免疫結合物的制備和使用的制作方法

專利名稱：：免疫結合物的制備和使用的制作方法
背景技術：
：1.發明的領域本發明涉及診斷和治療上有用的新穎的免疫結合物。本發明特別涉及包含一種抗體片斷的免疫結合物，這種抗體片斷通過抗體片斷輕鏈可變區上的碳水化合物部分共價結合于診斷和治療劑上。本發明還涉及包含一種抗體部分的免疫結合物，這種抗體部分是在輕鏈可變區含糖基化部位的完整抗體，這種糖基化部位是通過使編碼輕鏈的核苷酸序列突變而引入抗體的。本發明還進一步涉及制備這種結合物的方法。本發明還涉及使用這種結合物的診斷和治療方法。2.相關技術單克隆抗體可結合于各試劑以形成免疫結合物，用于診斷和治療。這些試劑包括螯合劑，它們使免疫結合物與放射性同位素形成穩定的結合，及細胞毒劑，例如毒素和化學治療藥物。例如，全身給藥通常對病人毒性太大的細胞毒劑可偶聯于抗癌抗體，其偶聯方式使其毒性效應僅僅針對載有靶抗原的腫瘤細胞。免疫結合物的診斷或治療效能取決于幾種因素。在這些因素中，診斷或治療劑與抗體的摩爾比和免疫結合物的抗體結合活性是較重要的。研究者們發現，可直接與抗體連接的診斷或治療劑的最大數量受抗體分子上可變位點的數目和抗體免疫反應性的丟失的限制。例如，Kulkarni等(CancerResearch412700-2706，1981)報道了可結合到抗體上而不明顯降低抗原結合活性的藥物分子的數目有一個限度。Kulkarni等發現，甲氨喋呤所獲得的最高結合為每分子抗體約十分子甲氨喋呤，嘗試將藥物-抗體分子比遞增超過十則降低了免疫結合物的得率，并損害了抗體活性。Kanellos等(JNCI75319-329，1985)報告了類似的結果。為了獲得高的藥物-免疫結合物置換水平，又不明顯降低抗原結合活性，研究者們研究了水溶性聚合物分子作為藥物間接結合中介物的應用。這樣的聚合物包括氧化葡聚糖(Arnonetal.，Immunol.Rev.625-27(1982))、聚谷氨酸(Greenfieldetal.，AntibodyImmunoconjugatesandRadiopharmaceuticals2201-216(1989))、人血清白蛋白(Baldwinetal.，NCIMonographs395-99(1987))和羧甲基葡聚糖(Schechteretal.，CancerImmunol.Immunother.25225-230(1987))。Shih等(Int.J.Cancer41832-839(1988))描述了位點特異性偶聯方法，這種方法中，甲氨喋呤經氨基葡聚糖偶聯到抗體恒定區或“Fc”區的碳水化合物部分上，產生置換比例高并保持免疫反應性的免疫結合物。晚近，Shih等(Int.J.Cancer461101-1106，1990)證明了包含經氨基葡聚糖結合到單克隆抗體的Fc區碳水化合物部分上的5-氟脲嘧啶的免疫結合物的效能。在這兩個研究中，Shih等都發現了免疫結合物包含每分子免疫球蛋白有約30-50個分子的藥物。從而，診斷或治療劑與抗體Fc區碳水化合物部分的間接結合提供了獲得具有功能性抗原結合活性和高置換水平的免疫結合物的方法。用Fc區上的碳水化合物部分作為位點特異性結合位點的優點是所有亞型的抗體都典型地含糖基化的Fc區。一般地說，抗體分子在其Fc區在按其同型的特征位置上進行糖基化。例如，如Shih等所證實的，在IgG分子Fc區的CH2區域氨基酸297上典型地存在碳水化合物。在遠離抗原結合位點的這個位置上，診斷或治療劑與碳水化合物部分的結合對所得免疫結合物的免疫反應性產生的效應應為最小。但是，用Fc區的碳水化合物部分作為結合位點的缺點是免疫結合需要完整的抗體。抗體片斷，特別是Fab、Fab′、F(ab′)2的使用比完整抗體的使用具有優點，因為片斷能更好地從毛細血管擴散出來，進入靶組織。例如，見Brown，“ClinicalUseofMonoclonalAntibodies，”inBIOTECHNOLOGYANDPHARMACY，Pezzutoetal.，eds.Chapman&Hall，pp.227-249(1993)。此外，抗體片斷確比完整抗體更容易從血液和正常組織清除。