一種絞股藍皂苷及制備方法與其在制備抗炎藥物中的應用與流程

本發明屬于中藥領域，具體涉及一種絞股藍皂苷及制備方法與在制備抗炎藥物中的應用。

背景技術：

皂苷(saponins)因其發泡性特點而得名，是一類具有重要醫藥價值的配糖體化合物，根據水解后生成皂苷元的結構，分為三萜皂苷和甾體皂苷兩大類。皂苷廣泛存在于自然界，如大豆、苦瓜、大棗等常見食物，另外，皂苷也是一些本草著作中記載的具有“久服輕身不老”的中藥的主要有效成分，這些中藥如人參、三七、知母、遠志、甘草、薯蕷等因顯著的保健作用而被古人推崇為“上品藥”。

許多慢性疾病的發病機制都涉及炎癥，例如冠心病、癌癥、高血脂等。因此抑制前炎癥因子的生成可以作為預防或者治療一些慢性疾病的重要靶點。脂多糖(LPS)誘導的RAW264.7小鼠巨噬細胞是常見研究炎癥反應的模型。巨噬細胞在脂多糖LPS刺激下，可促使炎癥因子如一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌。

絞股藍(Gynostemma pentaphyllum Makino)又名七葉膽、五葉參，是葫蘆科絞股藍屬多年生草質藤木，在我國陜西、四川、湖南、廣西、云南等省均有分布，有“南方人參”的美譽，在日本被譽為“福音草”。早在20世紀70年代后期，日本學者已從該植物中分離出80多種皂甙，發現有4種絞股藍皂苷分別與人參皂苷Rb1、Rb3、Rd和F2的結構完全相同，并且絞股藍總皂苷含量是人參的3倍。現代藥理、毒理及臨床實驗證明：絞股藍主要有效成分為絞股藍皂苷，具有抗疲勞、抗衰老、抗誘變、提高機體免疫能力、調節心腦血管和改善神經系統等作用。絞股藍皂苷因其獨特的功效，可開發用于絞股藍茶制品、功能性口服液、保健酒、抗衰老化妝品、飼料添加劑等。但目前，絞股藍更多的是簡單加工為絞股藍茶，而對于其中有效成分絞股藍皂苷的提取、純化及加工利用程度還遠遠不夠，因此絞股藍皂苷的提取純化和藥理活性等方面的研究還有待進一步深入探討，全面加強絞股藍皂苷的生物利用，對于開發新藥、指導臨床用藥具有重要的意義。

技術實現要素：

為了克服現有技術的不足和缺點，本發明的首要目的在于提供一種絞股藍皂苷的制備方法。

本發明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的絞股藍皂苷。

本發明的再一目的在于提供上述絞股藍皂苷在制備抗炎藥物中的應用。

本發明的目的通過下述方案實現：

一種絞股藍皂苷的制備方法，包含如下步驟：

(1)將絞股藍(Gynostemma pentaphyllum Makino)粉碎，過篩，得絞股藍粗粉；

(2)采用乙醇溶液加熱回流提取絞股藍粗粉，然后將提取液離心，并將上清液濃縮，得到濃縮的絞股藍乙醇粗提物浸膏；

(3)將絞股藍乙醇粗提物浸膏用蒸餾水溶解，加入有機溶劑進行萃取，去除含有色素的有機層，然后向水層中加入氯仿或乙酸乙酯繼續進行萃取，去除有機層，得到水溶液；加入正丁醇進行萃取，收集正丁醇相，濃縮蒸干，得到絞股藍皂苷即絞股藍總皂苷。

步驟(3)中所述有機溶劑為石油醚或乙醚中一種以上；優選為石油醚。

步驟(3)中所述加入有機溶劑進行萃取的次數為3～5次，每次萃取的時間為30～60min；所述加入氯仿或乙酸乙酯繼續進行萃取的次數為3～5次，每次萃取的時間為30～60min；所述加入正丁醇進行萃取的次數為3～5次，每次萃取的時間為30～60min。

