本發明屬于免疫治療領域，涉及cik細胞，具體涉及一種增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性的化合物及其制劑。
背景技術：
：原發性肝癌(以下簡稱肝癌)是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，每年大約有63萬的新發病例，而且近年來發病率有上升趨勢。肝癌患者的病程短，臨床上較難早期發現，確診時往往病情已進入中、晚期，病死率高。目前肝癌的治療主要是以手術切除、肝移植、局部消融、化學治療栓塞及其他局部區域治療、分子靶向治療等，但這些方法的治療效果并不理想，因為肝癌患者體內天然免疫、特異性免疫功能低下，根治性手術切除率低，手術后復發率高，放射、化學治療療效差，易發生肝內播散及肝外轉移，因此急需尋找新的有效方法來治療肝癌。生物治療已經成為腫瘤綜合治療中的第四種模式，越來越受到重視。目前用于腫瘤生物治療的免疫活性細胞主要有腫瘤浸潤性淋巴細胞(til)、樹突狀細胞(dc)以及細胞因子誘導的殺傷細胞(cik)等。cik細胞是一種新型的免疫活性細胞，其主要效應細胞的表面標志為cd3+cd56+，與其他過繼性免疫治療細胞相比，具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等優點。研究表明，過繼細胞免疫治療對抑制肝癌的復發和轉移、提高患者治愈率、改善患者生活質量、延長生存期都具有重要作用。如何用較少的cik細胞就發揮較優的免疫治療效果是科研工作者的一個重要研究方向。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性的化合物及其制劑，以使用較少的cik細胞就發揮較優的免疫治療效果。實現本發明上述目的技術方案如下：一種吡啶并咪唑類有機化合物在制備增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性的藥物中的應用，該吡啶并咪唑類有機化合物具有如下通式結構：其中，r2為-och2ch3或-oh；r1為-ch2-或-ch(ch3)2-或-ch2ch2ch2-。優選地，吡啶并咪唑類有機化合物選自下列化合物：一種用于增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性的藥物制劑，包括上述吡啶并咪唑類有機化合物，還包括藥學上可以接受的載體或賦形劑，制成藥學上可以接受的劑型。優選地，所述藥學上可以接受的載體或賦形劑包括一種或多種固體、半固體或液體輔料。優選地，所述藥學上可以接受的劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、丸劑、散劑、膏劑、口服液體制劑。本發明的突出優點：本發明證明吡啶并咪唑類化合物可以有效增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性，可以制備成藥學上可以接受的藥物制劑，以實現使用少量的cik細胞就發揮較優的免疫治療效果。附圖說明圖1為各組cik細胞對hepg2的殺傷率比較。具體實施方式下面就結合實施例具體介紹本發明的實質性內容，由于篇幅原因，實驗過程的描述無法做到非常詳細，凡是實驗中未詳細描述的部分均為本領域技術人員熟知的常規操作。一、實驗材料編號cm1-6的吡啶并咪唑類有機化合物均為已知化合物，由本公司合成人員參照文獻和有機合成常規方法合成，并經質譜和核磁確證。人肝癌細胞系hepg2為本公司長期保存。重組人干擾素rhifn-γ、重組人白細胞介素rhil-2、cd3鼠抗人單克隆抗體、cik細胞分離液、pbs、無血清培養基md-cm-stmn、rpmi1640培養基、胎牛血清fbs、mtt、dmso、胰酶均購自南京建成生物。二、實驗方法1、外周血單個核細胞制備無菌抽取健康人外周血約50ml，肝素抗凝(肝素15iu/ml)，用等體積pbs稀釋外周血。按1：1的體積比緩慢加入到含有細胞分離液的50ml離心管中，2000r/min離心20min。取中間環狀乳白色單個核細胞層，移入50ml離心管中，加入適量pbs，1800r/min離心8min，棄上清，洗滌2次，細胞計數。