優選地，所述的顯像制劑為放射性核素、放射性核素標記物或分子影像制劑中的任意一種。
[0032]第八方面，本發明還提供了本發明第一方面的氨基酸序列為通式I所述肽、SEQ IDN0.USEQ ID N0.2所述的肽或所述肽的二價體或多價體在制備用于治療、預防或診斷癌癥的藥物或顯像制劑中的用途。
[0033]作為優選技術方案，本發明所述癌癥為HER2過表達的癌癥。
[0034]優選地，所述癌癥為乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、食管癌、白血病、膀胱癌、子宮頸癌
[0035]本發明的肽具有靶向HER2蛋白的作用，可以作為靶頭增加藥物或載有藥物的載體如納米材料、脂質體等在HER2陽性細胞中的含量，再添加藥學上可接受的輔料或佐劑制成新型的更有效的靶向抗癌藥物。
[0036]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
[0037]本發明涉及的肽能對HER2陽性細胞起靶向作用，選擇性強，且本發明涉及的肽可以采用化學合成的方法制備得到，純度高，分子量小，特異性強，無免疫原性，安全可靠。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]圖1為流式細胞學方法檢測異硫氰酸熒光素(FITC)標記的SEQ ID N0.USEQ IDN0.2及抗體分別對人HER2陽性乳腺癌細胞(SKBR3細胞系)的結合作用；
[0039]其中A為對照組，B為抗HER2抗體，C為SEQ ID N0.1，D為SEQ ID N0.2，E為結合率直方圖。
[0040]圖2為流式細胞學方法檢測FITC標記的SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2及抗體分別對人HER2陰性乳腺癌細胞(MCF-7細胞系)的結合作用；
[0041]其中A為對照組，B為抗HER2抗體，C為SEQ ID N0.1，D為SEQ ID N0.2。
[0042]圖3為流式細胞學方法檢測FITC標記的SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2及抗體分別對人HER2陰性胚腎正常細胞(293A細胞系)的結合作用；
[0043]其中A為對照組，B為抗HER2抗體，C為SEQ ID N0.1，D為SEQ ID N0.2。
[0044]圖4為免疫熒光方法檢測FITC標記的SEQ ID N0.USEQ ID N0.2分別對人HER2陽性乳腺癌細胞(SKBR3細胞系)的結合作用；
[0045]其中，細胞核用hochest試劑染色；A_D是SEQ ID N0.1多肽和hochest處理過的細胞，其中A為SEQ ID N0.1多肽的結合位點，主要存在于細胞膜，B為細胞核，C為明視野整個細胞，D為A-C的疊合圖；E-H是SEQ ID N0.2多肽和hochest處理過的細胞，其中E為SEQ ID N0.2多肽的結合位點，主要存在于細胞膜，F為細胞核，G為明視野整個細胞，H為E-G的疊合圖。
[0046]圖5為免疫熒光方法檢測FITC標記的SEQ ID N0.USEQ ID N0.2分別對人HER2陰性乳腺癌細胞(MCF-7細胞系)的結合作用；
[0047]其中，細胞核用hochest試劑染色；A_D是SEQ ID N0.1多肽和hochest處理過的細胞，其中A為SEQ ID N0.1多肽的結合位點，B為細胞核，C為明視野整個細胞，D為A-C的疊合圖；E-H是SEQ ID N0.2多肽和hochest處理過的細胞，其中E為SEQ ID N0.2多肽的結合位點，F為細胞核，G為明視野整個細胞，H為E-G的疊合圖。
[0048]圖6為免疫熒光方法檢測FITC標記的SEQ ID N0.USEQ ID N0.2分別對人HER2陰性胚腎正常細胞(293A細胞系)的結合作用；
[0049]其中，細胞核用hochest試劑染色；A_D是SEQ ID N0.1多肽和hochest處理過的細胞，其中A為SEQ ID N0.1多肽的結合位點，B為細胞核，C為明視野整個細胞，D為A-C的疊合圖；E-H是SEQ ID N0.2多肽和hochest處理過的細胞，其中E為SEQ ID N0.2多肽的結合位點，F為細胞核，G為明視野整個細胞，H為E-G的疊合圖。
[0050]圖7為表面等離子共振(SPR)方法檢測SEQ ID N0.1 (A)、SEQ ID N0.2 (B)分別對不同濃度的人HER2蛋白的結合作用。
[0051]氨基酸序列:
[0052]SEQ ID N0.1:NKFNKGMRGYffGALGGGNGKRGIRGYD
[0053]SEQ ID N0.2 =NKFNKGMRGYffGALGGGNGKRGIMGYD
【具體實施方式】
[0054]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本領域技術人員應該理解的是，所述實施例僅是意圖舉例說明本發明，而不是意圖限制本發明的范圍。本發明的范圍由后附的權利要求具體限定。
[0055]實施例1本發明多肽的合成
[0056]I)實驗儀器與材料
[0057]二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，樹脂，二氯甲烷(DCM)，茚三酮反應試劑(茚三酮，維C，苯酚)，四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，六氫吡啶(哌啶)，三異丙基硅烷TIS，乙二硫醇(EDT)，無水乙醚，三氟乙酸(TFA)，N-甲基嗎啉(NMM)，甲醇，各種氨基酸，多肽固相合成管。
[0058]2)溶液配制
[0059]脫保護溶劑——六氫吡啶:DMF = I:4
[0060]反應液-NMM:DMF = I:24
[0061]裂解液-TFA(92.5% ) ,TIS(2.5% )、EDT(2.5% ) ,H20(2.5% )
[0062]茚三酮測試液-茚三酮:維C:苯酚=1:1:1
[0063]3)實驗步驟
[0064]稱量樹脂并投入到多肽固相合成管(以下簡稱反應器)中，加入適量的DMF溶脹半小時以上。抽掉DMF，用脫保護液進行Fmoc去保護反應，置于搖床上10分鐘。抽掉去保護液，用DMF、DCM洗滌3次，從反應器中取少量樹脂(約5~1mg)于試管中，用乙醇洗滌2次，茚三酮法檢測并記錄顏色，準備投料，進入氨基酸縮合反應。分別按照SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2肽的氨基酸序列順序取相應氨基酸、HBTU(氨基酸:HBTU = 1:1)，用反應液溶解，投入到反應器中，攪拌反應。1-2小時后，從反應器中取少量樹脂于試管中，用乙醇洗滌2次，茚三酮法檢測。抽掉反應器中的液體，用DMF、DCM各洗滌2次，得到第一個氨基酸縮合后的肽樹脂。對所得肽樹脂重復進行以上“Fmoc去保護——氨基酸縮合”反應步驟，至最后一個氨基酸反應完畢，得到序列號為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的肽。反應完畢后，DMF、DCM各洗滌樹脂2-3次，甲醇洗兩次，繼續抽干15-20分鐘。反應器中取出合成完的部分肽樹脂，在室溫下于裂解液(裂解液先冰浴20分鐘)中裂解兩小時。將樹脂過濾后，于旋蒸儀蒸干，用無水乙醚(冰浴)洗3次。粗肽使用制備型反相HPLC純化，使用HPLC檢測純度>90%。所得到的純肽使用質譜(MS, eLectrospray)鑒定。
[0065]至最后一個肽合成后，取出部分肽樹脂加異硫氰酸熒光素(FITC)熒光標記。先將Fmoc-e-Acp-OH按氨基酸偶聯方法鏈接在多肽上，再取適量HBTU與FITC溶于熒光偶聯溶劑中，3— 5小時后，茚三酮測溶液測試。標記成功后采用上述同樣的方法進行裂解、純化與鑒定。
[0066]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2肽的有關理化性狀如表1所示。
[0067]表1
[0068]
【權利要求】
1.一種特異靶向HER2蛋白的肽，其特征在于，其通式為: X1X2X3X4X5X6X7Rx8Yffx9XlOx11Xi2Xi3Xi4Xi5Xi6Xi7RXi8Xi9X2OX2IYX22 其中，R為精氨酸，Y為賴氨酸，W為色氨酸，X1^22為可變的氨基酸殘基； 優選地，X1是酰胺類氨基酸或酸性氨基酸殘基，優選為天冬酰胺或天冬氨酸；X2是堿性氨基酸殘基，優選為賴氨酸或精氨酸；X3是芳香類氨基酸殘基，優選為苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸-J4是極性氨基酸殘基，優選為天冬酰胺或精氨酸；X5是堿性氨基酸殘基，優選為賴氨酸或精氨酸；X6是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；X7是含硫氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甲硫氨酸或亮氨酸；X8是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；X9是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸A1。是脂肪族氨基酸殘基，優選為丙氨酸或亮氨酸A11是脂肪族氨基酸殘基，優選為亮氨酸或異亮氨酸；x12是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；x13是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；x14是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；x15是酰胺類氨基酸或酸性氨基酸殘基，優選為天冬酰胺或天冬氨酸；x16是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；χ17是堿性氨基酸殘基，優選為賴氨酸或精氨酸；x18是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；x19是脂肪族氨基酸殘基，優選為異亮氨酸或亮氨酸；x2。是含硫氨基酸或堿性氨基酸殘基，優選為甲硫氨酸或精氨酸；x21是極性氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優選為甘氨酸或丙氨酸；x22是脂肪族氨基酸或極性氨基酸殘基，優選為亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸。
2.根據權利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列為SEQIDN0.1或SEQID N0.2 所示。
3.—種DNA片段，其特征在于，其包含編碼權利要求1-2任一項所述肽的核苷酸序列。
4.一種表達載體,其特征在于,所述表達載體含有至少一個拷貝的如權利要求3所述的DNA片段。
5.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權利要求4所述的表達載體。
6.根據權利要求1-2任一項所述的肽形成的二價體或多價體，其特征在于，所述的二價體或多價體具有靶向HER2陽性腫瘤細胞的特性； 優選地，所述的二價體或多價體是通過連接分子共價連接形成的； 優選地，所述的二價體或多價體是通過與多聚體混合，非共價連接形成的； 優選地，所述多聚體為聚乙二醇(PEG)或環糊精。
7.—種藥物組合物，其特征在于， 所述藥物組合物包括權利要求1-2任一項所述的肽和能殺傷癌細胞的制劑； 優選地，所述藥物組合物包括權利要求6所述的二價體或多價體和能殺傷癌細胞的制劑； 優選地，所述肽、二價體或多價體作為靶向多肽，與能殺傷癌細胞的制劑相綴合或混合； 優選地，所述的制劑為能殺傷癌細胞的化學藥物、生物藥物、納米藥物、放射性藥物、光熱治療或光動力治療藥物或包裹這些藥物的載體中的任意一種； 進一步優選地，所述的制劑為烷化劑、抗代謝藥物、抗腫瘤天然藥物、抗腫瘤抗生素、激素、金屬絡合物或腫瘤放射靶向標記物中的任意一種； 進一步優選地，所述載體為納米材料，脂質體或油性化合物中的任意一種，或者由多種油性化合物所組成的混合物。
8.—種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權利要求1-2任一項所述的肽和顯像制劑； 優選地，所述藥物組合物包括權利要求6所述的二價體或多價體和顯像制劑； 優選地，所述肽、二價體或多價體與顯像制劑相綴合或混合； 優選地，所述的顯像制劑為放射性核素、放射性核素標記物或分子影像制劑中的任意一種。
9.權利要求1-2任一項或6所述的肽、二價體或多價體在制備用于治療、預防或診斷癌癥的藥物或顯像制劑中的用途。
10.根據權利要求 9所述的用途，其特征在于，所述癌癥為HER2過表達的癌癥； 優選地，所述癌癥為乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、食管癌、白血病、膀胱癌、子宮頸癌或鼻咽癌中的任意一種。
【文檔編號】A61P35/00GK104130315SQ201410359780
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】耿令令, 方巧君, 胡志遠, 連文璽, 楊小亮 申請人:國家納米科學中心