用于通過使用已缺失BST2基因功能的細胞系來促進病毒感染和增加病毒產生的方法與流程

本發明涉及通過使用缺失Bst2基因功能的細胞系來促進病毒感染和病毒產生的方法且更具體地涉及從能產生病毒的細胞去除Bst2基因由此促進病毒從細胞的釋放、抑制細胞的凋亡、促進對細胞的病毒感染和增加細胞中的病毒產生的方法。

背景技術：

當病毒感染身體時，在受感染的細胞中發生病毒增殖且所增殖的病毒顆粒經細胞膜出芽以感染其它周圍的細胞。在細胞針對病毒感染的一些防御機制中，Bst2(tetherin)蛋白在細胞膜中表達。Bst2蛋白在N末端和C末端均具有膜結合位點且由此在細胞膜中以中間抬起(像一座橋)的形式表達。Bst2的C末端位于細胞膜的脂筏區即其中發生受體激活的特定區域且N末端位于非脂筏區。當病毒從脂筏區出芽至細胞外時，Bst2蛋白通過其固定于非脂筏區的區域來抑制病毒顆粒通過細胞膜。對于哺乳動物細胞的這種防御機制，一些病毒產生促進Bst2蛋白降解的蛋白從而逃避宿主細胞的此種機制。這反過來表明Bst2基因的功能強效地促進對病毒產生的抑制。

迄今，為了產生病毒以生產疫苗，已使用將病毒種接種至受精的雞蛋中并培養接種的病毒的方法(KR 2012-0103737A)。然而，這種方法由于一些問題而非常低效，所述問題包括引起過敏、受精的雞蛋的供應安全性和病毒傳播。在嘗試克服此類問題的過程中已使用通過動物細胞培養來生產病毒疫苗的方法(KR 2012-0033334A)。這些方法包括通過在無菌條件下培養大量動物細胞并用病毒感染所培養的動物細胞來生產疫苗的方法、通過遺傳工程方法僅產生使針對病原體的抗體得以產生的抗原的方法等。通過動物細胞培養來生產疫苗的方法的最大優點是可擴大生產規模。具體地，生產規模可根據用作疫苗生產原料的動物細胞的培養規模來按需擴大。

然而，盡管有這么多優點，但是通過動物細胞培養來生產疫苗不是容易實現的。這是因為每單位體積的產量是較低的。為了在使用動物細胞來生產疫苗時克服每單位體積的低產量，嘗試了使用遺傳工程技術來開發優異的宿主動物細胞系(Jang J.等人,Appl.Microbiol.Biotechnol 85:1509-1520,2010)，但是此類嘗試仍然處于不足的水平。因此，為了優化病毒產生，需要鑒定病毒產生細胞系、改善培養條件和改善感染條件。

在先前研究中，本發明人發現當能產生病毒的細胞系中的Bst2基因的功能喪失時，病毒從細胞系的釋放得以促進，使得產生病毒的能力增加且宿主細胞的凋亡得以抑制，使得病毒產生細胞系的穩定性增加(WO 2014142433)。

因此，本發明人已進行了大量努力以找到用于通過提高用于使用動物細胞系生產疫苗的靶病毒的產量來產生病毒和產生病毒抗原性蛋白的最佳方法且由此已發現若去除動物細胞系中的Bst2蛋白，則會促進病毒從動物細胞系的釋放，會抑制宿主細胞的凋亡，會顯著促進宿主細胞的病毒感染并會增加靶病毒的產生，從而完成本發明。

技術實現要素：

技術問題

本發明的目的是提供用于促進靶病毒感染的方法，該方法包括用靶病毒感染缺失Bst2基因功能且能產生病毒的細胞系。

本發明的另一個目的是提供用于增加靶病毒產生的方法，該方法包括：用靶病毒感染缺失Bst2基因功能且能產生病毒的細胞系；及培養所感染的細胞系。

本發明的另一個目的是提供用于產生抗原性蛋白的方法，該方法包括：用靶病毒感染缺失Bst2基因功能且能產生病毒的細胞系；及培養所感染的細胞系。

本發明的另一個目的是提供用于生產針對病毒性疾病的疫苗的方法，該方法包括使用通過上述方法產生的病毒抗原性蛋白。

技術方案

為了實現上述目的，本發明提供用于促進靶病毒感染的方法，該方法包括用靶病毒感染缺失Bst2基因功能且能產生病毒的細胞系。

本發明還提供用于增加靶病毒產生的方法，該方法包括：用靶病毒感染缺失Bst2基因功能且能產生病毒的細胞系；及培養所感染的細胞系。

本發明還提供用于產生抗原性蛋白的方法，該方法包括以下步驟：用靶病毒感染缺失Bst2基因功能且能產生病毒的細胞系；及培養所感染的細胞系。

本發明還提供用于生產針對病毒性疾病的疫苗的方法，該方法包括使用通過上述方法產生的病毒抗原性蛋白。

附圖說明

圖1顯示了先后通過PCR和電泳來鑒定缺失Bst2基因功能的細胞系(A：MDCK細胞系；B：Vero細胞系)中的突變的結果。

圖2顯示了在野生型細胞系和缺失Bst2基因功能的細胞系之間對感染性進行比較的結果，其以MOI的函數表示。

圖3顯示了在野生型細胞系和缺失Bst2基因功能的細胞系之間對感染性進行比較的結果，其以感染時間的函數表示。

圖4顯示了在野生型Vero細胞系和缺失Bst2基因功能的G-D5細胞系之間對胞內病毒抗原性蛋白在總細胞裂解物中的增加進行比較的結果。

圖5顯示了在野生型Vero細胞系和缺失Bst2基因功能的G-D5細胞系之間對每個培養孔和每個細胞的胞內病毒抗原性蛋白的增加進行比較的結果(A：每個培養孔的病毒抗原性蛋白；B：每個細胞的病毒抗原性蛋白)。

圖6顯示了在野生型MDCK細胞系和缺失Bst2基因功能的J-D10細胞系之間對胞內病毒抗原性蛋白在總細胞裂解物中和在每個細胞中的增加進行比較的結果(A：總細胞裂解物中的病毒抗原性蛋白；B：每個細胞的胞內病毒抗原性蛋白)。

圖7顯示了在缺失Bst2基因功能的人293T細胞系中對病毒抗原性蛋白的增加進行比較的結果。

具體實施方式

除另有定義外，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員通常理解相同的含義。通常，本文使用的命名法和下述實驗方法是在本領域中公知和常用的那些。

本發明已發現當去除動物細胞系中的Bst2蛋白時，促進病毒從動物細胞系的釋放，抑制宿主細胞的凋亡，顯著促進宿主細胞的病毒感染且增加靶病毒和抗原性蛋白的產生。

根據本發明的方法產生的細胞系的特征在于與野生型宿主細胞相比，即使使用較少量的病毒和較短的感染時間，其也容易被病毒感染且其產量比野生型宿主細胞大的感染病毒的蛋白質。另外，根據本發明的方法產生的細胞系的特征在于與野生型細胞系相比，感染后在細胞系中產生的病毒較容易從細胞釋放且感染病毒的細胞是針對凋亡具有抗性的可在延長的時段內產生病毒的穩定的細胞。因此，根據本發明用于促進靶病毒感染和增加靶蛋白產生的方法能增加病毒和抗原性蛋白的產量且由此可用于生產用于預防或治療病毒性疾病的疫苗。