例如，完整鼠IgG血液半衰期為約30小時，而F(ab′)2和Fab/Fab′半衰期分別為約20小時和2小時(同上)。因此，使用抗體片斷構建免疫結合物是有利的。在放射免疫治療和放射免疫診斷的應用上，抗體片斷特別有利，在這些情況下，正常組織暴露于放射性同位素必須是最小限度的。抗體可變區不經常含有能為從抗體片斷制備免疫結合物提供潛在結合位點的碳水化合物部分。例如，在約15-25％鼠可變區鑒別出天冬酰胺偶聯的碳水化合物受體序列。見Kabatetal.，SEQUENCESOFPROTEINSOFIM-MUNOLOGICALINTEREST，5thed.U.S.DepartmentofHealthandHu-manServices(1990)。在抗葡聚糖族抗體的情況下，糖基化位點存在于重鏈可變區的互補決定區(CDRs)，特別是CDR2(同上)。這些抗體的CDRs上Asn偶聯的碳水化合物的存在看來增強了抗原結合。見Wallicketal.，J.Exp.Med.1681099-1109(1988)；Wrightetal.，EMBOJ.102717-2723(1991)。然而，通過位點導向誘變在CDR2引入外加的碳水化合物結合位點，根據引入糖基位點的位置不同而導致對抗原親和力的增強或減小(Wright等，同上)。因此，診斷或治療劑與VHCDR區碳水化合物部分結合的可行性是不確定的。本發明者對碳水化合物結合的研究證明，Pawlak-Byczkowska等(CancerRes.494568-4577(1989))和Goldenberg等(J.Clin.Oncol.9548(1991))所描述的IgG抗體，鼠單克隆抗體LL2具有高結合效能。在還原條件下用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行的LL2結合物分析表明，在LL2抗體的輕鏈可變(VL)區存在糖基化位點。將LL2的VL區克隆化后，在VL區骨架1(FR1)序列的18-20位上發現Asn偶聯的糖基化位點。這些研究提示，在VL區內的碳水化合物部分上可能有優先結合。這一意想不到的發現可解釋為VL區易接近性改善。我們用位點導向誘變除去Asn偶聯的糖基化位點，發現所得到的蛋白質顯示與原來的抗體類似的免疫反應性。這一結果與發明者們的計算機模擬研究相一致，后者提示在輕鏈FR1碳水化合物部分和抗原結合位點之間可忽略的或最小限度的相互作用。這些研究表明，診斷或治療劑與VL區FR1序列碳水化合物部分的結合提供了獲得具有功能性抗原結合活性的抗體片斷免疫結合物的方法。本發明提供制備包含診斷或治療劑的新穎免疫結合物的方法，這些診斷或治療劑經輕鏈可變區的碳水化合物部分結合于完整抗體或其抗原結合片斷上。發明概述本發明涉及突變重組抗體或抗體片斷，在所述抗體或抗體片斷的輕鏈約18位上具有非天然Asn糖基化位點。本發明還涉及制備糖基化突變重組抗體或抗體片斷的方法，包括以下步驟(a)培養表達和糖基化含一突變輕鏈和一重鏈的突變抗體或抗體片斷的轉化宿主細胞，所述宿主細胞以一表達載體進行了轉化，表達載體中克隆進了編碼約在18位氨基酸上含非天然Asn糖基化位點的突變輕鏈的突變DNA分子；(b)從所述培養的宿主細胞回收表達和糖基化的突變抗體或抗體片斷。本發明還涉及可溶性免疫結合物，包含(a)糖基化的抗體片斷，其中抗體片斷選自Fab、Fab′、F(ab)2和F(ab′)2，并且其中抗體片斷包括輕鏈可變區和輕鏈可變區約18位氨基酸上結合的碳水化合物部分；(b)中間結合物，包含具有至少一個游離氨基的聚合物載體和共價結合于聚合物載體的多種藥物、毒素、螯合劑、硼附加物或可檢測的標記分子，其中中間結合物通過聚合物載體的至少一個游離氨基與抗體片斷的碳水化合物部分共價結合，其中免疫結合物保持抗體片斷的免疫反應性。而且，本發明涉及可溶性免疫結合物，包含(a)糖基化的抗體片斷，其中抗體片斷選自Fab、Fab′、F(ab)2和F(ab′)2，并且其中抗體片斷包括輕鏈可變區和輕鏈可變區約18位氨基酸上結合的碳水化合物部分；(b)選自藥物、毒素、螯合劑、聚乙二醇、硼附加物和可檢測的標記分子的非抗體部分，其中非抗體部分共價結合于抗體片斷的碳水化合物部分，其中免疫結合物保留抗體片斷的免疫反應性。