一種誘導dc-cik細胞的化合物在腫瘤細胞免疫治療中的應用
【技術領域】
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[0001]本發明屬于生物治療領域，涉及一種化合物在腫瘤免疫治療中的應用。
【背景技術】
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[0002]生物治療是除化學治療、放射治療和手術治療以外的一種新型腫瘤內科治療技術。自體免疫細胞治療技術作為腫瘤生物治療技術，已被國家衛生計生委列入允許臨床應用的三類技術。腫瘤患者外周血細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK/DC-CIK細胞)治療技術，屬于所述的生物治療技術，其核心技術為腫瘤患者自體外周血CIK/DC-CIK細胞體外培養及其回輸技術。
[0003]自體CIK細胞是指，在體外由多種細胞因子誘導患者自體外周血單個核細胞(PBMC)而生成的異質細胞群。惡性腫瘤患者的免疫機能存在不同程度的受損，⑶3+、⑶8+、CD56+細胞數量降低，增殖后的CIK細胞具有T細胞強大的抗腫瘤活性和NK細胞非主要組織相容性復合物(MHC)限制性殺瘤的特點。
[0004]生物免疫療法DC-CIK，是指與DC細胞共培養的CIK細胞。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-1nduced killers, CIK)是一類抗腫瘤抗病毒效應細胞，能在體外被誘導并大量增殖。樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是有效的專職抗原提呈細胞，成熟的DC可以通過II型組織相容性抗原(MHC-1I )等途徑提呈腫瘤抗原，有效抵制腫瘤細胞的免疫逃逸機制。CIK細胞和DC細胞是細胞免疫治療的2個重要組成部分，兩者聯合可確保高效的免疫反應。
[0005]與外周血單個核細胞PBMC相比，CIK細胞中⑶3+、⑶8+、⑶56+細胞比例明顯升高，CIK細胞對腫瘤細胞有很強的殺傷力，而且CIK細胞越多，殺瘤效果越好。CIK細胞己成為過繼細胞免疫治療的主要手段。
[0006]自體外周血DC-CIK細胞是自體DC細胞和CIK細胞共同培養后生成的異質細胞群，DC和CIK共培養24h后，IL12的分泌量是CIK細胞單獨培養的6.93倍，可以高表達CD3+、CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+ 細胞，低表達 CD4+CD25+Treg 細胞。盡管 DC 細胞不具備直接殺傷腫瘤細胞作用，但DC細胞可刺激CIK細胞的增殖，分泌多種腫瘤殺傷細胞因子，比如TNFa和干擾素等。自體外周血DC-CIK細胞抗腫瘤效果一般比CIK細胞好，但制備成本較高。自身DC細胞與自身腫瘤抗原共刺激后，可增強抗腫瘤免疫應答，目前常用于腫瘤細胞疫苗的臨床預防。
[0007]CIK細胞殺傷腫瘤細胞主要通過以下四種途徑:
[0008]CIK細胞能通過不同的機制識別腫瘤細胞，從而通過細胞毒作用殺死腫瘤細胞；
[0009]CIK細胞能誘導腫瘤細胞凋亡，達到殺死腫瘤細胞的目的；
[0010]CIK細胞分泌IL-2、IL-6、IFN- γ等多種抗腫瘤的細胞因子；
[0011]腫瘤生物治療的目標是通過人為干預，調節機體自身的免疫系統，提高對腫瘤細胞的識別、抑制功能。
[0012]腫瘤免疫治療具有以下的優越性:
[0013]免疫治療不僅可以直接產生抗腫瘤作用，還能糾正患者的免疫系統，促進機體抗腫瘤的免疫能力；
[0014]無放療、化療副作用，可減輕患者痛苦；
[0015]可用于已產生耐藥性腫瘤患者的治療；
[0016]對于晚期腫瘤患者能夠迅速緩解癥狀，提高生存質量；
[0017]對術后腫瘤患者防復發效果較好，遠期抗腫瘤效果良好；
[0018]可單獨使用，也可與其它治療方法聯合使用，單次使用有效，多次使用效果更佳。
[0019]尿苷二磷酸-N-乙酰胞壁酸(UDP-MurNAc，簡稱UNAM)是一種五肽類化合物，是合成肽聚糖過程中的一個重要中間產物，參與細胞壁的合成與調控。肽聚糖作為大多數真菌細胞壁的重要組成，是維持細菌細胞形態和滲透壓平衡的重要基礎，參與真菌的生長和繁殖過程。基于此，本發明在實驗研究中，根據文獻提供的化合物來源(Mainardi J.L.at al2002，J B1l.chem277:35801-35807)，選用尿苷二磷酸-N-乙酰胞壁酸(UNAM)作為誘導物，以期誘導產生高活性CIK細胞，提高其對腫瘤細胞的識別能力及殺瘤活性，其產生了意想不到的效果。本發明所述UNAM在外周血細胞因子誘導殺傷細胞功能，進而增強其殺瘤活性的作用，迄今尚未見有國內外的相關報道。
【發明內容】
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[0020]本發明提供了一種利用多肽誘導DC-CIK的方法，經該法制備的UNAM-DC-CIK細胞殺瘤活性較常規誘導的DC-CIK得到顯著提高。
[0021]本發明采用的技術方案是:利用多肽誘導DC-CIK細胞的培養方法，其特征在于向CIK或DC-CIK細胞培養液中加入UNAM誘導CIK或DC-CIK細胞增殖與分化，以提高CIK或DC-CIK細胞的殺瘤作用。
[0022]所述向CIK或DC-CIK培養液中加入多肽誘導DC-CIK細胞增殖與分化，具體包含以下步驟:
[0023]步驟1:外周血采集，無菌抽取腫瘤疾病患者外周血75ml，肝納素抗凝并充分混勻，避免凝血；
[0024]步驟2:腫瘤抗原獲取，室溫條件下，外周血100rpm離心10分鐘，收集1ml上層血漿，將收集的血漿加入UNAM-DC-CIK誘導培養基中，所得細胞沉淀用于分離單個核細胞；
[0025]步驟3:所得細胞沉淀用生理鹽水加至50ml洗滌，100rpm離心10分鐘。棄上清，再次洗滌。輕輕加至淋巴細胞分離液表面，650g條件下離心20分鐘。用滅菌的巴氏收集淋巴細胞分離液表層細胞，移至50ml —次性塑料離心管中，加入生理鹽水至50ml，混勻，再次洗滌離心；
[0026]步驟4:UNAM-DC-CIK細胞培養，離心后棄上清，沉淀用含多肽的誘導培養基重懸，并用稀釋液稀釋計數，均分至4個75cm2—次性的細胞培養瓶中，放入37°C、5% C02(v/v)飽和濕度的培養箱中培養，培養期間根據細胞生長情況適時換液和擴增，直至細胞數達到回輸所需。該步驟中，所述的UNAM-DC-CIK誘導培養基多肽濃度為0.0 lug/ml?lmg/ml。
[0027]發明效果:
[0028]本發明利用UNAM可以有效增強巨噬細胞的吞噬能力，增加其抗原遞呈能力、促進T細胞分化、促進免疫雙向調節以及對免疫細胞的免疫佐劑等特性。通過該誘導培養基培養的DC-CIK細胞，流式細胞儀檢測發現，起到關鍵作用的CD3+、CD56+的無MHC限制性NKT細胞的比例高達82%以上，高于國內外文獻報道。同時，其殺瘤作用在實驗室檢測條件下達到99.2%。體外實驗顯示，經此方法培養的DC-CIK細胞殺瘤活性高于常規培養的細胞。動物實驗顯示，經該法制備的UNAM-DC-CIK細胞治療荷瘤小鼠，其腫瘤負荷可明顯降低或消失，延長帶瘤生存期。臨床應用發現，經該法制備的UNAM-DC-CIK細胞治療腫瘤患者均不同程度改善了生活質量，延長了生存期，部分病人病情得到緩解甚至治愈，得到廣大醫務工作者以及腫瘤病患者的認可和重視，為腫瘤的治療提供了一種更為有效的方法和手段。
【附圖說明】
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[0029]圖1-UNAM誘導的免疫細胞UNAM-DC-CIK與DC-CIK細胞增殖
[0030]圖2-UNAM誘導的免疫細胞UNAM-DC-CIK與DC-CIK殺傷腫瘤細胞活性
[0031]圖3-UNAM誘導的免疫細胞UNAM-DC-CIK與DC-CIK治療荷瘤小數的生存期結果
[0032]實施方式:
[0033]以下實施例僅為幫助本領域技術人員更好地了解本發明，但不用于限制本發明。
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