一種用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的制備方法及應用與流程

本發明屬材料應用技術領域，具體涉及一種用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的制備方法及應用。

背景技術：

皮膚作為人體最大的器官，可以保護內部器官免受損傷并且維持水電解質平衡。燒傷、創傷、糖尿病足潰瘍等引起的皮膚缺損，會導致機體出現嚴重的感染、水電解質失衡、瘢痕增生等問題，給病人帶來巨大的精神和身體痛苦以及沉重的醫療負擔。因此，恢復皮膚的屏障功能成為當務之急。然而，部分皮膚缺損較大的患者，如大面積燒燙傷病人，由于自身皮源有限，無法及時有效封閉創面。為解決這個問題，應用一種合適的人工皮膚來替代自身皮源封閉創面是十分必要的。

目前，國外已有Integra、AlloDerm等許多商品化的人工皮膚應用于臨床。Integra是由Burke 和Yannas 于1980年開發的一種人工皮膚。它由硅橡膠薄膜構成“表皮”，戊二醛交聯的牛Ⅰ型膠原與6-硫酸軟骨素及氨基葡萄糖構成“真皮”。臨床應用發現其有利于創面組織的浸潤生長, 易于血管化且不易降解, 可以有效促進大面積燒傷創面的愈合，同時，對防治瘢痕疙瘩和增生性瘢痕也有明顯效果。然而，該人工皮膚對創面要求較高，抗感染能力弱，且力學強度和透氣性能也較差，同時，由于制備工藝復雜，價格昂貴，其難以廣泛推廣。 AlloDerm則是由美國Life Science公司生產的一種商品化脫細胞真皮基質，它是將新鮮尸體皮的表皮和細胞成分去除后制成的人工皮膚，因為去除了細胞成分, 所以AlloDerm降低了免疫原性, 但其仍保留了細胞外基質支架的三維結構以及完整的基底膜復合體, 可引導新生細胞生長擴展。但是，由于尸體皮源有限，且有傳播病毒的危險，同時AlloDerm價格昂貴，工藝復雜，其應用也受到限制。

因此，制備一種價格低廉、操作工藝相對簡單，且生物相容性好、抗菌效果佳的人工皮膚顯得尤為重要。

支架材料的性能是構建人工皮膚的關鍵因素，也是該領域的研究熱點。雞蛋膜，是位于雞蛋殼與蛋清之間的一種纖維網狀薄膜，具有良好的透氣性能及力學特性。雞蛋膜主要由角蛋白、膠原蛋白等蛋白質構成，同時還含有透明質酸、硫酸軟骨素等構成細胞外基質的主要成分。作為一種天然生物支架材料，其具有良好的生物組織相容性，并且無毒、無免疫原性。此外，雞蛋膜易于獲取，價格低廉，可以簡單經濟地在臨床上廣泛應用。目前，其已經用于某些表淺皮膚創面的治療。

納米銀是一種廣泛使用的醫用抗菌劑，對細菌、真菌等具有良好的殺滅效果。同時，納米銀抗菌持續且穩定，少有耐藥性。研究已證實，納米銀能通過抗菌抗炎有效促進創面愈合。因此，納米銀可以有效地作為人工皮膚中的抗菌制劑發揮作用。然而，納米銀在空氣中與氧接觸后易形成氧化銀，使其抗菌效能大大降低甚至消失。近年來研究發現，將納米銀整合到生物支架上可以有效地保持其穩定性和抗菌性。

目前制備納米銀并將其整合到生物支架制備人工皮膚的方法較多，包括靜電紡絲技術，應用還原試劑等。但是，靜電紡絲技術操作相對復雜，成本較高，而常用的還原試劑需時較多且易產生環境污染物。近年來，Messersmith發現多巴胺能夠在各種材料的表面自我聚合形成一層聚合多巴胺薄膜，該薄膜可以高效地粘附多種分子或者細胞。而聚合多巴胺具有還原性，可以在材料表面原位將銀離子還原成納米銀顆粒。研究證實，這類納米銀具有良好的穩定性及抗菌性。此外，多巴胺無毒、無致畸作用，具有良好的生物組織相容性，可以有效應用于人工皮膚的制備。