步驟(1)中所述粉碎過篩為50～60目篩；

步驟(2)中所述乙醇溶液的體積分數為70～85％；優選為75％。

步驟(2)中所述乙醇溶液與絞股藍粗粉的體積質量比為(10～20)mL:1g。

步驟(2)中所述加熱回流提取的溫度為90～100℃；所述加熱回流提取的次數為2～4次，每次加熱回流提取的時間為2～4h。

步驟(2)中所述離心的轉速為3000～5000r/min；所述離心的時間為8～12min。

步驟(2)和(3)中所述濃縮為減壓濃縮，濃縮的溫度為40～60℃。

步驟(2)和(3)中所述減壓濃縮的溫度優選為50℃。

步驟(3)所述絞股藍乙醇粗提物浸膏中絞股藍粗粉與蒸餾水質量體積比為為200g：(1～3)L。

步驟(3)中萃取所用的有機溶劑、氯仿或乙酸乙酯以及正丁醇總的體積用量與溶解浸膏的蒸餾水的體積用量比為(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)。

一種絞股藍皂苷(GPMS)，通過上述制備方法制備得到。

所述絞股藍皂苷(GPMS)在制備抗炎藥物中的應用。

所述的絞股藍皂苷(GPMS)可作為新型的抗炎藥物，應用于炎癥的治療。

一種抗炎藥物，含有絞股藍皂苷(GPMS)；

本發明的原理：植物來源的皂苷能通過調節巨噬細胞的免疫功能體現出各種有益的藥理作用。本發明發現和確證植物皂苷具有顯著的抗炎活性，且植物皂苷的使用劑量低，在同樣劑量下的毒副作用也較低。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：

(1)本發明首次發現絞股藍皂苷(GPMS)在體外能顯著抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞NO的釋放。

(2)本發明首次發現絞股藍皂苷(GPMS)在體外能顯著抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β、和COX-2mRNA的表達。

(3)本發明首次發現絞股藍皂苷(GPMS)在體外能顯著抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞p-JNK、p-p38、p-p65和COX-2蛋白的表達。

(4)絞股藍皂苷(GPMS)的用藥劑量比較低，而且在有效用藥劑量范圍內毒性較低。

附圖說明

圖1是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對RAW264.7巨噬細胞的毒性作用圖；

圖2是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞釋放NO的影響圖；

圖3是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞形態的影響圖；

圖4是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響圖，其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖5是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞IL-6mRNA表達的影響圖，其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖6是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞TNF-αmRNA表達的影響圖，其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖7是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞IL-1βmRNA表達的影響圖，其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖8是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞COX-2mRNA表達的影響圖，其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖9是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞磷酸化JNK(p-JNK)蛋白水平影響的結果分析圖，其中圖A為p-JNK蛋白表達曝光圖，圖B為p-JNK蛋白相對表達量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖10是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞磷酸化P38(p-P38)蛋白水平影響的結果分析圖，其中圖A為p-P38蛋白表達曝光圖，圖B為p-P38蛋白相對表達量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖11是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞磷酸化P65(p-P65)蛋白水平影響的結果分析圖，其中圖A為p-P65蛋白表達曝光圖，圖B為p-P65蛋白相對表達量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖12是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞COX-2蛋白水平影響的結果分析圖，其中圖A為COX-2蛋白表達曝光圖，圖B為COX-2蛋白相對表達量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

實施例中，小鼠巨噬細胞RAW 264.7購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心；代代花萼購自廣州清平藥材市場。

實施例1從絞股藍中制備得到絞股藍皂苷(GPMS)

(1)將絞股藍(Gynostemma pentaphyllum Makino)用粉碎機粉碎后，過60目篩，得絞股藍粗粉備用；

(2)稱取絞股藍粗粉200g，于5000mL圓底燒瓶中，加入2000mL的體積分數為75％乙醇溶液，充分搖勻后，100℃保持微沸提取3h，停止加熱，過濾，加熱回流提取3次，合并濾液，采用離心機4000rpm，離心10min，將所得上清液用旋轉蒸發儀在50℃的條件下減壓濃縮，得到乙醇粗提物浸膏；

(3)將絞股藍乙醇粗提物浸膏用1.5L蒸餾水溶解，加入0.5L的石油醚溶劑，充分震蕩混勻，靜置40min，待兩相溶劑完全分層后，吸出上層的石油醚相，重復萃取四次(0.5L×3次)，棄去石油醚層，除去一些色素；在石油醚萃取后的溶液中即去除石油醚層的溶液中加入0.5L的乙酸乙酯溶劑，充分震蕩混勻，靜置40min，待兩相溶劑完全分層后，吸出上層的乙酸乙酯相，重復萃取四次(0.5L×3次)，棄去乙酸乙酯層，除去黃酮、香豆素等中等極性的物質；在乙酸乙酯萃取后的溶液中加入0.5L的正丁醇溶劑，充分震蕩混勻，靜置40min，待兩相溶劑完全分層后，吸出上層的正丁醇相，重復萃取四次(0.5L×3次)，合并所得正丁醇相萃取液，50℃減壓濃縮蒸干，得到絞股藍總皂苷即絞股藍皂苷(GPMS)，回收正丁醇溶液。

