一種制備靶向載藥微氣泡的方法及裝置與流程

本發明涉及一種制備靶向載藥微氣泡的方法，特別是適用制備微氣泡超聲造影劑的方法，及可適用于該方法的裝置。

背景技術：

常用的制備微氣泡超聲造影劑的方法有超聲空化法，冷凍干燥法，同軸靜電霧化法，高剪切乳化法等等。而這些方法所制備的微氣泡尺寸不均一，粒徑不可控，無法共振增強超聲成像，并且藥物包封率不高，穩定性差，靶向性也不強，無法制備出理想的靶向載藥超聲造影劑。

近年來微流控芯片技術已開始用于微納米材料制備的研究，對于應用微流控方法制備微氣泡超聲造影劑的研究也已經起步。微流控芯片是指通過光刻等技術在數平方厘米的玻璃或高聚物表面刻畫幾十到幾百微米大小通道用于流體控制的微型實驗平臺。在微流控芯片通道中，當氣體以一定流速進入液體流后，在表面張力作用下，氣體流可自發斷裂形成一個個微氣泡。與傳統方法相比，微流控技術因為是在連續流中制備微氣泡，制備條件均一可控，因此所獲得的微氣泡具有高度的單分散性和尺寸均一性。若將藥物溶于油相，利用水、油、氣三相流體微流控芯片技術，則理論上可將藥物可控封裝在脂質微氣泡的油膜中，形成磷脂包裹載藥油層、內核為氣體的三相微氣泡，保證很好的藥物包封率。

目前國內外一般采用流動聚焦型和內置毛細管T型結構這兩種常見的微流控芯片制備微氣泡，但是所制備的微氣泡粒徑較大，同時制備產率較常規方法低很多，導致效率低下。提高產率可以在提高單個微流控芯片產率的基礎上依靠規模化、集成化的微流控芯片組來實現，而制備微小粒徑、性質更穩定的微氣泡則是目前微流控技術制備載藥微氣泡所面臨的挑戰。目前應用微流控芯片技術已經能夠實現制備5μm以下微氣泡的課題組并不多，國外主要通過在微流控芯片中裹挾氣體通過幾微米大小的噴嘴制備小粒徑微氣泡，這樣制備的微氣泡穩定性較差且不能用于載藥，同時其特制的微流控芯片噴嘴需要超高精度的光刻制備技術，價格昂貴不適合量產。尤其是，微流控制備方法在解決微氣泡穩定性及擁有用于載藥的油層結構等問題上尚無有效方法。

技術實現要素：

本發明的目的旨在提供一種穩定性好的擁有三相載藥微氣泡結構的方法。

本發明的進一步目的還在于提供一種可有效制備粒徑小，包封率完全，且穩定性好的擁有三相載藥微氣泡結構的方法。

本發明的另一目的旨在提供適用于上述方法的一種特別的裝置。

本發明的方案是，該載藥微氣泡是由微流控方法制備的氣相內核、油相中間層、外殼為磷脂和靶向分子薄膜層的三相微氣泡；其制備過程是：對微流控芯片和水、油、氣三相進行加熱的同時，對各通道分別通入油、氣、水相制備三相微氣泡，制備完成后再降溫固化收集，其中加熱溫度高于油相熔點；所述的油相為熔點不低于20℃的憎水化合物；微流控芯片的各通道端口在交叉口中心處間隙距離為不高于10μm，其中氣相、油相通道的端口處設置成毛細管大小。

微流控芯片的氣相、油相通道的端口可以直接制備成毛細管大小，或是在氣相、油相通道內插設有毛細管。

本發明的所述的微流控芯片的內部通道可以是十字型、米字型或是其它可實現制備三相微氣泡的形狀。

所述的油相中加入有藥物、磷脂及靶向分子成分，在油、氣、水三相界面處水相切割氣相和油相形成微氣泡，

發明人通過研究意外的發現通過本發明以上方案的油、氣相通道端口在交叉口中心處毛細管大小控制、以及對微流控芯片加熱條件的控制及油相的選擇可以解決現有技術中一直困擾技術人員三相微氣泡穩定性問題，在對微流控芯片加熱過程，油相所進行加熱降溫冷卻過程中起到對三相微氣泡良好的穩定性作用。

本發明優選微流控芯片的各通道端口在交叉口中心處間隙距離為1～10μm.