綜上，以雞蛋膜為生物支架，利用多巴胺的粘附及還原特性，制備一種雞蛋膜復合納米銀的抗菌人工皮膚是一種方便可行，簡單實用的方法。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的制備方法。本發明制備的用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的抗菌性能良好，無明顯生物毒性，可有效促進全層皮膚缺損創面的修復，其制備方法具有工藝簡單、耗時少、成本低的優點。

本發明提供一種用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

（1）取新鮮雞蛋，棄掉蛋清和蛋黃，將雞蛋殼置于去離子水中清洗，分離雞蛋膜，再用去離子水清洗后，將雞蛋膜剪成1—3cm×1—3cm大小；

（2）將步驟（1）制得的雞蛋膜置于濃度為1—100mM，pH=1—3的鹽酸溶液中，室溫下浸泡1—4天，然后用去離子水清洗3—5遍，每遍3—5分鐘；

（3）將多巴胺溶入濃度為10—100mM的Tris—HCl緩沖液中，制得濃度為2—4mg/mL的多巴胺溶液，將pH調節至8.5—9.5；

（4）將步驟（2）制得的雞蛋膜置于步驟（3）制得的多巴胺溶液中，室溫下浸泡6—20h，然后用去離子水清洗3—5遍，每遍3—5分鐘；

（5）將步驟（4）制得的雞蛋膜置于濃度為10—50nM硝酸銀溶液中，室溫下避光浸泡6—20h，然后用去離子水清洗3—5遍，每遍3—5分鐘，常溫下自然干燥，制得雞蛋膜復合納米銀薄膜。

進一步，所述步驟（1）、步驟（2）和步驟（4）制得的雞蛋膜用去離子水清洗3遍，每遍5分鐘。

進一步，所述步驟（2）的鹽酸溶液的濃度為1mM，pH=3。

進一步，所述步驟（3）的Tris—HCl緩沖液濃度為10mM。

進一步，所述步驟（3）制得的多巴胺溶液濃度為2mg/mL，pH=8.5。

進一步，所述步驟（5）的硝酸銀溶液的濃度為30nM。

一種用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜在制備用于治療皮膚缺損的人工皮膚或外科敷料中的用途。

進一步，所述皮膚缺損是皮膚全層缺損或皮膚感染創面。

對本發明的雞蛋膜復合納米銀薄膜進行以下性能測試。

1.掃描電鏡觀察：

參見圖1，采用掃描電子顯微鏡在不同倍數下觀察制得的雞蛋膜復合納米銀薄膜的表面結構。使用Image-Pro Plus 6.0軟件，測量所有電鏡圖片薄膜的孔隙率，導出到Excel表格中，計算孔隙率平均值及標準差得：薄膜的孔隙率為45±4.11%。

2.透射電鏡觀察：

參見圖2和圖3，將制得的雞蛋膜復合納米銀薄膜用超聲粉碎儀粉碎，溶于去離子水中，吹打均勻形成懸液，取一滴懸液滴至炭包被的銅網上，采用透射電子顯微鏡觀察制得的雞蛋膜復合納米銀薄膜中納米銀的形態及大小。使用Image-J軟件，設置標尺為圖例標尺，固定選擇該標尺，測量所有納米銀顆粒直徑，導出到Excel表格中，計算納米銀大小分布圖，參見圖3，并求得平均值：納米銀的直徑為13.91nm。

本發明的有益效果是：與現有技術相比，本發明以雞蛋膜為生物支架，利用多巴胺的粘附和還原特性，納米銀的抗菌性，制備一種用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜，具有良好的抗菌性能，無明顯的生物毒性；制備方法成本低，耗時少，操作工藝簡單。