在一個方面，本發明涉及用于促進靶病毒感染的方法，該方法包括用靶病毒感染缺失Bst2基因功能且能產生病毒的細胞系。

在本發明中，用于促進病毒感染的方法增加用靶病毒感染的比例且由此能在不存在適于培養病毒的細胞系時用于開發針對病毒性疾病的新疫苗。

在一個方面，本發明涉及用于增加靶病毒產生的方法，該方法包括：用靶病毒感染缺失Bst2基因功能且能產生病毒的細胞系；及培養所感染的細胞系。

在本發明中，“增加靶蛋白的產生”是指增加病毒蛋白即抗原性蛋白的絕對產生。

在另一個方面，本發明涉及用于產生抗原性蛋白的方法，該方法包括：用靶病毒感染缺失Bst2基因功能且能產生病毒的細胞系；及培養所感染的細胞系。

在本發明中，用于促進靶病毒感染的方法和用于增加感染病毒產生的方法所具有的優點在于它們能增加抗原性蛋白的產生和使純化抗原性蛋白的效率最大化。另外，根據本發明，通過病毒感染來抑制凋亡，從而可使抗原性蛋白產生中的細胞導入周期最小化且促進病毒顆粒釋放到培養基中，從而還可增加抗原性蛋白的絕對產生。

本文使用的術語“能產生”是指病毒感染宿主細胞，然后在細胞中增殖，使得病毒釋放到細胞外培養基中。

本文使用的術語“缺失功能”是指使細胞中Bst2基因的一個或多個核苷酸發生突變，由此促進病毒感染到宿主細胞中，增加所需病毒的產生，促進病毒釋放到細胞外培養基中并抑制宿主細胞的凋亡。

本文使用的術語“促進感染”是指使細胞中Bst2基因的一個或多個核苷酸發生突變，由此使少量病毒能在短時間內浸潤宿主細胞。

本文使用的術語“促進產生”是指使細胞中Bst2基因的一個或多個核苷酸發生突變，由此增加每個宿主細胞的病毒蛋白在細胞中的量。

本文使用的“抗原性蛋白”是指由感染病毒產生的抗原的總稱。這些蛋白質參與病毒的毒力或抗原性且宿主細胞可識別該情況，這顯示出對病毒感染的保護作用。流感病毒顆粒具有表面抗原，其被定義為16種(H1至H16)血凝素(HA)和9種(N1至N9)神經氨酸酶(NA)和S抗原(即主要被定義為核糖核蛋白NP抗原的抗原)并通過S抗原的血清學特異性分為A型、B型和C型。

本文使用的術語“凋亡”是指其中細胞主動消耗生物能ATP導致死亡的過程。凋亡包括細胞的收縮、DNA的規則切割和細胞膜的破碎，其在細胞由于異常細胞分裂、輻射、紫外線、細菌感染或病毒感染而不能維持其正常功能時被誘導。

本文使用的術語“病毒”是指可在人或動物中引起疾病的病毒。優選地，該術語是指流感病毒和皰疹病毒。更優選地，其是指選自P/H1N1、A/H1N1、A/H3N2和MHV68的一種病毒，但是不限于此。

在本發明中，病毒可為有包膜的病毒或裸病毒。在本文中，術語“裸病毒”是指僅由核酸、蛋白質或衣殼構成的病毒，而術語“有包膜的病毒”是指具有覆蓋衣殼的包膜的病毒。

在本發明中，病毒可為DNA病毒或RNA病毒。在本文中，DNA病毒是具有DNA作為其遺傳物質的病毒且其實例包括ssDNA、dsDNA(皰疹病毒)及環狀DNA病毒。RNA病毒是具有RNA作為其遺傳物質的病毒且其實例包括(-)ssRNA(流感病毒)、(+)ssRNA和dsRNA病毒。

在本發明中，能產生病毒的細胞系可不管其種類而使用，只要其用于開發用于預防或治療病毒性疾病的疫苗。優選地，可使用動物細胞系。更優選地，細胞系可為選自以下的任何一種：293T人細胞系、MDCK、Vero和小鼠成纖維細胞，但是不限于此。

用于本發明的MDCK(Madin-Darby犬腎)細胞是來源于犬腎的上皮樣細胞，而用于本發明的Vero細胞是來源于猴腎的細胞。這兩種類型的細胞系對于肝炎病毒、牛痘病毒和流感病毒是易感的且由此是在病毒產生和研究中最常用的。

在本發明中，缺失Bst2基因功能且能產生病毒的細胞系優選如下獲得：從Bst2基因的外顯子1區刪除一個或多個核苷酸或向Bst2基因的外顯子1區插入一個或多個核苷酸，所述Bst2基因的外顯子1區編碼Bst2蛋白的胞質域，但是不限于此。

在本發明中，突變細胞系如下產生：從Bst2基因的外顯子1區刪除或向Bst2基因的外顯子1區插入1-15個核苷酸，其如SEQ ID NO：1或2表示。

在本發明的一個實施例中，通過從MDCK細胞系的Bst2基因的外顯子1區刪除或向MDCK細胞系的Bst2基因的外顯子1區插入一個或多個核苷酸來產生10個突變細胞系，其包含突變的等位基因且具有增加的產生病毒的能力，其如SEQ ID NO：1表示。

[SEQ ID NO：1]

ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACTGACGAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG

在本發明的一個實施例中，通過從SEQ ID NO：1的位置45-54刪除或向SEQ ID NO：1的位置45-54插入1-10個核苷酸來產生缺失Bst2基因功能的突變細胞系。這些突變細胞系可包括具有SEQ ID NO：3-8和SEQ ID NO：17-21中任何一個核苷酸序列的細胞系并優選地可為K-E4、J-C10、J-D10、D-E2、K-G3、J-E2、H-G5、8-D8、14-F11和12-B8。

[SEQ ID NO：3]

ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACTGA--AGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG

[SEQ ID NO：4]

ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAAC--ACGAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG

[SEQ ID NO：5]

ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACT----AGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG

[SEQ ID NO：6]

ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACT---GAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG-3′

[SEQ ID NO：7]

ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAAC----GAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG

[SEQ ID NO：8]

ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACTGACGACGAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG

[SEQ ID NO：17]

atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataactgacctatgagagtcagagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga

[SEQ ID NO：18]

Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataactga---gtcagagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga

[SEQ ID NO：19]

Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataactga-gagtcagagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga

[SEQ ID NO：20]

Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataa----------agagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga

[SEQ ID NO：21]

Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccata---gacga---agagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga

在本發明的一個實施例中，分析了所產生的突變細胞系的核苷酸序列且由此在來自MDCK細胞的K-E4、J-C10、J-D10和14-F11細胞的等位基因中可觀察到移碼突變的發生。