本發明進一步涉及可溶性免疫結合物，包含(a)突變抗體，其中突變抗體包括輕鏈可變區和輕鏈可變區約18位氨基酸上結合的碳水化合物部分；(b)選自藥物、毒素、螯合劑、聚乙二醇、硼附加物和可檢測的標記分子的非抗體部分，其中非抗體部分共價結合于突變抗體的碳水化合物部分，其中免疫結合物保留突變抗體的免疫反應性。本發明還涉及可溶性免疫結合物，包含(a)抗體成分，其中抗體成分選自Fv和單鏈抗體，其中抗體成分包括輕鏈可變區和輕鏈可變區的約18位氨基酸上結合的碳水化合物部分；(b)中間結合物，包含具有至少一個游離氨基的聚合物載體和共價結合于聚合物載體的多種藥物、毒素、螯合劑、硼附加物或可檢測的標記分子，其中中間結合物通過聚合物載體的至少一個游離氨基與抗體成分的碳水化合物部分共價結合，其中免疫結合物保留抗體成分的免疫反應性。本發明進一步涉及可溶性免疫結合物，包含(a)抗體成分，其中抗體成分選自Fv和單鏈抗體，其中抗體成分包括輕鏈可變區和輕鏈可變區的約18位氨基酸上結合的碳水化合物部分；(b)選自藥物、毒素、螯合劑、聚乙二醇、硼附加物和可檢測的標記分子的非抗體成分，其中非抗體成分共價結合于抗體成分的碳水化合物部分，其中免疫結合物保留抗體成分的免疫反應性。本發明還涉及制備免疫結合物的方法，包括以下步驟(a)通過誘變編碼輕鏈的DNA分子的核苷酸序列在抗體輕鏈的約18位上引入Asn糖基化位點；(b)將突變的DNA分子克隆到表達載體中；(c)用表達載體轉化宿主細胞，回收表達含一突變輕鏈和一重鏈的突變抗體的轉化宿主細胞；(d)培養轉化宿主細胞，從培養的宿主細胞回收突變抗體；(e)從回收的抗體制備抗體片斷，其中抗體片斷選自Fab、Fab′、F(ab)2和F(ab′)2，其中抗體片斷包含抗體片斷突變輕鏈上的碳水化合物部分；(f)將中間結合物共價結合于抗體片斷的碳水化合物部分上，其中中間結合物包含具有至少一個游離氨基的聚合物載體和共價結合于聚合物載體的多種藥物、毒素、螯合劑、硼附加物或可檢測的標記分子，其中中間結合物通過聚合物載體的至少一個游離氨基與抗體片斷的碳水化合物部分共價結合，其中免疫結合物保留抗體片斷的免疫反應性。本發明還涉及用于診斷哺乳動物中疾病存在的方法，包括以下步驟(a)制備包含可檢測的標記物和抗體片斷的免疫結合物，該抗體片斷的輕鏈約18位上結合有碳水化合物部分，其中可檢測的標記物結合于抗體片斷的碳水化合物部分上，其中抗體片斷能與和疾病相關的抗原結合；(b)將包含免疫結合物和藥學上可接受的載體的組合物對哺乳動物投藥；(c)用體內造影檢測患病部位免疫結合物的存在。本發明進一步涉及治療哺乳動物中疾病的方法。包括以下步驟(a)制備包含抗體片斷和非抗體部分的免疫結合物，所述抗體片斷的輕鏈約18位上結合有碳水化合物部分，非抗體部分選自藥物、毒素、螯合劑、硼附加物和放射性同位素，其中非抗體部分共價結合于抗體片斷的碳水化合物部分，其中抗體片斷能與和疾病相關的抗原結合；(b)將包含免疫結合物和藥學上可接受的載體的組合物對哺乳動物投藥。本發明中還包括用本發明的免疫結合物進行體外免疫試驗和在組織學標本上進行抗原原位檢測的改進的方法。本發明還提供適用于制備本發明的免疫結合物的合適的聚合物載體、螯合劑、可檢測的標記分子和偶聯部分。詳細描述1.概括本發明涉及包含完整抗體或其抗原結合片斷的免疫結合物，該完整抗體或其抗原結合片斷通過抗體部分輕鏈可變區的碳水化合物部分與診斷或治療劑共價結合。本發明進一步涉及制備這種免疫結合物的方法。本發明還考慮到這種免疫結合物對于診斷和免疫治療的應用。2.定義在下面的說明書中，大量使用一些術語。此處提供各種定義以利于對本發明的理解。抗體本文所用的“抗體”包括單克隆抗體，如鼠抗體、嵌合體抗體或人化的抗體，以及單克隆抗體的抗原結合片斷。這種片斷包括缺乏完整抗體的Fc片斷的Fab、Fab′、F(ab)2和F(ab′)2。這種片斷還包括由輕鏈可變區組成的分離的片斷，由重鏈和輕鏈可變區組成的“Fv”片斷，以及重組單鏈多肽分子、其中輕鏈和重鏈可變區由肽連結物連結起來。突變抗體本文所用的“突變抗體”是在輕鏈約18位氨基酸上具有Asn偶聯的糖基化位點的完整抗體或其抗原結合片斷，這種糖基化位點是通過改變相應的核苷酸序列引入到輕鏈上的。