本發明屬于獸用生物制品
技術領域：
，具體涉及一種用bhk細胞系生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒滅活疫苗的方法。
背景技術：
：豬偽狂犬病病毒(prv)屬于皰疹病毒科a皰疹病毒亞科水泡病毒屬豬皰疹病毒i型，豬是該病毒的唯一自然宿主，引起豬的偽狂犬病。該病在豬群多呈暴發流行，主要危害母豬群，引起母豬流產或垂直傳播給仔豬，造成初生仔豬大量死亡，給我國乃至全球的養豬業帶來了巨大的經濟損失。目前尚無治療豬偽狂犬病的有效藥物，因此疫苗接種成為控制該病發生和流行的主要措施。目前在市場上廣泛使用是自然缺失弱毒疫苗。自然缺失弱毒疫苗是通過非豬源細胞或雞胚的連續傳代，或在某些誘變劑的存在下，用低于或高于通常的培養溫度在細胞培養物上連續傳代獲得，其基因組的內部存在著多處的點突變以及一些基因的缺失，它是一種自然的基因缺失疫苗。其中，世界上使用最廣泛的疫苗主要是prvbartha-k61株疫苗，然而近幾年我國豬偽狂犬疫病流行現狀表明使用的prvbartha-k61株疫苗免疫豬產生的中和抗體不能有效中和新分離的病毒prvhen1株，該疫苗不能完全保護新流行prv的攻擊。偽狂犬病基因缺失疫苗是利用基因工程技術在prv基因組中插入或缺失一段序列，致使prv的某些基因(特別是一些毒力基因)不能表達，從而使prv的毒力減弱，同時又保持其較強的免疫原性。偽狂犬病糖蛋白基因ge是造成偽狂犬病毒潛伏和免疫逃避的主要因素，是偽狂犬病毒的主要毒力相關基因。糖蛋白ge是至今發現的所有prv毒株(某些疫苗株除外)均能表達的蛋白，具有群特異性，在prv的鑒別診斷中具有重要的意義。因此，通過接種偽狂犬病毒ge基因缺失滅活疫苗來預防和控制狂犬病，已成為國際上普遍接受和流行的方法。目前對豬偽狂犬病病毒基因缺失疫苗的研究主要是針對如何構建和篩選偽狂犬病病毒基因缺失的毒株，而對相應毒株的培養條件并沒有進行深入的研究，大部分是采用常規的培養條件，如公開號為cn1244692c的中國專利申請“一種偽狂犬病tk-/ge-/gi-基因缺失標志活疫苗及制備方法”，將構建的基因缺失偽狂犬病病毒株采用原代雞胚成纖維細胞進行轉瓶培養，所用的細胞維持液為含有2％新生牛血清的dmem溶液，制得的病毒液中病毒滴度僅為106.3tcid50/ml，且病毒液的收獲所需的時間長。同時由于其細胞維持液含有新生牛血清，會造成血清殘留，引發過敏，給疫苗的使用帶來一定的安全隱患。因此，亟待對目前的豬偽狂犬病毒ge基因缺失滅活疫苗的生產和收獲方法進行改進。技術實現要素：為解決現有技術中存在的技術問題，本發明的目的在于提供一種用bhk細胞系生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒滅活疫苗的方法。本發明提供的技術方案為如下：一種用bhk細胞系生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒滅活疫苗的方法，其包括以下步驟：(1)將種子細胞bhk21進行復蘇，然后接入轉瓶中，加入細胞生長液，置于轉瓶機上培養，培養條件為：轉速15～20r/min、ph值7.2～7.4、溫度36.5～37.5℃；(2)待步驟(1)中轉瓶培養的bhk21細胞長成片后接入豬偽狂犬ge基因缺失病毒，接入毒種的感染復數為0.01，在轉速為15～20r/min，ph值為7.2～7.4、溫度為35.5～36.5℃的培養條件下培養12h，使病毒與細胞充分接觸吸附，然后將轉速設為5～10r/min，連續培養4～6天，待細胞病變cpe達90％以上，收獲細胞毒液；(3)將收獲的病毒液進行濃縮、滅活、除菌，制成成品，即得。其中，上述的將種子細胞bhk21進行復蘇具體為：將bhk21細胞種自液氮罐中取出復蘇，加入含10％新生牛血清的dmem培養基中，在37℃，5％co2下培養，直至其長成良好單層，然后用適量含0.02％edta胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的dmem培養基調整細胞密度為2～4×105個/ml的細胞懸液。