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增強肝癌細胞對CIK細胞殺傷敏感性的化合物及其制劑的制作方法

文檔序號:11713739閱讀:333來源:國知局
本發明屬于免疫治療領域,涉及cik細胞,具體涉及一種增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性的化合物及其制劑。
背景技術
:原發性肝癌(以下簡稱肝癌)是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一,每年大約有63萬的新發病例,而且近年來發病率有上升趨勢。肝癌患者的病程短,臨床上較難早期發現,確診時往往病情已進入中、晚期,病死率高。目前肝癌的治療主要是以手術切除、肝移植、局部消融、化學治療栓塞及其他局部區域治療、分子靶向治療等,但這些方法的治療效果并不理想,因為肝癌患者體內天然免疫、特異性免疫功能低下,根治性手術切除率低,手術后復發率高,放射、化學治療療效差,易發生肝內播散及肝外轉移,因此急需尋找新的有效方法來治療肝癌。生物治療已經成為腫瘤綜合治療中的第四種模式,越來越受到重視。目前用于腫瘤生物治療的免疫活性細胞主要有腫瘤浸潤性淋巴細胞(til)、樹突狀細胞(dc)以及細胞因子誘導的殺傷細胞(cik)等。cik細胞是一種新型的免疫活性細胞,其主要效應細胞的表面標志為cd3+cd56+,與其他過繼性免疫治療細胞相比,具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等優點。研究表明,過繼細胞免疫治療對抑制肝癌的復發和轉移、提高患者治愈率、改善患者生活質量、延長生存期都具有重要作用。如何用較少的cik細胞就發揮較優的免疫治療效果是科研工作者的一個重要研究方向。技術實現要素:本發明的目的在于提供一種增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性的化合物及其制劑,以使用較少的cik細胞就發揮較優的免疫治療效果。實現本發明上述目的技術方案如下:一種吡啶并咪唑類有機化合物在制備增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性的藥物中的應用,該吡啶并咪唑類有機化合物具有如下通式結構:其中,r2為-och2ch3或-oh;r1為-ch2-或-ch(ch3)2-或-ch2ch2ch2-。優選地,吡啶并咪唑類有機化合物選自下列化合物:一種用于增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性的藥物制劑,包括上述吡啶并咪唑類有機化合物,還包括藥學上可以接受的載體或賦形劑,制成藥學上可以接受的劑型。優選地,所述藥學上可以接受的載體或賦形劑包括一種或多種固體、半固體或液體輔料。優選地,所述藥學上可以接受的劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、丸劑、散劑、膏劑、口服液體制劑。本發明的突出優點:本發明證明吡啶并咪唑類化合物可以有效增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性,可以制備成藥學上可以接受的藥物制劑,以實現使用少量的cik細胞就發揮較優的免疫治療效果。附圖說明圖1為各組cik細胞對hepg2的殺傷率比較。具體實施方式下面就結合實施例具體介紹本發明的實質性內容,由于篇幅原因,實驗過程的描述無法做到非常詳細,凡是實驗中未詳細描述的部分均為本領域技術人員熟知的常規操作。一、實驗材料編號cm1-6的吡啶并咪唑類有機化合物均為已知化合物,由本公司合成人員參照文獻和有機合成常規方法合成,并經質譜和核磁確證。人肝癌細胞系hepg2為本公司長期保存。重組人干擾素rhifn-γ、重組人白細胞介素rhil-2、cd3鼠抗人單克隆抗體、cik細胞分離液、pbs、無血清培養基md-cm-stmn、rpmi1640培養基、胎牛血清fbs、mtt、dmso、胰酶均購自南京建成生物。二、實驗方法1、外周血單個核細胞制備無菌抽取健康人外周血約50ml,肝素抗凝(肝素15iu/ml),用等體積pbs稀釋外周血。按1:1的體積比緩慢加入到含有細胞分離液的50ml離心管中,2000r/min離心20min。取中間環狀乳白色單個核細胞層,移入50ml離心管中,加入適量pbs,1800r/min離心8min,棄上清,洗滌2次,細胞計數。