附圖說明

圖1是本發明一個實施例的雞蛋膜復合納米銀薄膜的掃描電子顯微鏡照片。

圖2是本發明一個實施例的雞蛋膜復合納米銀薄膜的透射電子顯微鏡照片。

圖3是本發明一個實施例的雞蛋膜復合納米銀薄膜的透射電子顯微鏡照片中納米銀的大小分布圖。

圖4是制備的雞蛋膜復合納米銀薄膜的細胞相容性實驗中的細胞活性柱狀圖。

圖5顯示制備的雞蛋膜復合納米銀薄膜的抗菌性能檢測實驗結果（a—無菌濾紙片、b—鹽酸處理后的雞蛋膜、c—多巴胺溶液處理的雞蛋膜、d—雞蛋膜復合納米銀薄膜）。

圖6顯示動物實驗分別在使用空白對照組、凡士林紗布、鹽酸處理后的雞蛋膜、多巴胺溶液處理后的雞蛋膜和雞蛋膜復合納米銀薄膜處理創面后第三天和第七天小鼠創面愈合的比較。

具體實施方式

實施例1：一種用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

（1）取新鮮雞蛋，輕輕敲碎后棄掉蛋清和蛋黃，將雞蛋殼置于去離子水中清洗，然后用鑷子小心分離雞蛋膜，再次用去離子水清洗后，將雞蛋膜剪成2cm×2cm大小；

（2）將步驟（1）制得的雞蛋膜置于鹽酸溶液中，室溫下浸泡3天，然后用去離子水清洗3遍，每遍5分鐘，所述鹽酸溶液的濃度為1mM，pH=3；

（3）將多巴胺溶入Tris—HCl溶液中，所述Tris—HCl溶液濃度為10mM，制得的多巴胺溶液濃度為2mg/ml，pH調節至8.5；

（4）將步驟（2）制得的雞蛋膜置于步驟（3）制得的多巴胺溶液中，室溫下浸泡16h，然后用去離子水清洗3遍，每遍5分鐘；

（5）將步驟（4）制得的雞蛋膜置于硝酸銀溶液中，所述硝酸銀（5）溶液的濃度為30nM，室溫下避光浸泡18h，然后用去離子水清洗3遍，每遍5分鐘，常溫下自然干燥，制得雞蛋膜復合納米銀薄膜。

實施例2：一種用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

（1）取新鮮雞蛋，輕輕敲碎后棄掉蛋清和蛋黃，將雞蛋殼置于去離子水中清洗，然后用鑷子小心分離雞蛋膜，再次用去離子水清洗后，將雞蛋膜剪成1cm×3cm大小；

（2）將步驟（1）制得的雞蛋膜置于鹽酸溶液中，室溫下浸泡1天，然后用去離子水清洗3遍，每遍5分鐘，所述鹽酸溶液的濃度為10mM，pH=1；

（3）將多巴胺溶入Tris—HCl溶液中，所述Tris—HCl溶液濃度為30mM，制得的多巴胺溶液濃度為2mg/ml，pH調節至9.0；

（4）將步驟（2）制得的雞蛋膜置于步驟（3）制得的多巴胺溶液中，室溫下浸泡6h，然后用去離子水清洗3遍，每遍5分鐘；

（5）將步驟（4）制得的雞蛋膜置于硝酸銀溶液中，所述硝酸銀（5）溶液的濃度為10nM，室溫下避光浸泡6h，然后用去離子水清洗3遍，每遍5分鐘，常溫下自然干燥，制得雞蛋膜復合納米銀薄膜。

實施例3：一種用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

（1）取新鮮雞蛋，輕輕敲碎后棄掉蛋清和蛋黃，將雞蛋殼置于去離子水中清洗，然后用鑷子小心分離雞蛋膜，再次用去離子水清洗后，將雞蛋膜剪成3cm×3cm大小；

（2）將步驟（1）制得的雞蛋膜置于鹽酸溶液中，室溫下浸泡4天，然后用去離子水清洗5遍，每遍3分鐘，所述鹽酸溶液的濃度為100mM，pH=3；

（3）將多巴胺溶入Tris—HCl溶液中，所述Tris—HCl溶液濃度為100mM，制得的多巴胺溶液濃度為4mg/ml，pH調節至9.5；

（4）將步驟（2）制得的雞蛋膜置于步驟（3）制得的多巴胺溶液中，室溫下浸泡20h，然后用去離子水清洗5遍，每遍3分鐘；

（5）將步驟（4）制得的雞蛋膜置于硝酸銀溶液中，所述硝酸銀（5）溶液的濃度為50nM，室溫下避光浸泡20h，然后用去離子水清洗5遍，每遍3分鐘，常溫下自然干燥，制得雞蛋膜復合納米銀薄膜。