編碼輕鏈的核苷酸序列的誘變方法包括聚合酶鏈反應、位點導向誘變和使用有合成的DNA寡聚物的聚合酶鏈反應進行基因合成。診斷或治療劑本文所用的“診斷或治療劑”是結合到抗體上產生診斷或治療上有用的免疫結合物的分子或原子。診斷或治療劑的例子有藥物、毒素、螯合劑、硼化合物和可檢測的標記物。免疫結合物本文所用的“免疫結合物”包含抗體和診斷或治療劑的分子。免疫結合物保留抗體的免疫反應性，即結合后抗體部分具有和結合前大約相同或僅輕度降低的結合抗原的能力。結構基因轉錄成信使RNA(mRNA)，后者然后翻譯成特定多肽的特征性氨基酸序列的DNA序列。啟動子引導結構基因轉錄產生mRNA的DNA序列。典型地說，啟動子位于基因的5′區，近似于結構基因的起始密碼子。如果啟動子是一個可誘導啟動子，那么對于誘導劑起反應，轉錄速率增加。相反，如果啟動子是一個組成型啟動子，則轉錄速率不受誘導劑的控制。強化因子(Enhancer)一種啟動子因子。強化因子可提高特定的基因轉錄成mRNA的效能，不論該強化因子相對于轉錄起始部位的距離或方向如何。互補DNA(cDNA)互補DNA是由逆轉錄酶作用，從mRNA模板形成的單鏈DNA分子。典型地說，采用互補于部分mRNA的引物來啟動逆轉錄作用。本領域技術人員還用術語“cDNA”表示由這種單鏈DNA分子和它的互補物組成的雙鏈DNA分子。表達表達是從結構基因產生多肽的過程。該過程包括基因轉錄為mRNA和mRNA翻譯為多肽。克隆化載體一種DNA分子，如質粒、粘性質粒或噬菌體，它具有在宿主細胞中自發復制的能力，用來在基因控制中轉化細胞。克隆化載體典型地包含一個或少量限制性內切酶識別部位，在此識別部位，外源性DNA序列可以可確定的方式插入而不失去載體的基本生物功能，還包含一個標識基因，它適用于鑒別和選擇用克隆化載體轉化的細胞。標識基因典型地包括提供四環素抗性和氨芐西林抗性的基因。表達載體包含編碼外來蛋白質的克隆化的結構基因的DNA分子，它使外來蛋白質在重組體宿主中表達。克隆化的基因的表達典型地置于某些調節序列如啟動子和強化因子序列的控制之下(即可操縱地偶聯于這些調節序列)。啟動子序列可以是組成型啟動子或可誘導啟動子。重組體宿主重組體宿主可以是含有克隆化載體或表達載體的任何原核或真核細胞。此術語的意思還包括經過基因工程在宿主細胞的染色體或基因組中含有克隆化的基因的原核或真核細胞。合適的宿主的例子見sambrooketal.，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL，SecondEdition，ColdspringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork(1989)。3.通過誘變編碼蛋白質的DNA序列在抗體的輕鏈上引入Asn糖基化位點的方法A.抗體結構和Asn偶聯的糖基化抗體分子由重鏈和輕鏈兩條相同的復制鏈組成，它們通過二硫鏈共價地相互結合。關于綜合討論，見Schultzetal.，“ProteinsIIStructure-FunctionRelationshipofProteinFamilies，”inTEXTBOOKOFBIOCHEMISTRYWITHCLLINICALCORRELATIONS，3rdEd.，T.M.Devlin(ed.)，Wi-ley&Sons，pp.92-134(1992)；Turneretal.，“AntigenReceptorMolecules，”inIMMUTOLOGY，3rdEd.，Roittetal.，(eds.)，Mosby，pp.4.1-4.20(1993)。在最普通型的抗體IgG中，兩條重鏈各有約440個氨基酸，而兩條輕鏈各有約220個氨基酸。在具有不同抗原特異性的抗體之間，羧基末端一半輕鏈和羧基末湍3/4重鏈其氨基酸序列是高度恒定的。輕鏈和重鏈上的這些恒定區域稱作“恒定區”，分別稱為CL和CH。CH區決定特定的抗體是否屬于IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗體類型。