進一步地，所述的細胞生長液為含有4～8mmol/l谷氨酰胺、0.4～1.2mg/l二亞油酰磷脂膽堿、2～6％(m/v)d-氨基葡萄糖、2～4％(m/v)生長促進劑、1.0～1.2％(v/v)雙抗的dmem培養液。優選地，所述的細胞生長液為含有8mmol/l谷氨酰胺、0.6mg/l二亞油酰磷脂膽堿、4％(m/v)d-氨基葡萄糖、4％(m/v)生長促進劑、1.0％(v/v)雙抗的dmem培養液。進一步地，所述的生長促進劑由硫酸角質素寡聚糖和活性礦物酵母多肽以1:0.05～0.2的質量比組成。優選地，所述的生長促進劑由硫酸角質素寡聚糖和活性礦物酵母多肽以1:0.15的質量比組成。具體地，上述的硫酸角質素寡聚糖為硫酸角質素低聚糖混合物，即為硫酸角質素二糖、硫酸角質素三糖、硫酸角質素四糖、硫酸角質素五糖的混合物，其制備方法參考公開號為cn1174557a的中國專利“硫酸角質素寡聚糖級分及含該級分的藥劑”，具體為：取硫酸角質素50g，溶解在300ml的0.1m醋酸緩沖液(ph6.0)中，加入25u內-β-n-乙酰基葡萄糖胺酶型硫酸降解酶，在37℃下降解24h。反應結束后，加入2倍體積的乙醇，攪拌，在室溫下放置1夜，在4000rpm下離心15min，取上清(上清a)。往沉淀中加入300ml蒸餾水，進行溶解，加入3倍量的乙醇，攪拌，在室溫下放置1夜，4000rpm下離心15min，取上清(上清b)。將上清a和上清b混合，減壓濃縮，使用bio-gel-p-2柱(3.6╳134cm)，以蒸餾水作為溶劑，進行凝膠過濾，將濾液冷凍干燥即得。優選地，本發明人根據上述公開的方法進行改進，以調整硫酸角質素寡聚糖中硫酸角質素二糖、硫酸角質素三糖、硫酸角質素四糖、硫酸角質素五糖的比例。經試驗，本發明人發現硫酸角質素寡聚糖中硫酸角質素二糖的含量越高，更有利于bhk21細胞在無血清細胞生長液中生長，促進病毒繁殖。進一步地，所述的雙抗為含100iu/ml的青霉素和10mg/ml的鏈霉素溶液。在本發明用于制備疫苗的病毒液中病毒的滴度≥108.0tcid50/ml，所收獲的病毒液在制成成品疫苗前需經過濃縮、滅活、除菌處理，具體地，所述的濃縮步驟為：將病毒液通過50k中空纖維柱進行濃縮；滅活步驟為：采用福爾馬林滅活，所述福爾馬林在病毒濃縮液的終濃度為0.1％；除菌步驟為：將滅活后的濃縮液使用過濾精度為0.45μm的筒式濾芯精濾，再用過濾精度為0.20μm的筒式濾芯過濾除菌，無菌操作分裝，即得。此外，本發明還請求保護根據所述的滅活疫苗生產方法制得的豬偽狂犬ge基因缺失病毒滅活疫苗。在本發明用bhk21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒液的過程中，使用的細胞生長液中添加由硫酸角質素寡聚糖和活性礦物酵母多肽以一定質量比組成的生長促進劑，可使bhk21細胞在無血清的環境下保持較佳的生長狀態，使bhk21細胞能夠迅速適應由含高濃度新生牛血清(10％)的dmem培養基過渡到不含血清的細胞生長液培養環境，在較短時間內于轉瓶內壁上長成單層細胞。所述的活性礦物酵母多肽(acbbio-chelate5)是礦物元素與酵母多肽形成的絡合物，具體為酵母多肽絡合的鋅、銅、鎂、鐵和硅，購自美國艾緹科技公司(activeconcepts)，為bhk21細胞和病毒的生長繁殖提供了必不可少的營養元素，促進細胞和病毒的繁殖。在本發明所述的生長促進劑中，硫酸角質素寡聚糖以低聚糖的形式存在，具體為：以硫酸角質素二糖、硫酸角質素三糖、硫酸角質素四糖、硫酸角質素五糖混合物的形式添加至細胞生長液中，有利于細胞吸收，其具有一些生長因子的類似作用，可刺激細胞繁殖與分化，提高bhk21細胞貼壁培養密度。