動物疫苗用佐劑及其制備方法和應用與流程

本發明屬于生物制品類動物疫苗領域，具體涉及一種動物疫苗用佐劑及其制備方法和應用。
背景技術：
：目前，絕大多數動物疫苗的兩種基本組成成分為抗原和佐劑。佐劑如同藥物的膠囊，能起到保護疫苗，并使疫苗緩慢釋放的作用。自乳化、二步乳化、多步乳化將決定疫苗生產工藝的難度及影響疫苗的生物學活性。油包水型(W/O)、水包油型(O/W)和水包油包水型(W/O/W)會決定動物免疫應答的快慢和疫苗保護時間的長短，其中“水”是指抗原，“油”是指佐劑，不同的類型是指油和水包裹的空間結構的區別，水包油包水型是綜合性能最優秀的。但是水包油包水型佐劑是佐劑的技術難點，經過文獻和專利檢索，現已有水包油包水型佐劑專利(有的稱雙相佐劑或W/O/W佐劑)，如公開號為201310619292.2的中國專利文獻《獸用疫苗用雙相油乳佐劑及其制作方法》，是使用礦物油(注射級/醫用級)和乳化劑(也稱表面活性劑)進行配制，佐劑再與抗原混合在一起進行乳化，乳化完得到水包油包水型疫苗。但都存在一定的缺點，具體闡述如下：1、安全性：因為佐劑是要注射到動物體內的，佐劑構成成分的生物安全性是其最基礎屬性，例如礦物油以直鏈烷烴為主但含有芳香烴和環烷烴，芳香烴和環烷烴容易造成動物毒副反應；乳化劑吐溫-80存在多種脂肪酸殘基的混入，過多的脂肪酸殘基發生過氧化反應后會生成有毒成分，造成動物溶血性、過敏和休克，佐劑產生的毒副反應將會超過產品本身帶來的益處。2、穩定性：油和水本身不能互溶，水包油包水型本身為熱力學不穩定型，佐劑與抗原配置成疫苗后需要冷藏、運輸和解凍，佐劑與抗原的油水界面膜極易破裂，破裂后佐劑對抗原的保護和緩釋效果將受到影響，所以穩定性也是佐劑性能的重要體現。其次在水包油包水型佐劑與抗原配制過程中也是不穩定的，出于生物安全考慮，佐劑所用的乳化劑為非離子型，乳化劑的HLB值(親水親油平衡值)是形成水包油包水型的關鍵之一，非離子型乳化劑的HLB值會隨溫度變化，溫度不適合，水包油包水型會不穩定，將會變成油包水型或水包油型，而與此同時溫度也會影響抗原的生物學活性，所以溫度成為了水包油包水型疫苗生產工藝和生產設備的難點，選擇合適的乳化劑以降低乳化劑HLB值對溫度的敏感性是解決問題的捷徑，而現有的水包油包水都沒有提出降低乳化劑HLB值對溫度的敏感性的方案。3、易配制性：水包油包水型佐劑與抗原的配制進行兩步或兩步以上的乳化，會帶來乳化 工藝繁瑣度和增加乳化工藝時間，而這都會影響疫苗的生物學活性。綜上可知，尋求新型的兼具安全性、穩定性和易配制性的動物疫苗用佐劑成為了當務之急。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種兼具安全性、穩定性、自乳化性、乳化過程對溫度的敏感性低、且能形成水包油包水型空間結構的動物疫苗用佐劑及其制備方法和應用。為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：一種動物疫苗用佐劑(命名為GR208佐劑)，所述動物疫苗用佐劑包括以下體積分數的原料組分：上述的動物疫苗用佐劑中，優選的，所述動物疫苗用佐劑中，按體積分數計：所述辛癸酸甘油酯為0.5％～5％，所述司盤-80為0.5％～8％；所述甘油為0.1％～4.9％，所述聚甘油異硬脂酸酯為0.1％～4.9％；所述聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15為0.1％～5％，所述丙二醇為0.1％～5％。更優選的，所述辛癸酸甘油酯為0.5％～3％，所述司盤-80為0.5％～7％；所述甘油為0.1％～3％，所述聚甘油異硬脂酸酯為0.1％～2％。