實施例2從絞股藍中制備得到絞股藍皂苷(GPMS)

(1)將絞股藍(Gynostemma pentaphyllum Makino)用粉碎機粉碎后，過60目篩，得絞股藍粗粉備用；

(2)稱取絞股藍粗粉200g，于5000mL圓底燒瓶中，加入2000mL的體積分數為70％乙醇溶液，充分搖勻后，100℃保持微沸提取2h，停止加熱，過濾，加熱回流提取3次，合并濾液，采用離心機3000rpm，離心8min，將所得上清液用旋轉蒸發儀在55℃的條件下減壓濃縮，得到乙醇粗提物浸膏；

(3)將絞股藍乙醇粗提物浸膏用1.8L蒸餾水溶解，加入0.6L的石油醚溶劑，充分震蕩混勻，靜置30min，待兩相溶劑完全分層后，吸出上層的石油醚相，重復萃取三次(0.6L×3次)，棄去石油醚層，除去一些色素；在石油醚萃取后的溶液中加入0.6L的乙酸乙酯溶劑，充分震蕩混勻，靜置30min，待兩相溶劑完全分層后，吸出上層的乙酸乙酯相，重復萃取三次(0.6L×3次)，棄去乙酸乙酯層，除去黃酮、香豆素等中等極性的物質；在乙酸乙酯萃取后的溶液中加入0.6L的正丁醇溶劑，充分震蕩混勻，靜置30min，待兩相溶劑完全分層后，吸出上層的正丁醇相，重復萃取三次(0.6L×3次)，合并所得正丁醇相萃取液，55℃減壓濃縮蒸干得到絞股藍總皂苷即絞股藍皂苷(GPMS)，回收正丁醇溶液。

實施例3從絞股藍中制備得到絞股藍皂苷(GPMS)

(1)將絞股藍(Gynostemma pentaphyllum Makino)用粉碎機粉碎后，過60目篩，得絞股藍粗粉備用；

(2)稱取絞股藍粗粉200g，于5000mL圓底燒瓶中，加入3000mL的體積分數為80％乙醇溶液，充分搖勻后，95℃保持微沸提取4h，停止加熱，過濾，加熱回流提取2次，合并濾液，采用離心機5000rpm，離心10min，將所得上清液用旋轉蒸發儀在60℃的條件下減壓濃縮，得到乙醇粗提物浸膏；

(3)將絞股藍乙醇粗提物浸膏用3L蒸餾水溶解，加入1L的石油醚溶劑，充分震蕩混勻，靜置60min，待兩相溶劑完全分層后，吸出上層的石油醚相，重復萃取三次(1L×3次)，棄去石油醚層，除去一些色素。在石油醚萃取后的溶液中加入1L的乙酸乙酯溶劑，充分震蕩混勻，靜置60min，待兩相溶劑完全分層后，吸出上層的乙酸乙酯相，重復萃取三次(1L×3次)，棄去乙酸乙酯層，除去黃酮、香豆素等中等極性的物質。在乙酸乙酯萃取后的溶液中加入1L的正丁醇溶劑，充分震蕩混勻，靜置60min，待兩相溶劑完全分層后，吸出上層的正丁醇相，重復萃取三次(1L×3次)，合并所得正丁醇相萃取液，60℃減壓濃縮蒸干得到絞股藍總皂即絞股藍皂苷(GPMS)苷，回收正丁醇溶液。