相關試驗數據表明，采用轉瓶培養bhk21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒液過程中，經復蘇后制得的bhk21細胞懸液接入轉瓶中進行擴大培養48～72h，即可在轉瓶內壁上長成一片，bhk21細胞細胞生長迅速。同時，往細胞接入豬偽狂犬ge基因缺失病毒后繼續培養，病毒繁殖迅速，培養4～5天，細胞病變cpe達90％以上，收獲的病毒液中病毒含量高，達≥107.2tcid50/ml，表明bhk21細胞和豬偽狂犬ge基因缺失病毒在本發明提供的培養環境中，均保持較佳的生長活性，大大縮短了生產時間，節約成本，提高效益。與現有技術相比，本發明的優勢在于：(1)采用本發明提供的疫苗生產方法收獲的豬偽狂犬ge基因缺失病毒液的病毒含量高，達≥107.2tcid50/ml，經濃縮后制成成品疫苗，得到的疫苗效價高，穩定在108.0tcid50/ml以上，且純度高，質量穩定，不會存在血清殘留引起過敏反應的問題，且具有較強的免疫原性，不需要添加免疫增強劑即可達到好的免疫效果，經免疫后可促進體內分泌中和抗體，免疫保護率達到100％，完全達到疫苗效力評價標準。(2)本發明創造性地在細胞生長液中添加由硫酸角質素寡聚糖和活性礦物酵母多肽組成的生長促進劑，大大提高了bhk21細胞的生長活性，使bhk21細胞能夠迅速適應由含高濃度新生牛血清(10％)的dmem培養基過渡到不含血清的細胞生長液培養環境，在較短時間內于轉瓶內壁上長成單層細胞，同時促進病毒在細胞中繁殖，大大縮短生產時間，提高生產效率。具體實施方式以下通過具體實施方式進一步描述本發明，但本發明不僅僅限于以下實施例。實施例1硫酸角質素寡聚糖制備及成分分析a組的制備：取硫酸角質素50g，溶解在300ml的0.1m醋酸緩沖液(ph6.0)中，加入25u混合酶，在37℃下降解24h。反應結束后，加入2倍體積的乙醇，攪拌，在室溫下放置1夜，在4000rpm下離心15min，取上清(上清a)。往沉淀中加入300ml蒸餾水，進行溶解，加入3倍量的乙醇，攪拌，在室溫下放置1夜，4000rpm下離心15min，取上清(上清b)。將上清a和上清b混合，減壓濃縮，使用bio-gel-p-2柱(3.6╳134cm)，以蒸餾水作為溶劑，進行凝膠過濾，將濾液冷凍干燥即得。b-d組硫酸角質素寡聚糖的制備參考a組。硫酸角質素寡聚糖的成分分析將上述a-d組制得的硫酸角質素寡聚糖分別采用離子交換色譜進行分離，分別取得硫酸角質素二糖、硫酸角質素三糖、硫酸角質素四糖、硫酸角質素五糖級分，經冷凍干燥后，采用高效液相色譜進行分析，檢測各成分的含量，結果見下表所示：表150g硫酸角質素制得的寡聚糖中各低聚糖的含量組成(含量％)硫酸角質素二糖硫酸角質素三糖硫酸角質素四糖硫酸角質素五糖a20.812.66.22.5b23.613.24.72.2c22.712.85.52.0d20.212.45.72.8實施例2硫酸角質素寡聚糖對bhk-21細胞生長的影響分別采用實施例1a-d組制得硫酸角質素寡聚糖對bhk21細胞進行培養，具體為：(1)將bhk21細胞種自液氮罐中取出復蘇，加入含10％新生牛血清的dmem培養基中，在37℃，5％co2下培養，直至其長成良好單層，然后用適量含0.02％edta胰蛋白酶消化液，37℃消化6min，使用含10％新生牛血清的dmem培養基調整細胞密度為2.26×105個/ml的細胞懸液；(2)將步驟(1)得到細胞懸液接入轉瓶中，加入細胞生長液，所述的細胞懸液與細胞生長液的體積比為1:10，所述的細胞生長液為含有4mmol/l谷氨酰胺、0.8mg/l二亞油酰磷脂膽堿、4％(m/v)d-氨基葡萄糖、2％(m/v)生長促進劑、1.0％(v/v)雙抗的dmem培養液，置于轉瓶機上培養，培養條件為：轉速15r/min、ph值7.35、溫度36.5℃。其中，所述的生長促進劑為實施例1a(b或c或d)組制得的硫酸角質素寡聚糖和活性礦物酵母多肽以1:0.15的質量比組成。(3)培養72h后，統計細胞的生長密度，結果見下表2。