本文使用的術語“移碼突變”是指刪除或插入1、2或更多個核苷酸(除3的倍數外)，其使能讀取3核苷酸基因密碼的移碼發生變化。

在突變細胞系中，J-D10以登錄號KCLRF-BP-00285保藏。

在本發明的另一個實施例中，通過從Vero細胞系的Bst2基因的外顯子1區刪除一個或多個核苷酸來產生2個突變細胞系，其包含突變的等位基因且具有增加的產生病毒的能力，其如SEQ ID NO：2表示。

[SEQ ID NO：2]

ATGGCACCTATTTTGTATGACTATTGCAAAATGCCCATGGATGACATTTGCAAGGAAGACAGGGACAAGTGCTGTAAACTGGCCGTAGGAATTCTGGGGCTCCTGGTCATAGTGCTTCTGGGGGTGCCCCTGATTTTCTTCATCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCAGGATGGCCTCCGGGCAGTGATGGAGTGTCACAATGTCACCTATCTCCTGCAACAAGAGCTGGCCGAGGCCCAGCGGGGCTTTCGGGACGCAGAGGCCCAGGCTGTCACCTGCAACCAGACTGTG

在本發明的一個實施例中，通過從SEQ ID NO：2的位置116-130刪除1-12個核苷酸來產生缺失Bst2基因功能的突變細胞系。這些突變細胞系可包括具有SEQ ID NO：9和10中任何一個核苷酸序列的細胞系且優選地可為D-D8和G-D5。

[SEQ ID NO：9]

ATGGCACCTATTTTGTATGACTATTGCAAAATGCCCATGGATGACATTTGCAAGGAAGACAGGGACAAGTGCTGTAAACTGGCCGTAGGAATTCTGGGGCTCCTGGTCATAGTGC------------CCCTGATTTTCTTCATCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCAGGATGGCCTCCGGGCAGTGATGGAGTGTCACAATGTCACCTATCTCCTGCAACAAGAGCTGGCCGAGGCCCAGCGGGGCTTTCGGGACGCAGAGGCCCAGGCTGTCACCTGCAACCAGACTGTG

[SEQ ID NO：10]

ATGGCACCTATTTTGTATGACTATTGCAAAATGCCCATGGATGACATTTGCAAGGAAGACAGGGACAAGTGCTGTAAACTGGCCGTAGGAATTCTGGGGCTCCTGGTCATAGTGCTTCTGGGGGTGCCCTGATTTTCTTCATCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCAGGATGGCCTCCGGGCAGTGATGGAGTGTCACAATGTCACCTATCTCCTGCAACAAGAGCTGGCCGAGGCCCAGCGGGGCTTTCGGGACGCAGAGGCCCAGGCTGTCACCTGCAACCAGACTGTG

在本發明的另一個實施例中，通過從293T人細胞系的Bst2基因的外顯子1區刪除或向293T人細胞系的Bst2基因的外顯子1區插入一個或多個核苷酸來產生3個突變細胞系，其包含突變的等位基因且具有增加的產生病毒的能力，其如SEQ ID NO：24表示。

[SEQ ID NO：24]

CCTGAAAGGGGTTTGCATTTAAGCCCCTCTGTCCCCAGGACCTAGGGAGGAGGCCCAGGTCCCAGGGGCAGCAGCCAAACTCCCCAGGCCAAAACCCCAGATTCTAACTCTTCTTAGATGGCCCTAATGGCTTCCCTGGATGCAGAGAAGGCCCAAGGACAAAAGAAAGTGGAGGAGCTTGAGGGTGAGAAAGGGAGAAGGGAGAGGGCCGGGGAGGGGTGAGTCAGGTATGGAAGAGGGGGTGGGGGCAGGGAGACCAGGGCTGGAGGTTGGGGTAAGGGGGAGGTTCTGTCCCAGAGTGGAGCAGGGCCCCAGCATGGCCACATGCTGACCCGCCCCCTGTTTCTGTCCTCCCACCCTACCAGGAGAGATCACTACATTAAACCATAAGCTTCAGGACGCGTCTGCAGAGGTGGAGCGACTGAGGTCAGAGATAGCCTTCCCCCGCTACCCTCCACCTGCCACATTCCTCTCACCCCCACATCCCTAGCCCAAGACCCAGGATCTCCTTTGCTCCCAAAATCCCCATTGCCCCAAGGGATAAAGTTTGAGTCCCACAAAAGGATAACTTAGCCCCTAGGGTCACAGAGCCATGGGTGGCCGCTGTCCATTCCCTCCCCGGTGACTTGGATTGGGGCGGTGCGGGGGGAACTCCCGGGGGCGGTGGGCTTACAGGGAGGGCGGCAGGAGCCAGGACGAGCAGATGCCTGATTTGCCATCTGTACCGCAGAAGAGAAAACCAGGTCTTAAGCGTGAGAATCGCGGACAAGAAGTACTACCCCAGCTCCCAGGACTCCAGCTCCGCTGCGGCGCCCCAGCTGCTGATTGTGCTGCTGGGCCTCAGCGCTCTGCTGCAGTGA

在本發明的一個實施例中，通過從SEQ ID NO：24的位置51-100刪除或向SEQ ID NO：24的位置51-100插入3-27個核苷酸來產生缺失Bst2基因功能的突變細胞系。這些突變細胞系可包括具有SEQ ID NO：25-30中任何一個核苷酸序列的細胞系且優選地可為D-19、B4和B24。

[SEQ ID NO：25]

ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGA----------------------------GATAGGAATTC

[SEQ ID NO：26]

ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGCTTCTGCTGGGGATAGGAATTC------

[SEQ ID NO：27]

ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGCTTCtTGCTGGGGATAGGAATTC

[SEQ ID NO：28]

ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGC---------------------

[SEQ ID NO：29]

ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGCTTCTGCTGATAGGAATTC---

[SEQ ID NO：30]

ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAA--------TGGGGATAGGAATTC

在根據本發明使用缺失Bst2基因功能的細胞系來促進病毒感染和增加病毒產生的方法中，所使用的細胞數目可為1×10⁴至1×10⁷個，優選為5×10⁴至5×10⁶個，更優選為1×10⁵至1×10⁶個。

接種至細胞中的病毒優選在37℃在5％CO₂溫育箱中以0.0001-0.1的MOI進行感染，但是不限于此。可在新鮮培養基中將感染病毒培養36-72小時并可去除培養基。可在適當的條件下將剩余的細胞離心并可收集上清液并在4℃-15℃以1500-5000rpm離心15分鐘，然后收集上清液。

在本發明的一個實施例中，病毒抗原性蛋白如下產生：用靶病毒感染缺失Bst2基因功能且能產生病毒的細胞系，然后培養以增加靶病毒的產生。病毒抗原性蛋白可用于生產用于預防或治療病毒性疾病的疫苗。

因此，在另一個方面，本發明涉及用于生產針對病毒性疾病的疫苗的方法，該方法包括使用通過上述方法產生的病毒抗原性蛋白。

疫苗組合物還可含有藥用輔料或賦形劑。可使用任何輔料，只要其能用于在將輔料注射到體內時促進抗體形成以實現本發明的目的。具體地，可用于本發明的輔料優選為選自鋁(Al(OH)₃或AlPO₄)、角鯊烯、脫水山梨醇、聚山梨醇酯80、CpG、脂質體、膽固醇、單磷酰脂質(MPL)A和吡喃葡萄糖基脂A(GLA)中的至少一種，但是不限于此。