實施例4MTT法檢測絞股藍皂苷(GPMS)對RAW264.7細胞毒性的影響

分別取生長對數期的小鼠巨噬細胞RAW264.7，1000rpm離心5min，棄去上清液，用含質量分數為10％胎牛血清的DMEM培養基調整細胞數為3×10⁵/mL，100μL接種于96孔培養板中，置于5％CO₂培養箱中，37℃培養24h后，棄去上清液，各組分別加入含有GPMS(實施例1制得)的DMEM培養基(GPMS的終濃度分別為31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL和500μg/mL)。在37℃、5％CO₂培養箱中培養24h，棄去上清液，PBS清洗兩次，每孔加入200μL不含血清的DMEM基礎培養基和20μL噻唑藍(MTT)，放入培養箱中繼續孵育4h，棄上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，避光放置于微量振蕩器均勻震蕩10min，用酶標儀測量在490nm波長下的OD值，計算細胞增殖抑制率。圖1是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對RAW264.7巨噬細胞的毒性作用圖。

在GPMS濃度為31.25～500μg/mL范圍內，絞股藍皂苷(GPMS)作用于RAW264.7細胞24h，對RAW264.7細胞的生長均沒有毒性作用(圖1)。因此后續的實驗中，絞股藍皂苷(GPMS)的濃度設定為500、250、125、62.5、31.25、16.13μg/mL。

實施例5Griess法檢測絞股藍皂苷(GPMS)對RAW264.7細胞釋放NO的影響

常規培養細胞，取對數生長期的RAW264.7細胞，吹打細胞成單細胞懸液，顯微鏡下用血細胞計數板計數后，1000rpm，離心5min去上清，培養基重懸并調整細胞濃度，按20萬個/孔的細胞密度接種于24孔培養板，置于37℃，5％CO₂培養箱培養，貼壁24h，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設3個復孔：Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+地塞米松(DXM，終濃度為50μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+GPMS(實施例1制備得到的絞股藍皂苷，終濃度為16.13、31.25、62.5、125、250和500μg/mL)組，對照組添加同體積的培養基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養箱，繼續培養24h。分別取各孔細胞上清100μL，相應加入另一新的96孔板中。每孔加50μL Griess試劑A，置于37℃培養箱中反應10min，每孔再加50μL Griess試劑B，置于37℃培養箱中反應10min，立即置板于多標記微孔板檢測儀上，在550nm波長下檢測各孔吸光度值。圖2是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞釋放NO的影響圖。

GPMS能夠抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞NO的釋放，并呈現濃度依賴性(圖2)。當GPMS的濃度為500μg/mL時，抑制效果優于50μg/mL的地塞米松(P<0.01)。

實施例6絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7細胞影響的電子顯微鏡觀察

常規培養細胞，取對數生長期的RAW264.7細胞，吹打細胞成單細胞懸液，顯微鏡下用血細胞計數板計數后，1000rpm，離心5min去上清，培養基重懸并調整細胞濃度，按20萬個/孔的細胞密度接種于24孔培養板，置于37℃，5％CO₂培養箱培養，貼壁24h，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設3個復孔：Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+地塞米松(DXM，終濃度為50μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+GPMS(實施例1制備得到的絞股藍皂苷，終濃度為62.5、125、250和500μg/mL)組，對照組添加同體積的DMEM基礎培養基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養箱，繼續培養24h。然后取出細胞在電子顯微鏡下拍照。圖3是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞形態的影響圖。

RAW264.7細胞經LPS誘導后，隨著作用時間的改變，細胞形態發生改變，control組細胞呈圓形，邊界清晰，貼壁良好，給予LPS誘導后，隨著時間的延長，RAW264.7細胞形態學的改變逐漸明顯，出現體積變大，呈不規則圓形、橢圓形、伸出偽足，邊界不規則，部分細胞內呈明顯泡沫化(圖3)。經不同濃度的絞股藍皂苷GPMS治療后，細胞形態改變緩慢，趨于正常(圖3)。

實施例7絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7細胞iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β和COX-2mRNA表達的影響