表2不同組別的硫酸角質素寡聚糖對bhk-21細胞生長的影響由上表2可知，硫酸角質素寡聚糖中硫酸角質素二糖的含量越高，更有利于bhk21細胞在無血清細胞生長液中生長，使細胞在轉瓶中培養72h后的密度達到1.02╳107個/ml。實施例3用bhk-21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒(1)將bhk21細胞種自液氮罐中取出復蘇，加入含10％新生牛血清的dmem培養基中，在37℃，5％co2下培養，直至其長成良好單層，然后用適量含0.02％edta胰蛋白酶消化液，37℃消化6min，使用含10％新生牛血清的dmem培養基調整細胞密度為3.24×105個/ml的細胞懸液；(2)將步驟(1)得到細胞懸液接入轉瓶中，加入細胞生長液，所述的細胞懸液與細胞生長液的體積比為1:10，所述的細胞生長液為含有6mmol/l谷氨酰胺、0.4mg/l二亞油酰磷脂膽堿、4％(m/v)d-氨基葡萄糖、3％(m/v)生長促進劑、1.0％(v/v)雙抗的dmem培養液，置于轉瓶機上培養72h，培養條件為：轉速15r/min、ph值7.35、溫度36.5℃，其中，所述的生長促進劑為實施例1b組制得的硫酸角質素寡聚糖和活性礦物酵母多肽以1:0.15的質量比組成；(3)待步驟(2)中轉瓶培養的bhk21細胞長成片后接入豬偽狂犬ge基因缺失病毒，接入毒種的感染復數為0.01，在轉速為15r/min，ph值為7.35、溫度為36.5℃的培養條件下培養12h，使病毒與細胞充分接觸吸附，然后將轉速設為5r/min，連續培養4天，待細胞病變cpe達90％以上，收獲細胞毒液。實施例4用bhk-21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒(1)將bhk21細胞種自液氮罐中取出復蘇，加入含10％新生牛血清的dmem培養基中，在37℃，5％co2下培養，直至其長成良好單層，然后用適量含0.02％edta胰蛋白酶消化液，37℃消化6min，使用含10％新生牛血清的dmem培養基調整細胞密度為2.52×105個/ml的細胞懸液；(2)將步驟(1)得到細胞懸液接入轉瓶中，加入細胞生長液，所述的細胞懸液與細胞生長液的體積比為1:10，所述的細胞生長液為含有8mmol/l谷氨酰胺、0.6mg/l二亞油酰磷脂膽堿、4％(m/v)d-氨基葡萄糖、4％(m/v)生長促進劑、1.0％(v/v)雙抗的dmem培養液，置于轉瓶機上培養72h，培養條件為：轉速15r/min、ph值7.4、溫度36.5℃，其中，所述的生長促進劑為實施例1b組制得的硫酸角質素寡聚糖和活性礦物酵母多肽以1:0.15的質量比組成；(3)待步驟(2)中轉瓶培養的bhk21細胞長成片后接入豬偽狂犬ge基因缺失病毒，接入毒種的感染復數為0.01，在轉速為15r/min，ph值為7.4、溫度為36.5℃的培養條件下培養12h，使病毒與細胞充分接觸吸附，然后將轉速設為5r/min，連續培養4天，待細胞病變cpe達90％以上，收獲細胞毒液。對比例1用bhk-21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒對比例1用bhk-21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒的步驟與實施例4基本相同，區別在于，所述步驟(2)的細胞生長液不添加生長促進劑。對比例2用bhk-21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒對比例2用bhk-21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒的步驟與實施例4基本相同，區別在于，所述步驟(2)的細胞生長液中的生長促進劑僅含硫酸角質素寡聚糖。