2、cik細胞誘導培養用含有5％fbs的md-cm-stmn細胞培養基調整單個核細胞密度為1×106個/ml，接種20ml于培養瓶中，細胞總數為2×107，當天(第0天)加入rhil-21000u/ml、rhifn-γ1000u/ml、cd3鼠抗人單克隆抗體5mg/l，放置37℃，5％co2培養箱中開始培養。第3天開始補加md-cm-stmn細胞培養基，同時補充cd3鼠抗人單克隆抗體、rhifn-γ、rhil-2，用量同前，此后每3d添加新鮮培養基，補加rhifn-γ，用量相同，rhil-2用量減半為500u/ml。3、cik細胞增殖測定臺盼藍染色方法，用細胞計數板分別于培養第0、5、8、13、20天對細胞進行計數，重復3次取平均值。4、腫瘤細胞系的培養將hepg2細胞接種于培養瓶中，加入含有10％fbs的rpmi1640，貼壁細胞用0.25％的胰酶消化。取對數生長期的細胞，接種于96孔板，進行體外殺傷實驗。5、mtt法測定cm1-6化合物對hepg2細胞的細胞毒作用取對數生長期hepg2細胞，調整細胞懸液密度為5×103個/ml，接種于96孔板，每孔200μl。待細胞貼壁后換液，給藥組分別加入2μm化合物cm1-6，對照組加入培養液，每組均設3個平行孔，放置在37℃、5％co2培養箱中作用48h后，各給藥組及對照組每孔均分別加入20μlmtt(5g/l)，繼續放置在37℃、5％co2培養箱中培養4h，棄上清，每孔加入200μldmso，37℃下搖床振蕩10min，酶標儀測定490nm處吸光度(a)值。6、mtt法測定cik對hepg2細胞殺傷作用將培養至第13天的cik細胞作為效應細胞，進行體外殺傷實驗。調整hepg2細胞濃度5×103個/ml，每孔100μl，分為cm1增敏組、cm2增敏組、cm3增敏組、cm4增敏組、cm5增敏組、cm6增敏組和常規組，cm1-6增敏組分別添加2μm化合物cm1-6，常規組正常培養，放置在37℃、5％co2培養箱中培養至細胞貼壁后換液，按效靶比10：1將效應細胞加入培養孔中，同時另設單獨靶細胞(靶細胞+培養液)和單獨效應細胞(效應細胞+培養液)為陰性對照，放置在37℃、5％co2培養箱中作用48h后，加入mtt(5g/l)，20μl/孔，繼續放置在37℃、5％co2培養箱中培養4h，2000r/min離心5min，翻板棄上清，加入dmso150μl/孔，震蕩，待沉淀溶解，放于酶標儀中，490nm測光密度(od)值，按如下公式計算殺傷活性：殺傷率(％)＝{1-[(實驗組od值-單獨效應細胞od值)/單獨靶細胞od值]}×100％。7、統計學方法采用spss19.0統計軟件分析，數據以均數±標準差表示，p＜0.05具有統計學意義。三、實驗結果1、cik細胞增殖cik細胞在培養第5天細胞增殖速度加快，第5-13天為快速增殖時間段，在第20天細胞增殖達到原種植量的118倍，在第20天細胞增殖達到原種植量的176倍。2、化合物cm1-6對hepg2細胞的細胞毒作用化合物cm1-6給藥組與對照組的吸光度(a)值無顯著差異，證明2μm化合物cm1-6對hepg2細胞無明顯細胞毒作用。結果見表1。表1化合物cm1-6給藥組與對照組的吸光度值的比值cm1cm2cm3cm4cm5cm6a給藥/a對照1.020.980.980.991.011.013、化合物cm1-6增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性從表2和圖1可以看出，各增敏組cik細胞對hepg2細胞的殺傷率均顯著高于常規組。已知2μm化合物cm1-6對hepg2細胞無明顯細胞毒作用，各增敏組cik細胞對hepg2細胞殺傷率的提高只能歸結于化合物cm1-6提高了hepg2細胞對cik細胞的殺傷敏感性，使用化合物cm1-6對靶細胞hepg2細胞增敏后，效靶比不變的情況下，cik細胞對hepg2細胞的殺傷力顯著提高。表2各組cik細胞對hepg2細胞的殺傷率(效靶比10:1)本發明證明吡啶并咪唑類化合物可以有效增強肝癌細胞對cik細胞殺傷敏感性，可以制備成藥學上可以接受的藥物制劑，以實現使用少量的cik細胞就發揮較優的免疫治療效果。上述實施例是對本發明實質性內容的體現，用于更好地解釋本發明，但本領域技術人員應當知曉，不應將本發明的保護范圍局限于上述具體的實施例。當前第1頁12