實施例4：一種用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

（1）取新鮮雞蛋，輕輕敲碎后棄掉蛋清和蛋黃，將雞蛋殼置于去離子水中清洗，然后用鑷子小心分離雞蛋膜，再次用去離子水清洗后，將雞蛋膜剪成2cm×3cm大小；

（2）將步驟（1）制得的雞蛋膜置于鹽酸溶液中，室溫下浸泡2天，然后用去離子水清洗4遍，每遍4分鐘，所述鹽酸溶液的濃度為40mM，pH=2；

（3）將多巴胺溶入Tris—HCl溶液中，所述Tris—HCl溶液濃度為50mM，制得的多巴胺溶液濃度為3mg/ml，pH調節至8.5；

（4）將步驟（2）制得的雞蛋膜置于步驟（3）制得的多巴胺溶液中，室溫下浸泡14h，然后用去離子水清洗4遍，每遍4分鐘；

（5）將步驟（4）制得的雞蛋膜置于硝酸銀溶液中，所述硝酸銀（5）溶液的濃度為40nM，室溫下避光浸泡12h，然后用去離子水清洗4遍，每遍4分鐘，常溫下自然干燥，制得雞蛋膜復合納米銀薄膜。

實施例5：一種用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

（1）取新鮮雞蛋，輕輕敲碎后棄掉蛋清和蛋黃，將雞蛋殼置于去離子水中清洗，然后用鑷子小心分離雞蛋膜，再次用去離子水清洗后，將雞蛋膜剪成3cm×2cm大小；

（2）將步驟（1）制得的雞蛋膜置于鹽酸溶液中，室溫下浸泡3天，然后用去離子水清洗5遍，每遍4分鐘，所述鹽酸溶液的濃度為80mM，pH=3；

（3）將多巴胺溶入Tris—HCl溶液中，所述Tris—HCl溶液濃度為70mM，制得的多巴胺溶液濃度為4mg/ml，pH調節至9.5；

（4）將步驟（2）制得的雞蛋膜置于步驟（3）制得的多巴胺溶液中，室溫下浸泡10h，然后用去離子水清洗5遍，每遍4分鐘；

（5）將步驟（4）制得的雞蛋膜置于硝酸銀溶液中，所述硝酸銀（5）溶液的濃度為40nM，室溫下避光浸泡14h，然后用去離子水清洗5遍，每遍4分鐘，常溫下自然干燥，制得雞蛋膜復合納米銀薄膜。

實施例6：對制得的雞蛋膜復合納米銀薄膜進行細胞相容性實驗為檢驗制備的用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的細胞相容性，進行如下實驗：

（1）實驗分組：實驗組：雞蛋膜復合納米銀薄膜；對照組：鹽酸處理后的雞蛋膜和多巴胺處理的雞蛋膜；

（2）將由實施例1制得的實驗組樣本和對照組樣本分別用打孔器制成直徑為6mm的薄膜圓盤，浸泡于75%乙醇溶液中消毒后用磷酸鹽緩沖液漂洗3次；

（3）將無菌圓盤分別置于96孔板中，每組復種6孔；

（4）取對數生長期GFP小鼠成纖維細胞，每孔接種8×10³細胞至薄膜圓盤上，加入含10% 胎牛血清的DMEM培養基至200μL，24小時細胞貼壁生長后換液；

（5）培養后第3天, 取每組各3個孔的薄膜于熒光顯微鏡下觀察細胞粘附及生長形態；剩余3孔進行細胞增殖檢測實驗，棄去原培養基，每孔加入100μL新的培養基和10μL 的MTT試劑，37℃下孵育4小時，然后棄去培養基，加入100μl 二甲基亞砜以溶解薄膜上的紫色結晶，搖床上搖晃10分鐘后，利用酶標儀在570nm波長處檢測每孔的光密度，繪制柱狀圖，檢測雞蛋膜復合納米銀對細胞活性的影響。

結果：參見圖4，鏡下可見三組細胞均生長較好，呈典型的梭形展開，而細胞活性檢測顯示雞蛋膜復合納米銀與多巴胺處理的雞蛋膜組無明顯差異，提示納米銀的加入未引起明顯細胞毒性，安全性較好。多巴胺處理后雞蛋膜較未浸泡多巴胺的雞蛋膜明顯促進細胞生長，說明多巴胺具有良好的生物相容性。

實施例7：對制得的雞蛋膜復合納米銀薄膜的進行抗菌性能檢測實驗

為檢驗制備的用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜的抗菌性能，應用紙片擴散法進行以下實驗：

（1）實驗分組：實驗組：實施例1制得的雞蛋膜復合納米銀薄膜；對照組：無菌濾紙片鹽酸處理后的雞蛋膜，多巴胺溶液處理后的雞蛋膜；

（2）按實施例6中方法將各組薄膜制成無菌圓盤；

（3）將大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的細菌懸液稀釋為0.5個標準麥氏單位（106cfu/ml），再用無菌棉簽蘸取菌液分別均勻涂布于MH瓊脂培養皿上，每種菌株重復3個；

（4）分別將各組薄膜圓盤小心置于MH瓊脂培養皿上，并將培養皿放入37℃孵箱中；

（5）24小時后取出培養皿，拍照并記錄。

結果：參見圖5，在大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌培養皿中，雞蛋膜復合納米銀薄膜的周圍均出現了明顯的抑菌環，說明其對兩種細菌均具有良好的抗菌效果。

實施例8；對制得的雞蛋膜復合納米銀薄膜進行全層皮膚缺損創面修復實驗

（1）BALB/C小鼠（購自第三軍醫大學實驗動物中心）全層皮膚缺損創面模型的制備：實驗動物予以1%戊巴比妥鈉腹腔注射(100mg/kg，0.01ml/g)麻醉。小鼠固定于俯臥位，背部術區備皮后，常規75%乙醇消毒。用打孔器于背部兩側各造一直徑為4mm的全層皮膚缺損創面。取BALB/C小鼠35只，實驗組和對照組各7只小鼠，均按上述方法制備創面模型。

（2）實驗組：將實施例1制備的雞蛋膜復合納米銀薄膜樣本裁剪為6×6mm大小，無菌生理鹽水沖洗后，覆蓋于小鼠背部創面上，再用負壓吸引膜固定于背部皮膚；對照組：分別用凡士林紗布、鹽酸處理后雞蛋膜、多巴胺處理后雞蛋膜覆蓋創面，再用負壓吸引膜固定，而空白對照組只用負壓吸引膜固定。

（3）術后立即拍照記錄，并作為第0天的原始創面面積，然后于第3、7天打開各組小鼠創面檢查愈合情況，并拍照記錄。術后第7天拍照后，小鼠即采用斷頸法處死。

（4）利用Image Pro Plus 6.0對第3、7天各組創面照片進行分析，計算殘余創面面積（創緣所包圍的面積），并按下式計算創面愈合率：

創面愈合率=（原始創面面積-殘余創面面積）/原始創面面積。

結果：參見圖6，雞蛋膜復合納米銀薄膜組創面未見均未見紅腫及過敏現象，無滲出液、膿液及膿腫形成，術區組織未見充血、水腫及壞死。術后第3天，雞蛋膜復合納米銀薄膜組較其余各組創面愈合率高，且與空白對照組及凡士林紗布組相比有統計學差異；術后第7天，雞蛋膜復合納米銀薄膜組愈合率較其它四組均高，且具有統計學差異。該結果說明制得的用于人工皮膚的雞蛋膜復合納米銀薄膜能顯著促進創面愈合。