對比例3用bhk-21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒對比例3用bhk-21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒的步驟與實施例4基本相同，區別在于，所述步驟(2)的細胞生長液中的生長促進劑僅含活性礦物酵母多肽。對比例4用bhk-21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒對比例4用bhk-21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒的步驟與實施例4基本相同，區別在于，所述步驟(2)的細胞生長液中的生長促進劑由硫酸角質素和活性礦物酵母多肽以1:0.15的質量比組成。實施例5病毒含量測定分別對實施例3-4、對比例1-4收獲的病毒液進行病毒含量測定，具體為：將病毒液用dmem培養液做10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95個稀釋度接種48孔鋪滿單層lmh細胞培養板，每個稀釋度重復5孔，同時設立陰性對照細胞孔；每孔0.1ml，37℃吸附30min后，補加細胞維持液0.3ml，于37℃、5％co2培養120小時，觀察細胞病變(cpe)，計算tcid50，結果見表3。表3病毒滴度檢測結果組別病毒含量(tcid50/ml)實施例3107.2實施例4107.4對比例1105.2對比例2105.6對比例3106.0對比例4106.1由上表3可知，本發明實施例3-4用bhk-21細胞生產豬偽狂犬ge基因缺失病毒的滴度較高，均≥107.2tcid50/ml，明顯優于對比例1-4收獲的豬偽狂犬ge基因缺失病毒滴度，表明以硫酸角質素寡聚糖和活性礦物酵母多肽組成的生長促進劑有利于bhk-21細胞的生長，促進病毒在細胞繁殖。實施例6豬偽狂犬ge基因缺失病毒滅活疫苗的制備(1)病毒液濃縮分別將實施例3-4、對比例1-4收獲的病毒液通過50k的中空纖維柱超濾濃縮10倍，即得病毒濃縮液；(2)病毒液滅活將病毒濃縮液導入滅活罐內，加入福爾馬林溶液，充分混合，福爾馬林溶液的終濃度為0.1％(v/v)，37℃滅活16小時(以罐內溫度達到37℃開始計時)后取出，置6℃保存，應不超過1個月；(3)病毒液滅活檢驗：取滅活檢驗的樣品，用dmem營養液以10-1、10-2、10-3三個比例稀釋待檢樣品，同時設立同樣稀釋比例的滅活前病毒樣品用于陽性對照，分別接種于48孔lmh細胞單層細胞，每組重復接種5孔，每孔0.4ml37℃、5％co2培養96小時。滅活樣品各組稀釋度孔中均沒有出現細胞病變，陽性對照組各稀釋度孔中細胞病變均明顯，達80％以上，判定為滅活檢驗合格；(4)病毒液除菌將滅活檢驗合格的濃縮液使用過濾精度為0.45μm的筒式濾芯精濾，再用過濾精度為0.20μm的筒式濾芯過濾除菌，即得疫苗抗原；(5)疫苗成品制備①油相制備：取優質注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司盤-804份，先將白油緩慢加溫，加入司盤-80和硬脂酸鋁，邊攪邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌備用；②水相制備：取實施例4制得的禽腺病毒4型滅活疫苗抗原96份加入滅菌后的吐溫-804份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，制成水相；③乳化：將水相加入到油相中，利用ika乳化劑進行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即可；④分裝：將制備的疫苗按照每瓶250ml進行分裝。實施例7滅活疫苗成品檢驗(1)性狀①外觀：為乳白色乳劑。②劑型：油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不擴散。