一類抗體內的CH區是同源的，但明顯地區別于其它抗體類型的CH區的氨基酸序列。相反，具有不同抗原特異性的抗體之間，氨基末端一半輕鏈和氨基末端1/4重鏈的氨基酸序列是高度可變的。因為這些區域形成與抗原結構拓撲學上互補的抗原結合位點(ABS)，所以這些可變片斷內的特定區域是“高度可變的”，被稱作“互補決定區”(CDRs)。每條重鏈與一條輕鏈相締合，以使兩條鏈的氨基末端互相接近并包含抗原結合位點。可用蛋白裂解使抗體斷裂成小的功能單位。例如，用木瓜蛋白酶使IgG分子進行蛋白裂解，導致在每條重鏈的絞鏈肽上發生抗體的裂解。木瓜蛋白酶消化的一個產物是羧基末端一半重鏈，它在“可結晶片斷”(Fc)中是共價結合的。Fc片斷不結合抗原。其它裂解產物相同，由與整條輕鏈締合的重鏈的氨基末端組成。這些氨基末端，或“抗原結合片斷”(Fab)，可結合抗原，其親和力與完整抗體分子的親和力相似。本發明的目的是將診斷或治療劑共價結合到完整抗體或其抗原結合片斷的輕鏈可變區的Asn偶聯的碳水化合物部分上。Asn偶聯的糖基化作用也稱作“N-偶聯的糖基化作用”，是糖殘基通過天冬酰胺殘基的酰胺氮相偶聯的一種糖基化形式。Asn偶聯的寡糖的細胞內合成出現在內質網腔和蛋白質轉運到高爾基氏體后。Asn偶聯的糖基化作用發生在糖基化序列Asn-X-Thr/Ser，其中X可以是除脯氨酸和天冬氨酸之外的任何氨基酸。有36種可能的三氨基酸序列可編碼Asn偶聯的糖基化。考慮到基因密碼的簡并性，有1千個以上可能的核苷酸序列編碼糖基化信號序列。B.誘變用于將Asn偶聯的糖基化序列引入18-20位的特定的核苷酸序列取決于天然存在的核苷酸序列。如下所述，通過將密碼子18從AGG改變為AAC，可達到將Asn偶聯的糖基化位點引入PKAPPA(11)24蛋白質。核苷酸序列的這種誘變可用本領域技術人員熟知的方法來完成。例如，用寡核苷酸導向誘變和克隆化的抗體輕鏈可在18-20位引入Asn偶聯的糖基化位點。在此過程中，為了產生含少量尿嘧啶殘基代替胸苷的DNA分子，從大腸桿菌dut-ung-株制備含抗體輕鏈序列的單股DNA模板。這種DNA模板可由M13克隆化或用SP6啟動子體外轉錄而得到。例如，見Ausubeletal.(eds.)，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons(1987)。用公知的方法合成含突變序列的寡核苷酸(同上)。將寡核苷酸退火，得到單股模板，用T4DNA聚合酶和T4DNA連接酶，產生雙股DNA分子。用此雙股DNA分子轉化野生型(dut+ung+)大腸桿菌細胞，有效地回收突變DNA。寡核苷酸導向誘變的詳情和克隆化DNA誘變的有關技術是公知的。例如，見Ausubel等，如上；Sambrook等，如上。或者，用含所需突變體的寡核苷酸為引物及用抗體輕鏈可變區的DNA克隆，或用從產生感興趣的抗體的細胞得到的DNA作模板，可將Asn偶聯的糖基化位點引入抗體輕鏈。這樣的技術包括例如實施例1所述的聚合酶鏈反應，也見于Huse，“CombinatorialantibodyExpressionLibrariesinfilamentousPhage，”inANTIBODYENGINEERINGAPRACTICALGUIDE，C.Bor-rebaeck(ed.)，W.H.FreemanandCompany，pp.103-120(1992)。例如，可用TRANSFORMERTM位點導向誘變試劑盒(Colntech；PaloAlto，CA)，按制造商的說明書進行位點導向誘變。或者，通過合成帶有互相引發的寡核苷酸的輕鏈基因，這些寡核苷酸之一含有所需的突變體，可將糖基化位點引入免疫球蛋白輕鏈。構建大的合成基因的技術是本領域技術人員熟悉知的。見，例如，Uhlmann，Gene7129-40(1988)；Wosnicketal.，Gene60115-127(1988)；Ausubeletal.，supra。簡言之，如果滿足兩個要求，則可在任何抗體輕鏈的約18位氨基酸上引入Asn偶聯的糖基化位點。第一、為了設計含所需突變體的互補寡核苷酸，必須得到包括編碼感興趣的抗體輕鏈第18-20位氨基酸的密碼子和在其周圍的核苷酸序列。