本發明優選在十字型微流控芯片，在十字型微流控芯片左右兩個通道分別插入毛細管至十字交叉口中心處，兩個毛細管的端口在所述的十字交叉口中心處的間隙距離為1～10μm；毛細管的內徑為1～20μm，毛細管緊貼在十字型微流控芯片通道壁上；對十字型微流控芯片和水、油、氣三相進行加熱的同時，向十字型微流控芯片左右兩通道的毛細管內分別通入油相和氣相，十字型微流控芯片的上端通道則通入連續相水相；所述的油相中加入有磷脂及靶向分子成分，在油、氣、水三相界面處水相切割氣相和油相形成微氣泡，油相自發包裹氣相形成膜層中間層，磷脂和靶向分子自發分布于水油界面外層。

本發明的方案中優選油相為熔點不低于30℃的憎水化合物。本發明所述的油相進一步優選為溶點30-90℃的憎水化合物。

本發明的油相可以為脂肪酸等。

所述的磷脂為二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺DPPE、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二油酰基磷脂酰絲氨酸DOPS、二硬脂酰基磷脂酰膽堿DSPC、1,2-棕櫚酰磷脂酰甘油DPPG、二硬脂酰磷脂酰甘油DSPG、二棕櫚酰磷脂酸DPPA、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺DSPE和磷脂的PEG化產物中的一種或幾種。

所述的油相優選為癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸或棕櫚酸；或是在癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸中均加有質量含量為1％-20％磷脂后中的一種；或是在癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸中均加質量含量為0.1％-10％膽固醇后中的一種；或是在癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸中均同時加了質量含量為0.1％-10％膽固醇和質量含量為1％-20％磷脂后中的一種；或是在癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸中均同時加了1％-20％的磷脂后中的一種；或是在癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸中同時加了質量含量為0.1％-10％膽固醇和質量含量為1％-20％的磷脂后中的一種。

所述的油相用于攜帶藥物，所述的藥物為溶血栓藥物和/或抗腫瘤藥物。

所述氣相為空氣、氮氣、SF6或C3F8。

所述的連續相水相中添加有表面活性劑。所述的表面活性劑為吐溫20、丙二醇+甘油、PEG，PVA，甘油+PVA，脂質體，葡萄糖漿中的一種或幾種。

所述的靶向成分為靶向血栓分子及靶向腫瘤分子；

對十字型微流控芯片進行加熱的溫度為20～99℃；優選為20～90℃；本發明進一步的優選為30～80℃。

微氣泡通過十字型微流控芯片的收集口處流出時，降溫至-5～25℃進行固化處理；優選為-5～5℃。

本發明優選的水相的流速為1-1000μl/min。優選的油相的流速為0.1-100μl/min。優選的氣相的壓力為0.1-50atm。

本發明更優選的水相的流速為50-100μl/min。更優選的油相的流速為1-10μl/min。更優選的氣相的壓力為2-10atm。

本發明通過設置毛細管內徑的微流控芯片。在芯片左右兩個通道分別插入端口平齊的毛細管，緊湊相交于十字交叉口中心處，兩毛細管口精確控制在1-10μm。首先，將分散相和連續相引入十字型芯片，其中作為分散相的油相和氣相分別從芯片左右兩端毛細管通道通入，連續相(水相)從上端通道通入。在三相界面處，油相和氣相被從毛細管中擠出，在表面張力的作用下，首先形成油氣界面，當相對于油相流速較快的氣相被水相“切割”形成氣泡時，油相自發包裹氣相，形成油包氣的氣泡。其中，油相的成分可以為脂肪酸，在油相中加入磷脂，可形成以磷脂為核殼，油相包圍氣相的三相微氣泡。在油相中再加入油溶性藥物，可制得包封率完全，有磷脂作為核殼保護的載藥微氣泡。同時，如果將磷脂與相應的配體進行結合，可實現微氣泡的靶向載藥功能。最后，微氣泡通過收集口處流出，用冰塊將其降溫，進行固化，制備尺寸均一可控的穩定的微氣泡。在該過程中，本發明通過加熱溫度控制油相并配合磷脂在油水界面自發形成穩定的單分子膜，待制備的微氣泡冷卻后，通過固化的油相和磷脂膜共同穩定微氣泡。

本發明還提供設計了一種用于所述的制備靶向載藥微氣泡超聲造影劑方法的恒溫裝置，包括恒溫保護套，加熱器，溫控器，微型注射泵；恒溫保護套包括支撐基座，加熱器蓋板，恒溫保護套蓋板；支撐基座底層設有加熱器，加熱器上方覆蓋有加熱器蓋板，芯片設置在加熱器蓋板上；所述加熱器外接有溫控器；支撐基座的上層一端設有為微型注射泵，微型注射泵通過硅膠輸液管與芯片內的通道相連通。

所述的微型注射泵包括水相注射泵、氣相注射泵、油相注射泵。

所述的恒溫裝置，恒溫保護套蓋板對應芯片上端位置處設置為透明材質。

所述的恒溫裝置，所述的加熱器蓋板上設置有多個空心小孔。空心小孔的孔徑可設置為0.4-1cm。

加熱器蓋板上有一空心圓柱，直徑為2.5cm，用于儲備油相。將固體油相裝入注射器中，后將注射器放入加熱器蓋板上圓柱形孔中進行固定。放置完畢后，蓋上裝置蓋板，以保證保溫效果。

將芯片氣相分散相及水相連續相的硅膠輸液管通過蓋板小孔穿出，在外連接注射泵。最后，在恒溫保護套蓋板上層對應芯片的空缺處蓋上有機玻璃蓋板，有利于觀察微氣泡的生產情況及進行一些簡單的芯片移動。