實施例

在下文中，將參考實施例進一步詳細地描述本發明。對于本領域技術人員來說顯而易見的是，這些實施例僅用于說明性目的，而不應該被解釋為限制本發明的范圍。

實施例1：缺失Bst2基因功能的細胞系

1-1：MDCK細胞系

將得自Moon-Jung Song教授(Korea University,Korea)的5×10⁵個野生型MDCK細胞在DMEM完全(GIBCO)培養基(含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、5Mβ-巰基乙醇、10μg/ml慶大霉素、50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素)中培養24小時。然后向所培養的細胞添加能結合至Bst2基因外顯子1區的一對TALEN載體(ToolGen,Korea)、一個報告載體(ToolGen,Korea)和Turbofect試劑的15μg混合物，然后將其在37℃和5％CO₂的條件下溫育48小時。通過FACS Aria(BD Bioscience)對所培養的細胞進行打分以選擇500個對GFP和RFP均為陽性的細胞并將所選擇的細胞接種于96孔板中，由此獲得單克隆細胞。

為了確認所獲得的單克隆細胞中的突變，提取基因組DNA并使用如SEQ ID NO:11表示的dBst2-F引物和如SEQ ID NO:12表示的dBst2-R引物在以下條件下進行聚合酶鏈式反應(PCR)：95℃5分鐘，然后25個循環，每個循環由94℃30秒、60℃30秒和72℃1分鐘構成，然后72℃10分鐘。將反應產物稀釋至10^-3并使用如SEQ ID NO:13表示的NdBst2-F引物和如SEQ ID NO:14表示的NdBst2-F引物在以下條件下進行PCR：95℃5分鐘，然后25個循環，每個循環由94℃30秒、60℃30秒和72℃1分鐘構成，然后72℃10分鐘。

[SEQ ID NO:11]

5′-GGTCAGGATGGCTCCTATGC-3′

[SEQ ID NO:12]

5′-AACCTGACAGGGTCACCTGG-3′

[SEQ ID NO:13]

5′-GTAGCCCCAGCCAAAGGTTTC-3′

[SEQ ID NO:14]

5′-AGGCCTCCCCATGCCCAAAC-3′

反應產物的大小通過電泳來分析。結果顯示在外顯子1區中具有如SEQ ID NO:1表示的推定突變的細胞系具有正常的PCR反應產物大小及由于核酸內切酶切割而產生的兩個額外條帶，這說明在外顯子1區中發生了突變(圖1A)。

為了對被確認具有突變的細胞系的核苷酸序列進行分析，用T7E1酶(ToolGen,Korea)處理的PCR反應產物用Bgl-Xba進行消化，與pUC18載體連接，然后在含有氨芐西林和X-gal-IPTG的培養基中培養，由此獲得白色群落。在所獲得的白色群落中，對于每個克隆選擇6個群落并測序。

結果顯示在Bst2基因的外顯子1區中具有核苷酸的刪除或插入的7個突變細胞系(K-E4、J-C10、J-D10、D-E2、K-G3、J-E2和H-G5)中，3個突變細胞系(K-E4、J-C10和J-D10)具有發生在等位基因對中的移碼突變。

1-2：Vero細胞系

將5×10⁵個野生型VERO細胞(University of Southern California,Chengyu Liang)在DMEM完全(GIBCO)培養基(含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、5Mβ-巰基乙醇、10μg/ml慶大霉素、50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素)中培養24小時。然后向所培養的細胞添加能結合至Bst2基因外顯子1區的一對TALEN載體(ToolGen,Korea)、一個報告載體(ToolGen,Korea)和Turbofect試劑(Thermo,USA)的15μg混合物，然后將其在37℃和5％CO₂的條件下溫育48小時。通過FACS Aria(BD Bioscience)對所培養的細胞進行打分以選擇500個對GFP和RFP均為陽性的細胞并將所選擇的細胞接種于96孔板中，由此獲得單克隆細胞。

為了確認所獲得的單克隆細胞中的突變，提取基因組DNA并使用如SEQ ID NO:11表示的dBst2-F引物和如SEQ ID NO:16表示的AGM-R引物在以下條件下進行聚合酶鏈式反應(PCR)：95℃5分鐘，然后25個循環，每個循環由94℃30秒、60℃30秒和72℃1分鐘構成，然后72℃10分鐘。將反應產物稀釋至10^-3并使用如SEQ ID NO:15表示的AGM-F引物和如SEQ ID NO:16表示的AGM-R引物在以下條件下進行PCR：95℃5分鐘，然后25個循環，每個循環由94℃30秒、60℃30秒和72℃1分鐘構成，然后72℃10分鐘。

[SEQ ID NO:15]

5′-GAGGGGGAGATCTGGATGG-3′

[SEQ ID NO:16]

5′-CTTCTCTGCATCCAGGGAAG-3′

反應產物的大小通過電泳來分析。結果顯示在外顯子1區中具有推定突變的兩個細胞系具有正常的PCR反應產物大小及由于核酸內切酶切割而產生的兩個額外條帶，這說明在外顯子1區中發生了突變(圖1B)。

對被確認具有突變的細胞系的核苷酸序列進行了分析且由此鑒定了在Bst2的外顯子1區中具有核苷酸的刪除或插入的2個突變細胞系(D-D8：雜合；及G-D5：敲除)。

1-3：成纖維細胞細胞系B2K

為了產生缺失Bst2的小鼠成纖維細胞細胞系(B2K)，將100μg MCA(3-甲基膽蒽)注射至24周齡Bst2敲除小鼠(ISU Abxis,Korea)的大腿中。約4個月后，分離在大腿中形成的腫瘤并用70％乙醇洗滌以去除細菌，然后將其轉移到含有10％FBS和RPMI培養基的皿中并使用外科剪刀切成細小碎塊。將腫瘤碎塊和13ml消化溶液(500單位/ml膠原酶IV、150單位/ml DNA酶I)置于50ml錐形管中并在振蕩器中以250rpm和37℃振蕩1小時30分鐘。將經振蕩的溶液用10ml移液管吹吸3-5次以使碎塊進一步分散，然后通過尼龍網過濾并置于50ml新鮮錐形管中。然后將所得溶液以1250rpm離心5分鐘且去除上清液，然后將團塊混懸在新鮮培養基中，通過尼龍網過濾并在上述條件下離心。去除上清液后，對團塊進行解離，以2.4×10⁷個細胞/10cm皿的密度接種并培養以獲得敲除腫瘤細胞系(B2K)。