第二、必須有接近克隆化的抗體DNA或產生感興趣的抗體的細胞的途徑。給予了這兩個限定，本發明完成了包括鼠的、人化的或嵌合的抗體的免疫結合物，其中診斷或治療劑經位于輕鏈可變區約18位氨基酸的碳水化合物部分與抗體成分結合。這樣的抗體包括完整抗體和抗原結合片斷Fab、Fab′、F(ab)2和F(ab′)2。此外，本發明著眼于含Fv片斷或單鏈抗體的免疫結合物的制備。如上面所討論的，Fv片斷包含重鏈和輕鏈可變區的非共價締合。相反，單鏈抗體包含通過肽連結物連結的來自特定抗體可變區的重鏈和輕鏈多肽鏈。例如見Birdetal.，Science242423-426(1988)；Ladneretal.，U.S.PatantNo.4,946,778；和Packetal.，Bio/Technolgy111271-1277(1993)。一般來說，Fv片斷和單鏈抗體缺乏結合某些診斷或治療劑如放射性金屬的部位。但是，Asn偶聯的糖基化位點引入Fv片斷或單鏈抗體的輕鏈可變區，如上所述，為各種診斷或治療劑的結合提供了碳水化合物部分。雖然Fv片斷和單鏈抗體典型地由原核宿主細胞產生，但是真核宿主細胞是較好的宿主細胞。哺乳動物細胞是最好的宿主細胞。本發明提供在輕鏈可變區的約18-20位氨基酸上引入Asn偶聯的糖基化位點的方法，但要理解的是，本發明并不受到這樣的限制。對于本領域普通技術人員來說，會出現這樣的可能性，即在輕鏈可變區的可選擇的部位或甚至在重鏈可變區上引入糖基化位點。本發明的免疫結合物可用在這種可選擇的糖基化位點上結合了碳水化合物部分的完整抗體、抗體片斷和單鏈抗體來制備，只要誘變的抗體或片斷保留抗原結合活性。合適的可選擇的糖基化位點可用本領域技術人員熟知的分子模擬技術加以鑒定。例如，見Lesketal.，“AntibodyStructureandStructuralPredictionsUsefulinGuidingAntibodyEngineering，”inAN-TIBODYDNGINEERINGAPRACTICALGUIDE，C.Borrebaeck(ed.)，W.H.FreemanandCompany，pp.1-38(1992)；Cheetham，“EngineeringAntibodyAffinity”Id.atpp.39-67。4.表達和分離突變抗體DNA序列蛋白質產物的方法A.表達突變抗體的方法如實施例1所述，在誘變核苷酸序列后，將突變DNA插入克隆化載體，用于進一步分析，如確定DNA序列。為了表達突變DNA序列編碼的多肽，DNA序列必須可操縱地偶聯于控制表達載體中轉錄表達的調節序列，然后引入原核或真核宿主細胞。除了諸如啟動子和強化因子等轉錄調節序列外，表達載體包括翻譯調節序列和標記基因，這種標記基因適合于攜帶表達載體的細胞的選擇。對于在原核宿主中表達的合適的啟動子可以是可抑制的、組成型的或可誘導的。合適的啟動子是本領域技術人員熟知的，包括能識別T4、T3、Sp6和T7聚合酶的啟動子，噬菌體(λ)的PR和PL啟動子。大腸桿菌的trp、recA、熱休克和lacZ啟動子、枯草桿菌(B.subtilis)的α-淀粉酶和σ28-特異性啟動子，芽胞桿菌屬噬菌體的啟動子，鏈霉菌屬啟動子，噬菌體(λ)的int啟動子，pBR322的β-內酰胺酶的bla啟動子，及氯霉素乙酰基轉移酶基因的CAT啟動子。原核細胞啟動子見以下綜述Glick，J.Ind.Microbiol.1277-282(1987)；Watsonetal.，MOLECULARBIOLOGYOFTHEGENE，4thEd.，BenjaminCummins(1987)；Ausubeletal.，supra，andSambrooketal.，supra。一種特別可取的原核細胞宿主是大腸桿菌。較佳的大腸桿菌侏包括Y1088，Y1089。CSH18，ER1451，和ER1647(例如，見Brown(Ed.)，MOLECULARBIOLOGYLABFAX，AcademicPress(1991))。另一較佳的宿主是枯草桿菌(Bacillussubtilus)，包括如下株BR151，YB886，MI19，MI120，和B170(例如，見Hardy，“BacillusCloningMethods，”inDNACLONINGAPRACTICALAPPROACH，Glover(Ed.)，IRLPress(1985))。制備大腸桿菌中抗體片斷的方法是本領域技術人員熟知的。例如，見Huse，“CombinatorialAntibodyExpressionLibrariesinFilamentousPhage，”inANTIBODYENGINEERINGAPRACTICALGUIDE，C.Borrebaeck(Ed.)，W.H.EreemanandCompany，pp.103-120(1992)；Ward，“expres-sionandPurificetionofAntibodyFragmentsUsingEscherichiacoliasaHost，”Id.atpp.121-138(1992)。本領域技術人員還知道在大腸桿菌中制備由重鏈和輕鏈可變區組成的Fv片斷。同上。還見于Whitlowetal.，“Single-ChainFvProteinsandtheirFusionProteins，”inNEWTECHNIQUESINANTIBODYGENERATION，Methods2(2)(1991)。此外，克隆化抗體在原核細胞中的表達系統可以購得。例如，IMMUNOZAPTM克隆和表達系統(StratageneCloningSystems；LaJolla，CA)為抗體輕鏈和重鏈在大腸桿菌中的表達提供了載體。因為突變DNA序列在原核細胞中的表達需要隨后的體外糖基化，因此，本發明更可取地包括突變DNA序列在真核細胞，特別是在哺乳動物、昆蟲和酵母細胞中的表達。特別可取的真核細胞是哺乳動物細胞。哺乳動物細胞對克隆化的多肽提供翻譯后修飾，包括適當的折迭和糖基化。例如，這樣的哺乳動物宿主細胞包括COS-7細胞(ATCCCRL1651)、非分泌型骨髓瘤細胞(SP2/0-AG14；ATCCCRL1581)、中國倉鼠卵細胞(CHO-KI；ATCCCCL61)、大鼠垂體細胞(GH1；ATCCCCL82)、HeLaS3細胞(ATCCCCL2.2)和大鼠海馬細胞(H-4-II-E；ATCCCRL1548)。對于哺乳動物宿主，轉錄和翻譯調節信號可得自病毒來源，如腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒和猿猴病毒。而且，可采用來自哺乳動物表達產物如肌動蛋白、膠原蛋白或肌球蛋白的啟動子。或者，可采用原核細胞啟動子(如噬菌體T3RNA聚合酶啟動子)，其中原核細胞啟動子是由真核生物啟動子調節的(例如，見Zhouetal.，Mol.Cell.Biol.104529-4537(1990)；Kaufmanetal.，Nucl.AcidsRes.194485-4490(1991))。可以選擇考慮到阻抑或激活的轉錄起始調節信號，以便調節基因的表達。一般來說，真核細胞調節區會包括足以導向RNA合成起始的啟動子區。這樣的真核生物啟動子包括小鼠metallothioneinI基因(Hameretal.，J.Mol.Appl.Gen.1273-288(1982))；皰疹(Herps)病毒的TK啟動子(McKnight，Cell31355-365(1982))；猴病毒40(SV40)早期啟動子(Benoistetal.，Na-ture(London)290304-310(1981))；魯斯(Rous)肉瘤病毒啟動子(Gormanetal.，supra)；巨細胞包涵體病毒(Cytomegalovirus)啟動子(Foeckingetal.，Gene45101(1980))；酵母gal4基因啟動子(Johnston，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)796971-6975(1982)；Silver，etal..Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)815951-5955(1984))；及IgG啟動子(Orlandietal.