附圖說明

圖1為一種用于三相載藥微氣泡生成的微流控芯片平面示意圖。其中a為連續相入口及通道，b,c為分散相入口及通道，d為兩分散相毛細管接口，e為微氣泡通道及微氣泡。

圖2為實施例1制備的微氣泡圖。

圖3為實施例1制備的載藥微氣泡圖。

圖4為本發明設計的微氣泡制備裝置系統結構示意圖。圖中的反應器即恒溫保護套。

圖5為恒溫保護套支撐基座示意圖；圖中左部上層可設置微型注射泵；右部下層設置有加熱器。

圖6中加熱器蓋板上設有空心圓柱的示意圖，其中空心圓柱用于儲備油相。

圖7為加熱器蓋板的示意圖。

圖8為恒溫保護套蓋板的示意圖，其頂面的一部分，可對應芯片位置，并設置為透明材質。

圖9為常溫下(a)和60度恒溫下(b)制備的三相微氣泡穩定性對照。

圖10為調節水油氣條件控制產生不同大小的微氣泡。

圖11為收集到的不同尺寸的微氣泡。

圖12為分別使用癸酸、月桂酸、棕櫚酸為油相，分別在(a)40℃、(b)60℃、(c)70℃下制備微氣泡。

具體實施方式

實施例1

將加熱器放入恒溫保護套支撐基座底層右端空缺處(如圖4所示)，加熱器連接線通過右端方形小孔處移出，在外連接溫控器進行加熱。蓋上加熱器蓋板(如圖7所示)。在恒溫保護套支撐基座上層左端放入微型油相注射泵，用螺絲釘進行固定。將微流控芯片放于右端的加熱器蓋板中央，通過四個較大的圓孔，用螺絲釘進行固定。將含5％DPPC的月桂酸(熔點44-46℃)裝入微型玻璃瓶，再放置于右端加熱器蓋板上空心圓柱內，作為油相儲存處與油性注射泵進行連接。固定完成后，蓋上恒溫保護套蓋板(如圖8所示)，芯片輸液硅膠管通過蓋板小孔處輸出與外界注射泵進行連接。蓋上恒溫保護套蓋板的有機玻璃蓋板。玻璃板上方與顯微鏡等觀察設備相連，構成整個微氣泡制備系統(如圖4所示)。

加熱，將溫度維持于60℃左右，使月桂酸能完全熔化。微流控芯片的寬度及高度均為100μm。如圖2，芯片a通道處通入含5％PEG的水溶液，芯片b通道處通過20μm內徑毛細管通入含5％磷脂DPPC的月桂酸，芯片c通道處通過20μm內徑毛細管通入空氣。其中水相流速為80μL/min，油相流速為0.5μL/min，通入的空氣氣壓為2atm。在三通道匯聚的噴口處，溶有磷脂的油相在表面張力作用力下，自發包圍氣相形成微氣泡，磷脂在水相和油相之間自發生成磷脂膜，從而在三相結合處獲得以磷脂為殼膜、油相內包含氣相的尺寸均一的微氣泡超聲造影劑。所制得的微氣泡通過100μm內徑的毛細管導出，在外收集并用冰塊降溫，使含有磷脂的月桂酸及時固化，提高其穩定性。將收集的微氣泡于顯微鏡下拍照，如圖2所示。通過調節水相流速的大小可以改變微氣泡的尺寸，如圖10所示，制備出5μm至100μm大小的微氣泡(如圖11所示，氣泡尺寸分別為5μm，10μm,50μm)。

實施例2

其它操作步驟同實施例1，原料藥為阿霉素。方法為將阿霉素溶于油相制備載阿霉素微氣泡。如圖3所示，在綠光激發下，載有阿霉素的微氣泡外周發紅光，而溶液不發光，證明藥物100％包裹于微氣泡的油層。并且，通過改變油相流速控制油膜厚度，發現阿霉素的熒光強度發生了相應的改變，證明該制備方法具備調控微氣泡載藥量的能力。

對比例1

其它操作步驟同實施例1，是常溫下制備三相微氣泡。

將實施例1的60度恒溫下制備的三相微氣泡和對比例1為常溫下制備的三相微氣泡穩定性進行比對。如圖9所示，圖9(a)的放置24小時后，相當一部分的微氣泡已不存在了，而圖9(b)在放置24小時，乃至18天后仍沒有消失，穩定存在。制備溫度超過油相熔點后所制備的三相微氣泡穩定性大大提高。

發明人通過本發明的方法配置不同的氣相、水相、油相的原料，目前可成功制備出在常溫下穩定存放20天的微氣泡(如圖12所示，氣泡放置時間分別為1分鐘，1天,20天)。使用不同熔點的脂肪酸作為油相時，加熱溫度不同。分別使用癸酸(熔點32℃)，月桂酸(熔點44～46℃)，棕櫚酸(熔點63℃)為油相，分別在40℃，60℃，70℃下制備微氣泡。(如圖12，(a)、(b)、(c)所示)。