同時，為了產生野生型腫瘤細胞系(MB19)，將100μg MCA(3-甲基膽蒽)注射到24周齡B6野生型小鼠(Orient Bio,Korea)的大腿中。約4個月后，分離在大腿中形成的腫瘤并用70％乙醇洗滌以去除細菌，然后將其轉移到含有10％FBS和RPMI培養基的皿中并使用外科剪刀切成細小碎塊。將腫瘤碎塊和13ml消化溶液(500單位/ml膠原酶IV、150單位/ml DNA酶I)置于50ml錐形管中并在振蕩器中以250rpm和37℃振蕩1小時30分鐘。將經振蕩的溶液用10ml移液管吹吸3-5次以使碎塊進一步分散，然后通過尼龍網過濾并置于50ml新鮮錐形管中。然后將所得溶液以1250rpm離心5分鐘且去除上清液，然后將團塊混懸在新鮮培養基中，通過尼龍網過濾并在上述條件下離心。去除上清液后，對團塊進行解離，以2.4×10⁷個細胞/10cm皿的密度接種并培養以獲得野生型腫瘤細胞系(MB19)。

將Bst2敲除腫瘤細胞系(B2K)和Bst2野生型腫瘤細胞系(MB19)各自的MHC類別(KbDb(R1.21.2)-APC、CD1d(1B1)-PE)、LFA-1(207)-Cyc和Bst2(e.Bio927)生物素+鏈霉親和素-PE進行熒光染色并比較其表達水平。

結果顯示MB19正常表達Bst2，而B2K腫瘤細胞系不表達Bst2。因此，在以下實施例中使用B2K腫瘤細胞系。

1-4：人293T細胞系

將5×10⁵個人293T細胞在DMEM完全(GIBCO)培養基(含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、5Mβ-巰基乙醇、10μg/ml慶大霉素、50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素)中培養24小時。然后向所培養的細胞添加能結合至Bst2基因外顯子1區的一個CRISPR載體(ToolGen,Korea)、一個報告載體(ToolGen,Korea)、Cas9載體和Fugene(Promega,USA)的18μg混合物，然后將其在37℃和5％CO₂的條件下溫育48小時。通過FACS Aria(BD Bioscience)對所培養的細胞進行打分以選擇500個對GFP和RFP均為陽性的細胞并將所選擇的細胞接種于96孔板中，由此獲得單克隆細胞。

為了確認所獲得的單克隆細胞中的突變，提取基因組DNA并使用如SEQ ID NO:22表示的HBst2-F1引物和如SEQ ID NO:23表示的HBst2-R1引物在以下條件下進行聚合酶鏈式反應(PCR)：95℃3分鐘，然后10個循環，每個循環由94℃30秒、72℃30秒和72℃45秒組成，然后25個循環，每個循環由95℃30秒、62℃30秒和72℃45秒組成。

[SEQ ID NO:22]

5’-TGG CAC GGC CTA GGC ACT CA-3’

[SEQ ID NO:23]

5’-GGA TAC TGA GGT CCC CGA TT-3’

反應產物的大小通過電泳來分析，然后分析了被確認具有突變的細胞系的核苷酸序列。由此鑒定了在Bst2的外顯子1區中具有核苷酸的刪除或插入的3個突變細胞系(D19等位基因1：刪除27個核苷酸，D19等位基因2：刪除6個核苷酸，B4等位基因1：插入1個核苷酸，B4等位基因2：刪除21個核苷酸，B24等位基因1：刪除3個核苷酸，B24等位基因2：刪除8個核苷酸)。

實施例2：促進對缺失Bst2基因的細胞系的感染

2-1：用低MOI的病毒進行感染

為了證實促進對缺失Bst2基因功能的細胞系的感染的作用，比較了病毒對缺失Bst2功能的細胞系的感染與病毒對野生型MDCK細胞系的感染。在該實施例中，使用各自包含突變等位基因的8-D8、14-F11和12-B8，其是具有發生在Bst2的外顯子1區中的移碼突變從而以與在實施例1中獲得的J-D10(登錄號KCLRF-BP-00285)細胞系相同的方式使Bst2基因的表達完全沉默的細胞系。8-D8、14-F11和12-B8的突變序列如SEQ ID NO:17-21表示。具體地，8-D8包含SEQ ID NO:17和18的突變等位基因；14-F11包含SEQ ID NO:19和20的突變等位基因；且12-B8包含SEQ ID NO:18和21的突變等位基因。

每種類型的野生型MDCK細胞和缺失Bst2功能的細胞(5×10⁴個細胞/孔)用已從0.001的MOD連續稀釋2倍的A/H3N2流感病毒感染30分鐘。然后去除培養基且用瓊脂糖覆蓋細胞層，然后使感染病毒生長48小時。

結果顯示缺失Bst2功能的細胞系以與野生型細胞系相同的效率感染，即使感染缺失Bst2功能的細胞系的病毒顆粒的數目為感染野生型細胞系的病毒顆粒的數目的約1/5(圖2)。這表明Bst2蛋白從宿主細胞的去除促進了病毒對宿主細胞的感染。

2-2：病毒感染時間的降低

每種類型的野生型MDCK細胞和缺失Bst2功能的細胞(5×10⁴個細胞/孔)用MOI為0.0001的A/H3N2流感病毒感染1分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘和1小時。然后去除培養基且用瓊脂糖覆蓋細胞層，然后使感染病毒生長48小時。

結果顯示缺失Bst2功能的細胞系中的斑塊形成在1分鐘時為3-6pfu/孔，這比野生型細胞系高1.8倍，在5分鐘時為6-10pfu/孔，這比野生型細胞系高1.7倍且在10分鐘時為9-14pfu/孔，這比野生型細胞系高約1.5倍(圖3)。在足夠的感染時間即20分鐘或更長時，斑塊形成在野生型MDCK細胞和缺失Bst2功能的細胞之間沒有差異。

這表明病毒可在較短的時間內較容易地穿透缺失Bst2功能的細胞且病毒對缺失Bst2功能的細胞系的感染性顯著高于野生型細胞系。因此，發現Bst2蛋白不但如先前報道的那樣抑制病毒的細胞外釋放，而且抑制病毒穿透進入宿主細胞。也就是說，Bst2的功能從細胞的去除使具有靶病毒的細胞的比例得以增加，由此促進靶病毒對細胞的感染。

實施例3：缺失Bst2基因功能的細胞系中胞內病毒蛋白量的增加

3-1：Vero和MDCK細胞系

為了證實缺失Bst2基因功能的細胞系中病毒抗原性蛋白產生的增加，在野生型Vero和MDCK細胞系及缺失Bst2功能的細胞系之間比較了病毒抗原性蛋白的產生。在該實施例中，使用在實施例1中得到的G-D5和J-D10(登錄號KCLRF-BP-00285)細胞系。

野生型Vero和MDCK細胞及缺失Bst2功能的細胞(5×10⁴個細胞/孔)用MOI為0.1的A/H3N2流感病毒感染30分鐘，然后將培養基更換為新鮮培養基，然后培養36-72小時。在每個時間點，去除釋放到培養基中的病毒且用PBS洗滌留在培養瓶底部的細胞，然后收獲，由此獲得細胞裂解物。將所獲得的細胞裂解物通過SDS-PAGE進行電泳，然后通過Western印跡用識別流感病毒HA蛋白的大片段的抗HA單克隆抗體進行分析。

結果顯示缺失Bst2基因功能的G-D5細胞中流感病毒蛋白的量在感染后36小時比野生型細胞大約5倍且在感染后72小時比野生型細胞大約15倍(圖5A)。還顯示缺失Bst2基因功能的J-D10細胞中流感病毒蛋白的量在感染后36小時大約57倍(圖6B)。

3-2：人293T細胞系

為了確認通過從人細胞去除Bst2基因的功能使病毒抗原性蛋白的產生得以增加的作用，在24孔板中用MOI為0.01的H3N2(A/Brisbane/10/2007)流感病毒感染Bst2基因敲除293T細胞(B4、B24和D19)(2.5×10⁵個細胞/孔)30分鐘，然后在新鮮培養基中培養2天。

Western印跡分析顯示Bst2基因敲除293T細胞中病毒蛋白的量顯著增加，如在Vero和MDCK細胞系中那樣(圖7)。

有效地實現了病毒從缺失Bst2基因功能的細胞系的釋放。因此，若病毒在缺失Bst2基因功能的細胞中的生長速率與在野生型細胞中的生長速率相同且若病毒從缺失Bst2基因功能的細胞的釋放比從野生型細胞的釋放快得多，則預期未從缺失Bst2基因功能的細胞釋放的胞內病毒的量比未從野生型細胞釋放的胞內病毒的量大得多。然而，從缺失Bst2基因功能的細胞釋放的病毒的量和剩余在所述細胞中的病毒的量也顯著增加。

因此，病毒從缺失Bst2基因功能的細胞的釋放和病毒在所述細胞中的生長都得以促進，這表明Bst2蛋白能抑制病毒在宿主細胞中的生長。也就是說，可促進靶病毒在缺失Bst2功能的細胞中的生長，從而能提高病毒和抗原性蛋白在其中的產生。

實施例4：每個缺失Bst2基因功能的細胞的胞內病毒蛋白的量的增加

在該實施例中，分析了每個缺失Bst2基因功能的細胞的胞內病毒抗原性蛋白的量。因為缺失Bst2基因功能的細胞的凋亡被有效地抑制，所以即使這些細胞被病毒感染(實施例3的結果)，在野生型細胞和缺失Bst2基因功能的細胞之間可存在細胞數目的差異，且因此分析了每個細胞的胞內病毒抗原性蛋白的量。

具體地，用MOI為0.1的A/H3N2流感病毒感染野生型Vero和MDCK細胞及缺失Bst2功能的突變細胞(5×10⁴個細胞/孔)30分鐘，然后將培養基更換為新鮮培養基，然后培養36-72小時。在每個時間點，去除釋放到培養基中的病毒且用PBS洗滌留在培養瓶底部的細胞，然后收獲，然后細胞裂解物的量為每個細胞(1×10⁶個細胞/ml)。對應于10⁴個細胞的細胞裂解物通過SDS-PAGE進行電泳，然后通過Western印跡用識別流感病毒HA蛋白的大片段的抗HA單克隆抗體進行分析。

結果顯示缺失Bst2基因功能的G-D5細胞中每個細胞的胞內流感病毒蛋白的量在感染后36小時是野生型細胞的約兩倍且在感染后72小時是野生型細胞的約17倍(圖5B)。還顯示缺失Bst2基因功能的J-D10細胞中每個細胞的胞內流感病毒蛋白的量在感染后36小時是野生型細胞的約7倍(圖6B)。

這表明包含在相同數目的細胞中的流感病毒的量在缺失Bst2基因功能的細胞中比在野生型細胞中大。因此，發現病毒在缺失Bst2基因功能的細胞系中的生長得以促進，這表明Bst2蛋白能抑制病毒在宿主細胞中的生長。也就是說，缺失Bst2功能的細胞能通過促進靶病毒在其中的生長而產量得以增加的病毒和蛋白質。

工業應用性

如上所述，通過使用缺失Bst2基因功能的動物細胞系來促進靶病毒感染和增加靶蛋白產生的本發明方法能增加靶病毒和抗原性蛋白的產量且由此可用于生產用于預防或治療病毒性疾病的疫苗。

雖然已參照具體特征而詳細描述了本發明，但是對于本領域技術人員來說顯而易見的是，該描述僅針對優選的實施方案且不限制本發明的范圍。因此，本發明的實質范圍將由所附權利要求書及其等同形式所定義。

序列表

<110> 易木農麥克斯有限公司(IMMUNOMAX CO., LTD.)

<120> 用于通過使用已缺失BST2基因功能的細胞系來促進病毒感染和增加病毒產生的方法

<130> PF-B1808

<140> PCT/KR2015/005493

<141> 2016-06-02

<150> 10-2014-0074027

<151> 2014-06-18

<150> 10-2014-0116245

<151> 2014-09-02

<160> 30

<170> PatentIn版本3.2

<210> 1

<211> 306

<212> DNA

<213> 狗

<400> 1

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca taactgacga gtcagagtca 60

atgtcatcaa gtcagaagct gagctggctg gagtggctgg gcatcttggg gatcccagtg 120

gtgatgggtc tgtctgtggc tctgatcatc tttgttgtca agaccaacag caaagcctgc 180

ggggatggcc tcctagtaga gcaggagtgt cacaatgtca ccagcctcct ggagcgccaa 240

ctaacccaaa cccggcaagc gttacagggg accatggacc aggctaccac ctgcaacaag 300

actgtg 306

<210> 2

<211> 294

<212> DNA

<213> 猴

<400> 2

atggcaccta ttttgtatga ctattgcaaa atgcccatgg atgacatttg caaggaagac 60

agggacaagt gctgtaaact ggccgtagga attctggggc tcctggtcat agtgcttctg 120

ggggtgcccc tgattttctt catcatcaag gccaacagcg aggcctgcca ggatggcctc 180

cgggcagtga tggagtgtca caatgtcacc tatctcctgc aacaagagct ggccgaggcc 240

cagcggggct ttcgggacgc agaggcccag gctgtcacct gcaaccagac tgtg 294

<210> 3

<211> 304

<212> DNA

<213> 狗

<400> 3

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca taactgaagt cagagtcaat 60

gtcatcaagt cagaagctga gctggctgga gtggctgggc atcttgggga tcccagtggt 120

gatgggtctg tctgtggctc tgatcatctt tgttgtcaag accaacagca aagcctgcgg 180

ggatggcctc ctagtagagc aggagtgtca caatgtcacc agcctcctgg agcgccaact 240

aacccaaacc cggcaagcgt tacaggggac catggaccag gctaccacct gcaacaagac 300

tgtg 304

<210> 4

<211> 304

<212> DNA

<213> 狗

<400> 4

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca taacacgagt cagagtcaat 60

gtcatcaagt cagaagctga gctggctgga gtggctgggc atcttgggga tcccagtggt 120

gatgggtctg tctgtggctc tgatcatctt tgttgtcaag accaacagca aagcctgcgg 180

ggatggcctc ctagtagagc aggagtgtca caatgtcacc agcctcctgg agcgccaact 240

aacccaaacc cggcaagcgt tacaggggac catggaccag gctaccacct gcaacaagac 300

tgtg 304

<210> 5

<211> 302

<212> DNA

<213> 狗

<400> 5

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca taactagtca gagtcaatgt 60

catcaagtca gaagctgagc tggctggagt ggctgggcat cttggggatc ccagtggtga 120

tgggtctgtc tgtggctctg atcatctttg ttgtcaagac caacagcaaa gcctgcgggg 180

atggcctcct agtagagcag gagtgtcaca atgtcaccag cctcctggag cgccaactaa 240

cccaaacccg gcaagcgtta caggggacca tggaccaggc taccacctgc aacaagactg 300

tg 302

<210> 6

<211> 303

<212> DNA

<213> 狗

<400> 6

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca taactgagtc agagtcaatg 60

tcatcaagtc agaagctgag ctggctggag tggctgggca tcttggggat cccagtggtg 120

atgggtctgt ctgtggctct gatcatcttt gttgtcaaga ccaacagcaa agcctgcggg 180

gatggcctcc tagtagagca ggagtgtcac aatgtcacca gcctcctgga gcgccaacta 240

acccaaaccc ggcaagcgtt acaggggacc atggaccagg ctaccacctg caacaagact 300

gtg 303

<210> 7

<211> 302

<212> DNA

<213> 狗

<400> 7

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca taacgagtca gagtcaatgt 60

catcaagtca gaagctgagc tggctggagt ggctgggcat cttggggatc ccagtggtga 120

tgggtctgtc tgtggctctg atcatctttg ttgtcaagac caacagcaaa gcctgcgggg 180

atggcctcct agtagagcag gagtgtcaca atgtcaccag cctcctggag cgccaactaa 240

cccaaacccg gcaagcgtta caggggacca tggaccaggc taccacctgc aacaagactg 300

tg 302

<210> 8

<211> 309

<212> DNA

<213> 狗

<400> 8

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca taactgacga cgagtcagag 60

tcaatgtcat caagtcagaa gctgagctgg ctggagtggc tgggcatctt ggggatccca 120

gtggtgatgg gtctgtctgt ggctctgatc atctttgttg tcaagaccaa cagcaaagcc 180

tgcggggatg gcctcctagt agagcaggag tgtcacaatg tcaccagcct cctggagcgc 240

caactaaccc aaacccggca agcgttacag gggaccatgg accaggctac cacctgcaac 300

aagactgtg 309

<210> 9

<211> 282

<212> DNA

<213> 猴

<400> 9

atggcaccta ttttgtatga ctattgcaaa atgcccatgg atgacatttg caaggaagac 60

agggacaagt gctgtaaact ggccgtagga attctggggc tcctggtcat agtgcccctg 120

attttcttca tcatcaaggc caacagcgag gcctgccagg atggcctccg ggcagtgatg 180

gagtgtcaca atgtcaccta tctcctgcaa caagagctgg ccgaggccca gcggggcttt 240

cgggacgcag aggcccaggc tgtcacctgc aaccagactg tg 282

<210> 10

<211> 293

<212> DNA

<213> 猴

<400> 10

atggcaccta ttttgtatga ctattgcaaa atgcccatgg atgacatttg caaggaagac 60

agggacaagt gctgtaaact ggccgtagga attctggggc tcctggtcat agtgcttctg 120

ggggtgccct gattttcttc atcatcaagg ccaacagcga ggcctgccag gatggcctcc 180

gggcagtgat ggagtgtcac aatgtcacct atctcctgca acaagagctg gccgaggccc 240

agcggggctt tcgggacgca gaggcccagg ctgtcacctg caaccagact gtg 293

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> dBst2-F引物

<400> 11

ggtcaggatg gctcctatgc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> dBst2-R引物

<400> 12

aacctgacag ggtcacctgg 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NdBst2-F引物

<400> 13

gtagccccag ccaaaggttt c 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NdBst2-R引物

<400> 14

aggcctcccc atgcccaaac 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> AGM-F引物

<400> 15

gagggggaga tctggatgg 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> AGM-R引物

<400> 16

aggcctcccc atgcccaaac 20

<210> 17

<211> 573

<212> DNA

<213> 狗

<400> 17

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca taactgacct atgagagtca 60

gagtcaatgt catcaagtca gaagctgagc tggctggagt ggctgggcat cttggggatc 120

ccagtggtga tgggtctgtc tgtggctctg atcatctttg ttgtcaagac caacagcaaa 180

gcctgcgggg atggcctcct agtagagcag gagtgtcaca atgtcaccag cctcctggag 240

cgccaactaa cccaaacccg gcaagcgtta caggggacca tggaccaggc taccacctgc 300

aacaagactg tggtgaccct gtcagcttcc ctggtgaagg agaaggcctg gggtcaggag 360

cagctcaccc gaggagagaa acttcaggga gagatcgaga cattgaagca gcagctgcag 420

gccgctttgg aggaggtgaa gcagctaaga gaagggaagg aggcctcaag caaggaaagg 480

gaaaccagct ccgtcagctc cttgaaggca ccccccggct ccgtggtggt ccccgtgtac 540

ctgctcctag gccttagggc tctgctggcc tga 573

<210> 18

<211> 564

<212> DNA

<213> 狗

<400> 18

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca taactgagtc agagtcaatg 60

tcatcaagtc agaagctgag ctggctggag tggctgggca tcttggggat cccagtggtg 120

atgggtctgt ctgtggctct gatcatcttt gttgtcaaga ccaacagcaa agcctgcggg 180

gatggcctcc tagtagagca ggagtgtcac aatgtcacca gcctcctgga gcgccaacta 240

acccaaaccc ggcaagcgtt acaggggacc atggaccagg ctaccacctg caacaagact 300

gtggtgaccc tgtcagcttc cctggtgaag gagaaggcct ggggtcagga gcagctcacc 360

cgaggagaga aacttcaggg agagatcgag acattgaagc agcagctgca ggccgctttg 420

gaggaggtga agcagctaag agaagggaag gaggcctcaa gcaaggaaag ggaaaccagc 480

tccgtcagct ccttgaaggc accccccggc tccgtggtgg tccccgtgta cctgctccta 540

ggccttaggg ctctgctggc ctga 564

<210> 19

<211> 566

<212> DNA

<213> 狗

<400> 19

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca taactgagag tcagagtcaa 60

tgtcatcaag tcagaagctg agctggctgg agtggctggg catcttgggg atcccagtgg 120

tgatgggtct gtctgtggct ctgatcatct ttgttgtcaa gaccaacagc aaagcctgcg 180

gggatggcct cctagtagag caggagtgtc acaatgtcac cagcctcctg gagcgccaac 240

taacccaaac ccggcaagcg ttacagggga ccatggacca ggctaccacc tgcaacaaga 300

ctgtggtgac cctgtcagct tccctggtga aggagaaggc ctggggtcag gagcagctca 360

cccgaggaga gaaacttcag ggagagatcg agacattgaa gcagcagctg caggccgctt 420

tggaggaggt gaagcagcta agagaaggga aggaggcctc aagcaaggaa agggaaacca 480

gctccgtcag ctccttgaag gcaccccccg gctccgtggt ggtccccgtg tacctgctcc 540

taggccttag ggctctgctg gcctga 566

<210> 20

<211> 557

<212> DNA

<213> 狗

<400> 20

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca taaagagtca atgtcatcaa 60

gtcagaagct gagctggctg gagtggctgg gcatcttggg gatcccagtg gtgatgggtc 120

tgtctgtggc tctgatcatc tttgttgtca agaccaacag caaagcctgc ggggatggcc 180

tcctagtaga gcaggagtgt cacaatgtca ccagcctcct ggagcgccaa ctaacccaaa 240

cccggcaagc gttacagggg accatggacc aggctaccac ctgcaacaag actgtggtga 300

ccctgtcagc ttccctggtg aaggagaagg cctggggtca ggagcagctc acccgaggag 360

agaaacttca gggagagatc gagacattga agcagcagct gcaggccgct ttggaggagg 420

tgaagcagct aagagaaggg aaggaggcct caagcaagga aagggaaacc agctccgtca 480

gctccttgaa ggcacccccc ggctccgtgg tggtccccgt gtacctgctc ctaggcctta 540

gggctctgct ggcctga 557

<210> 21

<211> 561

<212> DNA

<213> 狗

<400> 21

atggcaccta cgctttacca ctactactgg cctgtgccca tagacgaaga gtcaatgtca 60

tcaagtcaga agctgagctg gctggagtgg ctgggcatct tggggatccc agtggtgatg 120

ggtctgtctg tggctctgat catctttgtt gtcaagacca acagcaaagc ctgcggggat 180

ggcctcctag tagagcagga gtgtcacaat gtcaccagcc tcctggagcg ccaactaacc 240

caaacccggc aagcgttaca ggggaccatg gaccaggcta ccacctgcaa caagactgtg 300

gtgaccctgt cagcttccct ggtgaaggag aaggcctggg gtcaggagca gctcacccga 360

ggagagaaac ttcagggaga gatcgagaca ttgaagcagc agctgcaggc cgctttggag 420

gaggtgaagc agctaagaga agggaaggag gcctcaagca aggaaaggga aaccagctcc 480

gtcagctcct tgaaggcacc ccccggctcc gtggtggtcc ccgtgtacct gctcctaggc 540

cttagggctc tgctggcctg a 561

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HBst2-F1引物

<400> 22

tggcacggcc taggcactca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HBst2-R1引物

<400> 23

ggatactgag gtccccgatt 20

<210> 24

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人

<400> 24

atggcatcta cttcgtatga ctattgcaga gtgcccatgg aagacgggga taagcgctgt 60

aagcttctgc tggggatagg aattctggtg ctcctgatca tcgtgattct gggggtgccc 120

ttgattatct tcaccatcaa ggccaacagc gaggcctgcc gggacggcct tcgggcagtg 180

atggagtgtc gcaatgtcac ccatctcctg caacaagagc tgaccgaggc ccagaagggc 240

tttcaggatg tggaggccca ggccgccacc tgcaaccaca ctgtggtaag ctcctcaact 300

cctttggatg gcctagtact aggcggtggg agggacaaga atctctcccc agaaatctga 360

cccagggtgg gtctccaggg agatgcaggg gaggtcctga aactgctcct gggcccccac 420

atcaagggac ctaggttccc ctaccagggt ttgtgggccc ctaacccagt ccagggcact 480

ggtgtagggg cagggtgtta aaactctcca gatcccccaa atcggggacc tcagtatccc 540

cctgggactt aggtgaattt ataaattctt tccagggcac tggtgtcggg ggccttgaaa 600

ctcctcgtgg gcaccagtcc tgggggagta gaaatcccta ttcagggttg aagggggacc 660

tcaccagacc ctgaaaaagg gggcttttga aattttcact tcatccctaa gaaactgaaa 720

tattcacctg ggtcctgata tgggggatct tgaaactctc gctgggcatg tcacttgggc 780

ggggaaatcc cactgcattc tggatttggt agggccctct aacttttctt gggccattgc 840

tcaggcaatc tggaaatgtc cactaaactt tggttatcga tagcctccaa gtttccacgt 900

ggggtggcct caaaactccc attttgagga cccacatgct tatgggtggc cctgggagag 960

tgtgtggttg tggctgttct ttaaggttgg agaccatggt gcagagaggg ttggaagaaa 1020

acctgaaagg ggtttgcatt taagcccctc tgtccccagg acctagggag gaggcccagg 1080

tcccaggggc agcagccaaa ctccccaggc caaaacccca gattctaact cttcttagat 1140

ggccctaatg gcttccctgg atgcagagaa ggcccaagga caaaagaaag tggaggagct 1200

tgagggtgag aaagggagaa gggagagggc cggggagggg tgagtcaggt atggaagagg 1260

gggtgggggc agggagacca gggctggagg ttggggtaag ggggaggttc tgtcccagag 1320

tggagcaggg ccccagcatg gccacatgct gacccgcccc ctgtttctgt cctcccaccc 1380

taccaggaga gatcactaca ttaaaccata agcttcagga cgcgtctgca gaggtggagc 1440

gactgaggtc agagatagcc ttcccccgct accctccacc tgccacattc ctctcacccc 1500

cacatcccta gcccaagacc caggatctcc tttgctccca aaatccccat tgccccaagg 1560

gataaagttt gagtcccaca aaaggataac ttagccccta gggtcacaga gccatgggtg 1620

gccgctgtcc attccctccc cggtgacttg gattggggcg gtgcgggggg aactcccggg 1680

ggcggtgggc ttacagggag ggcggcagga gccaggacga gcagatgcct gatttgccat 1740

ctgtaccgca gaagagaaaa ccaggtctta agcgtgagaa tcgcggacaa gaagtactac 1800

cccagctccc aggactccag ctccgctgcg gcgccccagc tgctgattgt gctgctgggc 1860

ctcagcgctc tgctgcagtg a 1881

<210> 25

<211> 61

<212> DNA

<213> 人

<400> 25

atggcatcta cttcgtatga ctattgcaga gtgcccatgg aagacgggga gataggaatt 60

c 61

<210> 26

<211> 85

<212> DNA

<213> 人

<400> 26

atggcatcta cttcgtatga ctattgcaga gtgcccatgg aagacgggga taagcgctgt 60

aagcttctgc tggggatagg aattc 85

<210> 27

<211> 86

<212> DNA

<213> 人

<400> 27

atggcatcta cttcgtatga ctattgcaga gtgcccatgg aagacgggga taagcgctgt 60

aagcttcttg ctggggatag gaattc 86

<210> 28

<211> 64

<212> DNA

<213> 人

<400> 28

atggcatcta cttcgtatga ctattgcaga gtgcccatgg aagacgggga taagcgctgt 60

aagc 64

<210> 29

<211> 82

<212> DNA

<213> 人

<400> 29

atggcatcta cttcgtatga ctattgcaga gtgcccatgg aagacgggga taagcgctgt 60

aagcttctgc tgataggaat tc 82

<210> 30

<211> 77

<212> DNA

<213> 人

<400> 30

atggcatcta cttcgtatga ctattgcaga gtgcccatgg aagacgggga taagcgctgt 60

aatggggata ggaattc 77