上述的動物疫苗用佐劑中，優選的，所述動物疫苗用佐劑中，按體積分數計：所述辛癸酸甘油酯為0.5％～3％，所述司盤-80為0.5％～7％；所述甘油為0.25％～2.5％，所述聚甘油異硬脂酸酯為0.25％～2.5％；所述聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15為0.5％～2％，吐溫-80為0％～4％，丙二醇為0.5％～4％。上述的動物疫苗用佐劑中，優選的，所述動物疫苗用佐劑中，所述低密度礦物油在15℃下的密度為0.83kg/L～0.85kg/L；所述低密度礦物油為低密度醫用級礦物油。上述的動物疫苗用佐劑中，優選的，所述聚甘油異硬脂酸酯包括聚甘油單異硬脂酸酯、聚甘油二異硬脂酸酯、聚甘油三異硬脂酸酯中的一種或多種。上述的動物疫苗用佐劑中，優選的，所述吐溫-80的純度不低于99％。作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述的動物疫苗用佐劑的制備方法，包括以下步驟：按照所述原料組分的體積分數，先量取低密度礦物油，然后向低密度礦物油中加入辛癸酸甘油酯和司盤-80，再加入甘油和聚甘油異硬脂酸酯，最后加入聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15、吐溫-80和丙二醇，混合均勻后，靜置，待所得混合液中無氣泡后，密封存儲，得到動物疫苗用佐劑；或者，按照所述原料組分的體積分數，先量取低密度礦物油，然后向低密度礦物油中加入辛癸酸甘油酯和司盤-80，再加入聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15、吐溫-80和丙二醇，最后加入甘油和聚甘油異硬脂酸酯，混合均勻后，靜置，待所得混合液中無氣泡后，密封存儲，得到動物疫苗用佐劑。上述的制備方法中，優選的，所述制備方法的整個過程中，控制溶液溫度不超過30℃，且每次添加原料組分后均需混合均勻。作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述的動物疫苗用佐劑或者上述的制備方法制得的動物疫苗用佐劑在制備動物疫苗中的應用。本發明中，吐溫-80即為聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯，司盤-80即為失水山梨醇油酸酯。與現有技術相比，本發明的優點在于：1、本發明的佐劑為水包油包水型佐劑，具有獨特的均勻緩釋效果，能減少因異體蛋白給動物帶來的過敏反應，還能為動物提供快速的免疫應答、整齊的免疫效價及長期的免疫保護，有效降低了對動物的毒副反應，且不會影響動物的正常發育。2、本發明的佐劑采用低密度醫用級礦物油(溫度15℃下，密度為0.83kg/L～0.85kg/L)，醫用級礦物油絕大多數為高壓加氫法，油密度低，芳香烴和環烷烴很少，對動物毒害低，其黏度低，動物注射部位形成肉腫塊的可能性低。本發明采用高純度的吐溫-80(純度不低于99％)，純度越高的吐溫-80，其游離脂肪酸越少，動物毒副反應越低。本發明佐劑的乳化劑成分選擇使用辛癸酸甘油酯、甘油、聚甘油異硬脂酸酯、丙二醇、司盤-80、聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15、吐溫-80。乳化劑種類的選擇對安全性和水包油包水體系的穩定性至關重要，辛癸酸甘油酯和聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15的復配能對吐溫-80進行替代，在兼顧產品成本的同時盡量降低吐溫-80的使用量，對于豬和犬等對吐溫-80毒副作用非常敏感的動物可以不用吐溫-80；甘油、聚甘油異硬脂酸酯、辛癸酸甘油酯的組合因為分子結構相近而分子量不同，乳化性能更高，乳化體系越穩定，能降低HLB值對溫度的敏感性；甘油和丙二醇小分子醇類能增加界面膜的強度，可在一定程度上克服熱力學不穩定的缺陷；辛癸酸甘油酯、甘油、聚甘油異硬脂酸酯及聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15的復配組合能提高佐劑的乳化性能，使佐 劑在多種溫度下與抗原自發形成水包油包水型疫苗。因此，本發明的佐劑中乳化劑的組合兼顧了佐劑安全性、佐劑穩定性、佐劑對溫度的敏感性、佐劑的自乳化性且能形成水包油包水型空間結構。3、本發明佐劑的制備方法簡單方便、成本低廉，并且能夠有效保護抗原活性：將抗原加入本發明的佐劑后，能自發乳化成乳液(無需白油、表面活性劑和抗原分別多步添加或過程中需要生成半成品)，即一步乳化，如性能和存儲另有要求，可以按需增加分散工藝(選擇不同的攪拌方式或均質方式)，整個加工時間縮短，加工方式簡單便捷，降低了生產成本。同時佐劑HLB值對溫度敏感性低，生產工藝對溫度無嚴苛要求，可以降低能耗。耗時短和低強度的生產過程使得抗原活性得到保護。4、本發明的佐劑可制成水包油包水型疫苗，使用了本發明佐劑的水包油包水型疫苗能夠獲得更長的儲存期和更遠的運輸距離，抗原能得到更好的保護和更長緩釋效果。并且，本發明的佐劑使得水包油包水型疫苗的配制更易實現，生產成本更低，疫苗配制過程中抗原生物活性受到影響更小，疫苗的免疫效果更好。附圖說明圖1為對比例1中仔豬接種GR208佐劑(由實施例1制備)和進口206佐劑口蹄疫滅活疫苗后體溫變化圖。圖2為對比例2中GR208佐劑苗(由實施例1制備)與傳統佐劑苗的免疫效果比較圖。圖3為對比例4中GR208佐劑苗(由實施例2制備)與傳統佐劑苗的免疫效果比較圖。具體實施方式以下結合說明書附圖和具體優選的實施例對本發明作進一步描述，但并不因此而限制本發明的保護范圍。以下實施例中，除非另有指明，所述的百分比均為按總體積比計，加工方式為錨式攪拌槳攪拌(50～100轉/分鐘)，所采用的材料和儀器均為市售。一種本發明的動物疫苗用佐劑(GR208)，包括以下體積分數的原料組分：動物疫苗用佐劑中，優選的，按體積分數計：辛癸酸甘油酯為0.5％～5％，司盤-80為0.5％～8％；甘油為0.1％～4.9％，聚甘油異硬脂酸酯為0.1％～4.9％；聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15為0.1％～5％，丙二醇為0.1％～5％。更優選的，辛癸酸甘油酯為0.5％～3％，司盤-80為0.5％～7％；甘油為0.1％～3％，聚甘油異硬脂酸酯為0.1％～2％。動物疫苗用佐劑中，還可優選的，按體積分數計：辛癸酸甘油酯為0.5％～3％，司盤-80為0.5％～7％；甘油為0.25％～2.5％，聚甘油異硬脂酸酯為0.25％～2.5％；聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15為0.5％～2％，吐溫-80為0％～4％，丙二醇為0.5％～4％。動物疫苗用佐劑中，低密度礦物油在15℃下的密度為0.83kg/L～0.85kg/L；低密度礦物油為低密度醫用級礦物油。聚甘油異硬脂酸酯包括聚甘油單異硬脂酸酯、聚甘油二異硬脂酸酯、聚甘油三異硬脂酸酯中的一種或多種。吐溫-80的純度不低于99％。一種上述的動物疫苗用佐劑的制備方法，包括以下步驟：按照原料組分的體積分數，先量取低密度礦物油，然后向低密度礦物油中加入辛癸酸甘油酯和司盤-80，再加入甘油和聚甘油異硬脂酸酯，最后加入聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15、吐溫-80(可以為0)和丙二醇，混合均勻后，靜置，待所得混合液中無氣泡后，密封存儲，得到動物疫苗用佐劑；或者，按照原料組分的體積分數，先量取低密度礦物油，然后向低密度礦物油中加入辛癸酸甘油酯和司盤-80，再加入聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15、吐溫-80(可以為0)和丙二醇，最后加入甘油和聚甘油異硬脂酸酯，混合均勻后，靜置，待所得混合液中無氣泡后，密封存儲，得到動物疫苗用佐劑。上述制備方法的整個過程中，控制溶液溫度不超過30℃，且每次添加原料組分后均需混合均勻。上述的動物疫苗用佐劑可廣泛用于制備動物疫苗。實施例1：一種本發明的動物疫苗用佐劑(GR208佐劑)，包括以下體積分數的原料：本實施例中，辛癸酸甘油酯的體積分數為1％，司盤-80的體積分數為6％。本實施例中，甘油的體積分數為1％，聚甘油異硬脂酸酯的體積分數為1％。本實施例中，聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15的體積分數為1％，吐溫-80的體積分數為3％，丙二醇的體積分數為3％。本實施例中，低密度礦物油具體為低密度醫用級礦物油，在15℃下的密度為0.834kg/L。本實施例中，聚甘油異硬脂酸酯具體為聚甘油二異硬脂酸酯。本實施例中，吐溫-80的純度為99％。一種上述本實施例的動物疫苗用佐劑的制備方法，包括以下步驟：(1)按上述原料的體積分數，先量取低密度礦物油；(2)向低密度礦物油中加入辛癸酸甘油酯和司盤-80，混合均勻；(3)加入甘油和聚甘油異硬脂酸酯，混合均勻；(4)加入聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15、吐溫-80和丙二醇，混合均勻；(5)靜置，待混合液中無氣泡后，密封存儲，得到動物疫苗用佐劑。以上的制備過程中，各步驟的溫度均控制在不超過30℃，得到動物疫苗用佐劑后，也要使其溫度保持在不超過30℃。上述的制備方法中，調換步驟(3)和步驟(4)的順序，也可實施。一種上述本實施例的佐劑在制備動物疫苗中的應用，制備1000g疫苗，采用常規一步法配制，疫苗成分如表1所示：表1GR208佐劑配制疫苗成分表成分含量(g)GR208500水相抗原介質500混合前，將每相均加熱至30℃，將水相抗原介質(口蹄疫抗原，也可采用安慰抗原介質MEM細胞培養液)混入GR208佐劑中，經過低剪切力(2000rpm～5000rpm均可)的攪拌，獲得穩定的疫苗乳劑(維持溫度在30℃)。該疫苗還可采用自乳化法、攪拌法、均質機均質法、高壓噴射均質法等制備，即將抗原于25～30℃加入佐劑中自發形成水包油包水型疫苗。經檢驗，由上述本實施例制備的GR208佐劑乳化的疫苗具有如表2～4所示的相關特性：表2GR208佐劑乳化的疫苗的穩定性和乳化條件表3GR208佐劑乳化的疫苗的相關特性(使用安慰抗原介質MEM細胞培養液)表4上海食品藥品檢驗所GR208佐劑乳化的疫苗安全性試驗由上述檢驗可知，本實施例制備的GR208佐劑及其與抗原配制的疫苗具有以下優點：免疫反應：GR208佐劑可通過誘導短期和長期的免疫反應以提高疫苗的效果，能誘導體液和細胞免疫反應，可用于病毒、細菌、支原體或寄生蟲抗原。強度：GR208配置的疫苗粘度低，低于4秒，符合2010版獸藥典收錄標準，易于注射(粘度檢測方法為：用1ml吸管，下口徑1.2mm，上口徑2.7mm，吸取25攝氏度左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時間)，尤其適用于獲得短期和長期的保護。這類即開即用的佐劑可以使用傳統的低剪切力的乳化機(最佳設備是高壓均質機)通過一步法制備穩定的液體疫苗。該佐劑可廣泛用于豬和牛的口蹄疫疫苗，還能用于提高活疫苗的效果。適用動物種類：GR208佐劑適用各種獸類(如豬、牛及小反芻動物)疫苗，能有效提高病毒苗、菌苗和寄生蟲苗等的免疫活性。安全性：對GR208佐劑進行的毒理學試驗(Berlin試驗，口服LD50，IPLD50，眼部刺激試驗，皮膚刺激試驗，致熱源性等)證實這類佐劑無毒且具有良好的相容性。對比例1：對16-18kg的仔豬分別接種實施例1制備的GR208佐劑乳化的口蹄疫滅活疫苗和進口206佐劑乳化的口蹄疫滅活疫苗，定時監測仔豬體溫、精神和進食情況。注射前，豬只體溫、精神和食欲均正常，注射后的試驗結果如圖1所示。試驗結果表明：注射4倍劑量后，本實施例的GR208佐劑和進口206佐劑乳化的口蹄疫疫苗均未引起仔豬體溫劇烈變化，仔豬精神和進食也能很快恢復，對免疫豬影響較小。對比例2：將本發明實施例1制備的GR208佐劑苗(即GR208佐劑與抗原構成的疫苗)與傳統油包水佐劑苗(具體為不完全弗氏佐劑與抗原構成的疫苗)的免疫效果進行比較，試驗結果如圖2所示。由圖2可知，本發明的GR208佐劑苗免疫后更早誘導抗體產生，效價更整齊。由此說明本發明的佐劑具有免疫應答快、免疫持續期長、免疫效價高且整齊的特點，可同時誘導體液和細胞免疫應答。實施例2：一種本發明的動物疫苗用佐劑，包括以下體積分數的原料：本實施例中，辛癸酸甘油酯的體積分數為2％，司盤-80的體積分數為6％。本實施例中，甘油的體積分數為2.5％，聚甘油異硬脂酸酯的體積分數為0.5％。本實施例中，聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15的體積分數為4％，丙二醇的體積分數為3％。本實施例中，低密度礦物油具體為低密度醫用級礦物油，在15℃下的密度為0.84kg/L。本實施例中，聚甘油異硬脂酸酯具體為聚甘油三異硬脂酸酯。一種上述本實施例的動物疫苗用佐劑的制備方法，包括以下步驟：(1)按上述原料的體積分數，先量取低密度礦物油；(2)向低密度礦物油中加入辛癸酸甘油酯和司盤-80，混合均勻；(3)加入甘油和聚甘油異硬脂酸酯，混合均勻；(4)加入聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯-15和丙二醇，混合均勻；(5)靜置，待混合液中無氣泡后，密封存儲，得到動物疫苗用佐劑。以上的制備過程中，各步驟的溫度均控制在不超過30℃，得到動物疫苗用佐劑后，也要使其溫度保持在不超過30℃。對比例3將傳統油包水佐劑苗(不完全弗氏佐劑與抗原構成的疫苗)、實施例2制備的GR208佐劑苗(GR208佐劑與抗原構成的疫苗)、空白對照(只含抗原)的安全性進行比較，試驗結果表5所示。表5實施例2的GR208佐劑苗與傳統油包水佐劑苗的安全性比較注：1.家兔，注射1.5ml/只，注射后觀察60天。2.(-)局部無異常，(+)有未吸收的油苗，(++)有輕度結節，(+++)有明顯結節。對比例4將實施例2制備的GR208佐劑苗與傳統油包水佐劑苗(不完全弗氏佐劑苗)的免疫效果進行比較，試驗結果如圖3所示。由圖3可知，本發明的GR208佐劑苗免疫后更早誘導抗體產生，效價更整齊。由此說明本發明的佐劑具有免疫應答快、免疫持續期長、免疫效價高且整齊的特點，可同時誘導體液和細胞免疫應答。以上所述僅是本發明的優選實施方式，本發明的保護范圍并不僅局限于上述實施例。凡屬于本發明思路下的技術方案均屬于本發明的保護范圍。應該指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下的改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3