常規培養細胞，取對生長數期的RAW264.7細胞，按100萬/孔細胞數接種于6孔板，孵育24h后，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設3個復孔。Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+地塞米松(DXM，終濃度為50μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+GPMS(實施例1制備得到的絞股藍皂苷，終濃度為62.5、125、250和500μg/mL)，對照組添加同體積的培養基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養箱，繼續培養12h。作用12h后，吸棄細胞上清，PBS洗2次。每孔加入Trizol 1mL，靜置5min，吸管吹打至液體無粘稠物，吸取細胞裂解液轉入EP管，每管加入0.2mL氯仿，蓋上EP管蓋，手持用力上下震蕩10s，室溫靜置5min，4℃以12,000rpm離心15min，離心后轉移上層水相至另一EP管中，加入0.5mL異丙醇，室溫靜置10min，4℃離心機以12,000rpm離心10min，小心吸棄去上清，用冷體積分數75％的乙醇1mL清洗2次，分別4℃條件下以7,500rpm離心5min，小心吸棄上清，空氣吹干，約15min，加入0～50μL RNase-free純水，60℃加熱10min溶解沉淀。測定mRNA的純度和濃度。并用RevertAid First Strand cnthesis Kit(Thermo公司)反轉錄試劑盒，20μL反應體系，對RNA進行逆轉錄。采用DyNAmo Flash SYRB Green qPCR Kit(Thermo公司)試劑盒，ABI實時熒光定量PCR儀(Rrism 7500，Applied Biosystems，Foster City，CA,USA)對mRNA進行擴增，擴增后用ABI PRISM 7500SDS軟件中Relative Quantification(ddCt)Study法進行自動分析以獲得目的基因的相對表達量。相關基因mRNA引物序列為iNOS(forward,5’-CGG CAA ACA TGA CTT CAG GC-3’,reverse,5’-GCA CAT CAA AGC GGC CAT AG-3’)，IL-6(forward,5’-GTA CTC CAG AAG ACC AGA GG-3’,reverse,5’-TGC TGG TGA CAA CCA CGG CC-3’)，TNF-α(forward,5’-GGG GAT TAT GGC TCA GGG TC-3’,reverse,5’-CGA GGC TCC AGT GAA TTC GG-3’)，IL-1β(forward,5’-CCA TGG AAT CCG TGT CTT CCT-3’,reverse,5’-GTC TTG GCC GAG GAC TAA GG-3’)，COX-2(forward,5’-CAG CAA ATC CTT GCT GTT CC-3’,reverse,5’-TGG GCA AAG AAT GCA AAC ATC-3’)和GAPDH(forward,5’-CAC TCA CGG CAA ATT CAA CGG CAC-3’,reverse,5’-GAC TCC ACG ACA TAC TCA GCA-3’)。

圖4是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響圖，其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。圖5是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞IL-6mRNA表達的影響圖，其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。圖6是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞TNF-αmRNA表達的影響圖，其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。圖7是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞IL-1βmRNA表達的影響圖，其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。圖8是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞COX-2mRNA表達的影響圖，其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。

與control組相比，LPS組分泌的iNOS、IL-6、IL-1β和COX-2顯著增加(P＜0.01)，表明LPS誘導RAW264.7巨噬細胞釋放NO的炎癥模型成立。絞股藍皂苷(GPMS)可以顯著抑制iNOS mRNA(圖4)、IL-6mRNA(圖5)和COX-2mRNA(圖8)的分泌(P＜0.05)，且呈濃度依賴性。同時絞股藍皂苷(GPMS)也對IL-1βmRNA有一定的抑制作用(圖7)，但對TNF-αmRNA的分泌并無明顯的抑制效果(圖6)。

實施例8絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7細胞相關蛋白水平的影響

常規培養細胞，取對生長數期的RAW264.7細胞，按100萬/孔細胞數接種于6孔板，孵育24h后，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設3個復孔。Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+地塞米松(DXM，終濃度為50μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+GPMS(實施例1制備得到的絞股藍皂苷，終濃度為125、250和500μg/mL)組，對照組添加同體積的培養基。其中，LPS+GPMS組采用GPMS預先刺激2h后，再加脂多糖(LPS+地塞米松組同樣處理)，置于37℃，5％CO₂培養箱，繼續培養12h。作用12h后，吸棄細胞上清，并且用預冷的PBS清洗兩次，收集細胞至1.5mL離心管中，加入60μL的PIPA裂解液(含磷酸酶抑制劑(PhosSTOP，Roche)和蛋白酶抑制劑(cOmplete ULTRA Tablets，Mini，EDTA-free，EASYpack，Roche))，用1mL的注射器吸取裂解液反復吹打細胞至充分混勻，于冰上放置30min，每隔10min于渦旋振蕩器上振蕩30s。以12000rpm離心15min，將上清轉移至新的1.5mLEP管，置于冰上待測定蛋白濃度。采用BCA法檢測蛋白濃度(按照BCA Protein Assay Kit說明書進行)：先將濃度為2mg/mL的BSA溶液予超純去離子水稀釋為系列質量濃度(0μg/mL、25μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL)的標準品溶液，再根據需要配置一定量的工作液(BCA Solution:4％(體積分數)Cupric Sulfate＝200:4)。取一塊無底物的96孔板，每孔分別加入已稀釋好的系列標準品溶液25μL，以及需要檢測的蛋白溶液25μL(已稀釋5倍)，每組均設置復孔。同時加入200μL/孔工作液，輕輕震蕩混勻，置于37℃孵育30min后，取出，于多標記微孔板檢測儀570nm處檢測OD值。根據標準品蛋白溶液所測OD值繪制標準曲線，計算出待測蛋白溶液濃度。根據BCA法測得的蛋白濃度，計算出40μg總蛋白所需蛋白體積，同時加5μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，再補充相應體積的超純去離子水至總體積為25μL，混勻，充分離心，使液體聚集在底部，100℃加熱變性10min，離心，置于冰上備用。選擇10％(體積分數)分離膠和5％(體積分數)濃縮膠，將已變性好的蛋白樣品依次加入各泳道，樣品兩側的泳道分別加入5μL Marker。電泳槽中加入足夠量的TGS緩沖液，電泳條件為：100V，約150min，直至溴酚藍指示劑跑至距膠下緣約0.5cm時，停止電泳。然后在冰浴中以100V的電壓轉膜100min。用含5％(質量分數)脫脂奶粉的TBST封閉，緩慢搖蕩1h。一抗抗體分別為：GAPDH(14c10)Rabbit mAb、p-JNK、p-P38、p-P65和COX-2(均購自CST公司)，二抗抗體為山羊抗兔(HRP標記)，購自聚研生物科技有限公司。按照說明書推薦的稀釋比例(1:1000)，配制一抗，室溫下輕搖孵育4h或4℃靜置過夜。一抗孵育結束后，更換二抗，HRP標記的二抗按相應比例稀釋(1:2000)，室溫輕搖1h。二抗結束后，加入發光液(購自BioFuture公司)并利用凝膠成像儀蛋白條帶顯影。

圖9是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞磷酸化JNK(p-JNK)蛋白水平影響的結果分析圖，其中圖A為p-JNK蛋白表達曝光圖，圖B為p-JNK蛋白相對表達量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。圖10是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞磷酸化P38(p-P38)蛋白水平影響的結果分析圖，其中圖A為p-P38蛋白表達曝光圖，圖B為p-P38蛋白相對表達量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。圖11是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞磷酸化P65(p-P65)蛋白水平影響的結果分析圖，其中圖A為p-P65蛋白表達曝光圖，圖B為p-P65蛋白相對表達量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。圖12是實施例1制備得到的絞股藍皂苷(GPMS)對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞COX-2蛋白水平影響的結果分析圖，其中圖A為COX-2蛋白表達曝光圖，圖B為COX-2蛋白相對表達量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。

正常組RAW264.7巨噬細胞內磷酸化的JNK、P38、P65和COX-2蛋白表達較低，當1μg/mL的LPS作用細胞12h，細胞內磷酸化的JNK、P38、P65和COX-2蛋白表達顯著上調(P＜0.01)，從而激活MAPK和NF-κB信號通路(圖9～12)。絞股藍皂苷GPMS可以濃度依賴性的顯著下調p-P38(圖10)、p-P65(圖11)和COX-2(圖12)蛋白表達，同時絞股藍皂苷GPMS也可顯著降低p-JNK(圖9)蛋白表達。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學

<120> 一種絞股藍皂苷及制備方法與其在制備抗炎藥物中的應用

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> iNOS的forward

<400> 1

cggcaaacat gacttcaggc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> iNOS的 reverse

<400> 2

gcacatcaaa gcggccatag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6的forward

<400> 3

gtactccaga agaccagagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6的reverse

<400> 4

tgctggtgac aaccacggcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TNF-α的forward

<400> 5

ggggattatg gctcagggtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TNF-α的reverse

<400> 6

cgaggctcca gtgaattcgg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-1β的forward

<400> 7

ccatggaatc cgtgtcttcc t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-1β的reverse

<400> 8

gtcttggccg aggactaagg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> COX-2的forward

<400> 9

cagcaaatcc ttgctgttcc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> COX-2的reverse

<400> 10

tgggcaaaga atgcaaacat c 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH的forward

<400> 11

cactcacggc aaattcaacg gcac 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH的reverse

<400> 12

gactccacga catactcagc a 21