2、cik細胞誘導培養用含有5%fbs的md-cm-stmn細胞培養基調整單個核細胞密度為1×106個/ml,接種20ml于培養瓶中,細胞總數為2×107,當天(第0天)加入rhil-21000u/ml、rhifn-γ1000u/ml、cd3鼠抗人單克隆抗體5mg/l,放置37℃,5%co2培養箱中開始培養。第3天開始補加md-cm-stmn細胞培養基,同時補充cd3鼠抗人單克隆抗體、rhifn-γ、rhil-2,用量同前,此后每3d添加新鮮培養基,補加rhifn-γ,用量相同,rhil-2用量減半為500u/ml。3、cik細胞增殖測定臺盼藍染色方法,用細胞計數板分別于培養第0、5、8、13、20天對細胞進行計數,重復3次取平均值。4、腫瘤細胞系的培養將hepg2細胞接種于培養瓶中,加入含有10%fbs的rpmi1640,貼壁細胞用0.25%的胰酶消化。取對數生長期的細胞,接種于96孔板,進行體外殺傷實驗。5、mtt法測定cm1-6化合物對hepg2細胞的細胞毒作用取對數生長期hepg2細胞,調整細胞懸液密度為5×103個/ml,接種于96孔板,每孔200μl。待細胞貼壁后換液,給藥組分別加入2μm化合物cm1-6,對照組加入培養液,每組均設3個平行孔,放置在37℃、5%co2培養箱中作用48h后,各給藥組及對照組每孔均分別加入20μlmtt(5g/l),繼續放置在37℃、5%co2培養箱中培養4h,棄上清,每孔加入200μldmso,37℃下搖床振蕩10min,酶標儀測定490nm處吸光度(a)值。6、mtt法測定cik對hepg2細胞殺傷作用將培養至第13天的cik細胞作為效應細胞,進行體外殺傷實驗。調整hepg2細胞濃度5×103個/ml,每孔100μl,分為cm1增敏組、cm2增敏組、cm3增敏組、cm4增敏組、cm5增敏組、cm6增敏組和常規組,cm1-6增敏組分別添加2μm化合物cm1-6,常規組正常培養,放置在37℃、5%co2培養箱中培養至細胞貼壁后換液,按效靶比10:1將效應細胞加入培養孔中,同時另設單獨靶細胞(靶細胞+培養液)和單獨效應細胞(效應細胞+培養液)為陰性對照,放置在37℃、5%co2培養箱中作用48h后,加入mtt(5g/l),20μl/孔,繼續放置在37℃、5%co2培養箱中培養4h,2000r/min離心5min,翻板棄上清,加入dmso150μl/孔,震蕩,待沉淀溶解,放于酶標儀中,490nm測光密度(od)值,按如下公式計算殺傷活性:殺傷率(%)={1-[(實驗組od值-單獨效應細胞od值)/單獨靶細胞od值]}×100%。7、統計學方法采用spss19.0統計軟件分析,數據以均數±標準差表示,p<0.05具有統計學意義。三、實驗結果1、cik細胞增殖cik細胞在培養第5天細胞增殖速度加快,第5-13天為快速增殖時間段,在第20天細胞增殖達到原種植量的118倍,在第20天細胞增殖達到原種植量的176倍。2、化合物cm1-6對hepg2細胞的細胞毒作用化合物cm1-6給藥組與對照組的吸光度(a)值無顯著差異,證明2μm化合物cm1-6對hepg2細胞無明顯細胞毒作用。結果見表1。表1化合物cm1-6給藥組與對照組的吸光度值的比值cm1cm2cm3cm4cm5cm6a給藥/a對照1.020.980.980.991.011.013、化合物cm1-6增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性從表2和圖1可以看出,各增敏組cik細胞對hepg2細胞的殺傷率均顯著高于常規組。已知2μm化合物cm1-6對hepg2細胞無明顯細胞毒作用,各增敏組cik細胞對hepg2細胞殺傷率的提高只能歸結于化合物cm1-6提高了hepg2細胞對cik細胞的殺傷敏感性,使用化合物cm1-6對靶細胞hepg2細胞增敏后,效靶比不變的情況下,cik細胞對hepg2細胞的殺傷力顯著提高。表2各組cik細胞對hepg2細胞的殺傷率(效靶比10:1)本發明證明吡啶并咪唑類化合物可以有效增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性,可以制備成藥學上可以接受的藥物制劑,以實現使用少量的cik細胞就發揮較優的免疫治療效果。上述實施例是對本發明實質性內容的體現,用于更好地解釋本發明,但本領域技術人員應當知曉,不應將本發明的保護范圍局限于上述具體的實施例。當前第1頁12
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