③穩定性：吸取疫苗10毫升加入離心管中，以3000rpm離心15分鐘，管底析出的水相應≤0.5ml。④粘度：用出口內徑為1.2mm的1.0ml吸管，吸取25℃左右1.0ml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需的時間，應不超過8秒。(2)無菌檢驗：取成品接種硫乙醇酸鹽培養基小管和酪胨瓊脂各兩支，每支0.2ml，一支置37℃培養，一支置25℃培養，觀察3～5日，應純粹，無菌生長。(3)安全檢驗：用21日齡健康仔豬10頭，每頭頸部注射疫苗2ml，觀察14日，結果試驗仔豬均健活，無任何局部和全身不良反應。(4)甲醛含量測定：①對照品溶液的制備：取已標定的甲醛溶液適量，配成每1.0ml含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0ml置50ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。②被測樣本的制備：用5.0ml刻度吸管量取被檢品5.0ml，置50ml量瓶中，用20％吐溫-80乙醇溶液10ml，分次洗滌吸管，洗液并入50ml量瓶中，搖勻，加水稀釋至刻度，強烈振搖，靜止分層，下層液如果不澄清，濾過，棄去初濾液，取澄清續濾液，即得。③測定法：精密吸取對照品溶液和被檢品溶液各0.5ml，分別加醋酸-醋酸銨緩沖液10ml，乙酰丙酮試液10ml，置60℃恒溫水浴15分鐘，冷水冷卻5分鐘，放置20分鐘后，按紫外-可見分光光度計法，在410nm的波長處測定吸收度，計算即得。甲醛溶液(40％)含量％(g/ml)＝0.25×(被檢樣品溶液的吸收度/對照樣本溶液的吸收度)×100％。甲醛含量符合國家標準，即檢驗合格。(5)裝量檢查：取供試品3個，使之恢復至室溫，開啟時注意避免損失。參照裝量檢查使用量取參考表，用經標化的吸管、注射器或量筒進行裝量檢查。試驗例一、免疫原性試驗分別使用實施例3-4和對比例1-4收獲的病毒液制得的成品疫苗進行抗體誘導試驗和攻讀試驗，具體為：篩選21日齡健康仔豬(豬偽狂犬中和抗體＜1:4)56頭，隨機分為對照組、實施例3-4組、對比例1-4組，每組8頭。其中，對照組中每頭豬肌肉或頸部皮下注射2mlpbs，實施例3-4組和對比例1-4組中每頭豬分別肌肉或頸部皮下注射2ml實施例3-4和對比例1-4收獲的病毒液制得的成品疫苗，免疫后28天后，各組分別采血、分離血清后，于56℃滅活30min用于中和抗體測定，并采用idexxprvge-eilsa抗體檢測試劑盒檢測ge抗體。同時采用prv-zj01細胞毒(106.0tcid/ml)對各組的仔豬進行攻毒，滴鼻1ml/頭，觀察攻毒后各組仔豬的臨床表現，其結果見下表4-5。表4各組仔豬血清中中和抗體和ge抗體的檢測結果組別中和抗體效價ge抗體實施例31:24.8-實施例41:25.0-對比例11:9.0-對比例21:11.6-對比例31:12.8-對比例41:13.0-對照組＜1:4-表5各組仔豬免疫效力的檢測結果由上表4和5可知，本發明實施例3、4制得的成品疫苗具有較強的免疫原性，可誘導仔豬體內產生較多的中和抗體，其血清中檢測的中和抗體效價分別為1:24.8和1:25.0，顯著高于對比例1-4制得的成品疫苗；對免疫仔豬進行攻毒試驗的結果表明，本發明實施例3和4制得的成品疫苗對仔豬的免疫保護率達到100％，完全達到疫苗效力評價標準。以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，上述優選實施方式不應視為對本發明的限制，本發明的保護范圍應當以權利要求所限定的范圍為準。對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明的精神和范圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁12