本發明涉及生物材料與醫療器械的技術領域，具體涉及一種在醫用鎂合金表面制備殼聚糖/肝素化氧化石墨烯復合多層膜的方法。
背景技術：
心腦血管病損狹窄是許多致死性心腦血管疾病并發癥的一個最主要原因，金屬血管支架植入是治療狹窄心腦血管疾病的主要手段之一。近年來，鎂合金生物材料由于具有良好的力學性能、可生物降解性能以及降解產物對人體無毒等優異特點，已經成為心血管支架生物材料的研究熱點。
然而，鎂合金化學性質活潑，在生理條件下降解較快，容易在植入組織周圍產生過量氫氣并引發周圍組織局部堿性升高和二次腐蝕產物富集，導致材料力學性能的過早喪失、較差的血液相容性與細胞相容性以及對周圍組織的毒性反應，最終導致材料與組織的延遲愈合，甚至植入失敗。由于材料的腐蝕行為與生物相容性都與材料的表面性能密切相關，因此，作為血管支架材料，通過表面改性來調控鎂合金的電化學降解行為、提高血液相容性以及促進內皮組織愈合，對其臨床應用具有十分重要的意義。
針對鎂合金在生理環境下降解過快的問題，目前的研究主要從合金化和表面改性兩方面來提高鎂合金的耐蝕性能。合金化可以顯著改善鎂合金的力學性能，但是制備的鎂合金材料在復雜生理環境下的耐蝕性能仍有待改善，并且大多數合金元素并不能有效提升材料的生物相容性，因此，合金化制備的鎂合金表面通常缺乏生物活性。
目前國內外在鎂合金表面改性提高耐蝕性方面的研究主要集中在三個方面，一是采用表面化學處理或電化學處理在表面形成化學轉化層；二是通過改變表面的組織結構形成表面改性層；三是通過在表面引入有機分子、高分子或者制備無機非金屬涂層在鎂合金表面形成表面覆蓋層。這些方法在表面形成了耐蝕性更好的轉化層或者覆蓋層，可以將基體與周圍環境介質隔離，有效提高了鎂合金的耐蝕性并顯著減少了快速降解導致的生理副反應，在一定程度上提高了材料的生物相容性。
在表面引入生物活性分子是提高鎂合金等生物材料的生物相容性最為有效的方法之一。然而，鎂合金化學性質活潑，用于不可降解生物材料的表面改性策略往往需要在電解質溶液中進行，可能會造成鎂合金的腐蝕降解，因此，應用這些策略必須首先提高其耐蝕性。盡管目前國內外在鎂合金表面改性方面進行了大量卓有成效的工作，但是，作為血管內植入材料，目前的表面改性方法無論是在提高鎂合金耐蝕性方面還是增強生物相容性方面都沒有達到臨床滿意的效果。表面化學聚合、自組裝表面改性以及表面原位生物分子固定等技術，構建的表面層較薄，生物分子較少，對鎂合金的耐蝕性和生物相容性的改善有限，而且在材料的降解過程中，表面生物分子首先降解流失，鎂合金將很快失去生物活性；各種高分子或者陶瓷涂層，在提高鎂合金耐蝕性方面效果顯著，但是用于血管內植入材料時，仍然可能導致凝血發生和內皮延遲愈合。
技術實現要素：
本發明的目的在于：克服現有技術的不足，提供一種在醫用鎂合金表面制備殼聚糖/肝素化氧化石墨烯復合多層膜的方法，通過該方法可以構建一種具有多功能特性的鎂合金表面，并顯著提升鎂合金在生理條件下的耐蝕性能和生物相容性，提高材料及其器械的植入成功率。
本發明所采取的技術方案是：
一種在醫用鎂合金表面制備殼聚糖/肝素化氧化石墨烯復合多層膜的方法，包括以下步驟：
1）首先制備帶負電荷的肝素化氧化石墨烯（hgo）；
2）然后對醫用鎂合金進行表面化學處理和自組裝表面改性；
3）進一步將殼聚糖（chi）共價固定在鎂合金表面，從而構建正電荷的材料表面；
4）再將表面改性的鎂合金材料交替浸沒到hgo和chi溶液中充分吸附；
5）最后經干燥后得到chi/hgo復合多層膜。
本發明進一步改進方案是，所述步驟1）中，肝素化氧化石墨烯的制備方法為：
1.1）首先將氧化石墨烯在濃度在0.1~0.5mol/l范圍內的naoh溶液中超聲分散2小時；
1.2）然后，加入過量的氯乙酸超聲反應2~4小時；
1.3）再將溶液反復離心水洗至中性以除去雜質，得到羧基化氧化石墨烯；
1.4）將得到的羧基化氧化石墨烯超聲分散；
1.5）接著加入n,n’-二環己基碳二亞胺和4-（二甲氨基）吡啶的混合溶液中振蕩反應2~4小時；
1.6）然后將溶液反復離心水洗除去雜質；
1.7）再將活化的氧化石墨烯加入到肝素溶液中充分反應4~12小時；
1.8）最后反復離心水洗后得到hgo。
本發明更進一步改進方案是，所述步驟1.5）中，所述n,n’-二環己基碳二亞胺和4-（二甲氨基）吡啶的混合溶液中，n,n’-二環己基碳二亞胺和4-（二甲氨基）吡啶的摩爾比為3:1。
本發明更進一步改進方案是，所述步驟2）中，鎂合金表面化學處理為：
先將鎂合金清洗后浸沒到濃度在1~5mol/l范圍內的naoh溶液中，在60~85℃的條件下處理8~24小時。
本發明更進一步改進方案是，所述步驟2）中，自組裝方法為：
將naoh處理的鎂合金浸沒到濃度在1~10mmol/l范圍內的16-膦酰基十六烷酸溶液中反應12~24小時，樣品取出后在110℃的條件下真空處理12~24小時。
本發明更進一步改進方案是，所述步驟3）中，殼聚糖共價固定方法為：
3.1）將步驟2）中得到的表面改性樣品浸沒到碳二亞胺/n-羥基丁二酰亞胺的混合溶液中反應；
3.2）反應2~8小時之后進行干燥；
3.3）干燥后浸沒到濃度在1~5g/l范圍內的殼聚糖溶液中繼續反應；
3.4）繼續反應2~8小時后，樣品清洗干燥后得到殼聚糖改性的帶正電荷的鎂合金。
本發明更進一步改進方案是，所述步驟3.1）中，所述碳二亞胺/n-羥基丁二酰亞胺的混合溶液中，碳二亞胺/n-羥基丁二酰亞胺的摩爾比為4:1。
本發明更進一步改進方案是，所述步驟4）中，殼聚糖/肝素化氧化石墨烯復合多層膜的制備方法為：
將步驟3）中得到的材料交替浸沒到濃度在0.1~1mg/ml范圍內的肝素化氧化石墨烯和濃度在1~5g/l范圍內的殼聚糖溶液中，每次吸附20~60分鐘，每次吸附后充分干燥，從而獲得chi/hgo復合多層膜。
本發明更進一步改進方案是，交替浸沒的次數越多，所述chi/hgo復合多層膜的厚度越厚。
本發明的有益效果在于：
第一、本發明的一種在醫用鎂合金表面制備殼聚糖/肝素化氧化石墨烯復合多層膜的方法，本發明提出了綜合采用多種表面處理技術構建殼聚糖/肝素化氧化石墨烯多層膜涂層，以解決鎂合金生物材料降解速率過快以及生物相容性不佳的關鍵技術問題的創新設計策略。
第二、本發明的一種在醫用鎂合金表面制備殼聚糖/肝素化氧化石墨烯復合多層膜的方法，本發明采用的鎂合金表面改性技術不僅可以提高鎂合金的耐蝕性能，也可以顯著提升鎂合金的生物相容性，采用不同的涂層厚度，可以實現對鎂合金電化學行為和生物相容性的調控與優化，從而達到電化學行為和生物相容性的完美適配。
第三、本發明的一種在醫用鎂合金表面制備殼聚糖/肝素化氧化石墨烯復合多層膜的方法，本發明構建的chi/hgo多層膜涂層在生理環境下逐漸降解，在降解的過程中逐漸釋放殼聚糖和hgo，不僅可以發揮不同物質的生物活性，并且由于涂層的逐漸降解使得涂層可以長期保持較高的生物活性和生物相容性，顯著提升鎂合金材料的植入成功率。
第四、本發明的一種在醫用鎂合金表面制備殼聚糖/肝素化氧化石墨烯復合多層膜的方法，由于堿熱處理化學轉化層的良好耐蝕性能、肝素化氧化石墨烯和殼聚糖對鎂合金表面的覆蓋作用、殼聚糖的促內皮細胞生長作用、以及肝素優異的抗凝血性能和選擇性促內皮細胞生長功能，本發明構建的多層膜涂層將從根本上解決鎂合金腐蝕降解過快和生物相容性不佳的問題，可用于血管支架等醫療器械的表面改性。
附圖說明：
圖1為醫用鎂合金表面殼聚糖/肝素化氧化石墨烯復合多層膜制備方法的流程示意圖。
圖中包括以下步驟：
（1）氧化石墨烯的羧基化改性；
（2）肝素化氧化石墨烯的制備；
（3）鎂合金表面堿熱處理；
（4）表面自組裝；
（5）鎂合金表面共價固定殼聚糖；
（6）殼聚糖/肝素化氧化石墨烯復合多層膜的制備。
具體實施方式：
如圖1可知，本發明包括以下步驟：
1）首先制備帶負電荷的肝素化氧化石墨烯（hgo）；
2）然后對醫用鎂合金進行表面化學處理和自組裝表面改性；
3）進一步將殼聚糖（chi）共價固定在鎂合金表面，從而構建正電荷的材料表面；
4）再將表面改性的鎂合金材料交替浸沒到hgo和chi溶液中充分吸附；
5）最后經干燥后得到chi/hgo復合多層膜。
本發明進一步改進方案是，所述步驟1）中，肝素化氧化石墨烯的制備方法為：
1.1）首先將氧化石墨烯在濃度為0.3mol/l的naoh溶液中超聲分散2小時；
1.2）然后，加入過量的氯乙酸超聲反應3小時；
1.3）再將溶液反復離心水洗至中性以除去雜質，得到羧基化氧化石墨烯；
1.4）將得到的羧基化氧化石墨烯超聲分散；
1.5）接著加入n,n’-二環己基碳二亞胺和4-（二甲氨基）吡啶的混合溶液中振蕩反應3小時；
1.6）然后將溶液反復離心水洗除去雜質；
1.7）再將活化的氧化石墨烯加入到肝素溶液中充分反應10小時；
1.8）最后反復離心水洗后得到hgo。
所述步驟1.5）中，所述n,n’-二環己基碳二亞胺和4-（二甲氨基）吡啶的混合溶液中，n,n’-二環己基碳二亞胺和4-（二甲氨基）吡啶的摩爾比為3:1。
所述步驟2）中，鎂合金表面化學處理為：
先將鎂合金清洗后浸沒到濃度為3mol/l的naoh溶液中，在60~85℃的條件下處理15小時。
所述步驟2）中，自組裝方法為：
將naoh處理的鎂合金浸沒到濃度為7mmol/l的16-膦酰基十六烷酸溶液中反應18小時，樣品取出后在110℃的條件下真空處理20小時。
所述步驟3）中，殼聚糖共價固定方法為：
3.1）將步驟2）中得到的表面改性樣品浸沒到碳二亞胺/n-羥基丁二酰亞胺的混合溶液中反應；
3.2）反應5小時之后進行干燥；
3.3）干燥后浸沒到濃度為3g/l的殼聚糖溶液中繼續反應；
3.4）繼續反應6小時后，樣品清洗干燥后得到殼聚糖改性的帶正電荷的鎂合金。
所述步驟3.1）中，所述碳二亞胺/n-羥基丁二酰亞胺的混合溶液中，碳二亞胺/n-羥基丁二酰亞胺的摩爾比為4:1。
所述步驟4）中，殼聚糖/肝素化氧化石墨烯復合多層膜的制備方法為：
將步驟3）中得到的材料交替浸沒到濃度位0.4mg/ml的肝素化氧化石墨烯和濃度為3g/l的殼聚糖溶液中，每次吸附30分鐘，每次吸附后充分干燥，從而獲得chi/hgo復合多層膜；交替浸沒的次數越多，所述chi/hgo復合多層膜的厚度越厚。