，Proc.Natl.Aced.Sci.USA863833-3837(1989))。強的調節序列是本發明最好的調節序列。這種較佳調節序列的例子包括SV40啟動子強化因子(Gorman，“HighEfficiencyGeneTransferintoMam-maliancells，”inDNACLONINGAPRACTICALAPPROACH，VolumeII，Glover(ed.)，IRLPresspp.143-190(1985))，hCMV-MIE啟動子強化因子(Bebbingtonetal.，Bio/Technolgy10169-175(1992))，和抗體重鏈啟動子(Orlandietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA863833-3837(1989))。較佳的還有輕鏈表達的κ(Kappa)鏈強化因子和IgH強化因子(Gillies，“DesignofExpressionVectorsandMammalianCellSystemsSuitableforEngineeredAntibodies，”inANTIBODYENGINEERINGAPRACTICALGUIDE，C.Borrebaeck(Ed.)，W.H.FreemanandCompany，pp.139-157(1992)；Or-landietal.，supra)。突變抗體編碼序列和可操縱地偶聯的啟動子可作為非復制DNA分子引入真核細胞，這種DNA分子可以是線性分子，或封閉的共價環狀分子則更佳。這種分子不能自動復制，因此可通過被引入序列的瞬時表達而出現蛋白質的表達。更好地通過被引入序列整合到宿主染色體中而出現持久表達。較好的是，被引入的序列會摻入質粒或能在接受宿主上自動復制的病毒載體中。幾種可能的載體系統可用于此目的。一類載體利用提供自動復制的染色體外質粒的DNA要素，其中染色體外質粒來自動物病毒，如牛乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或猴病毒40。第二類載體依賴于所需基因組或cDNA序列整合到宿主染色體中。mRNA的最適合成可能還需其它要素。這些要素可包括拼接信號，以及轉錄啟動子、強化因子和終止信號。摻入這些要素的cDNA表達載體包括以下文獻所描述的那些Okayama，Mol.Cell.Biol.3280(1983)，Sambrooketal.，supra，Ausubeletal.，supra，Bebbingtonetal.，supra，Orlandietal.，supra，andFouseretal.，Bio/Technology101121-1127(1992)；Gillies，supra。包括內含子(intron)序列的基因組DNA表達載體已被Orlandi等(同上)描述，一般還見于Lerneretal.，(Eds.)，NEWTECH-NIQUESINANTIBODYGENERATION，Methods2(2)(1991)。為了得到表達完整抗體的哺乳動物細胞，可將包含突變抗體輕鏈的表達載體共同轉染到帶抗體重鏈表達載體的哺乳動物細胞中。例如，見Orlandi等，同上。或者，可用含突變抗體輕鏈的表達載體轉染含重鏈表達載體的哺乳動物細胞，以及可用重鏈表達載體轉染含包括突變輕鏈的表達載體的哺乳動物細胞。此外，可用包括編碼突變抗體輕鏈的DNA片斷及編碼抗體重鏈的DNA片斷的單一表達載體轉染哺乳動物細胞。例如，見Gillies，supra；Bebbingtonetal.，supra。這些方法中任何一種均會產生表達具有突變抗體輕鏈的完整抗體分子的轉染細胞。標準的轉染技術是本領域公知的。例如，見Sambrooketal.，supra；Ausubeletal.，supra。B.從轉染細胞分離突變抗體的方法用合適的藥物選擇攜帶表達載體的轉染細胞。例如，可用G418選擇攜帶具有氨基糖苷磷酸轉移酶基因的表達載體的轉染細胞。Southernetal.，J.Mol.Appl.Gen.1327-341(182)。或者，可用勻霉素-B(hygromycin-B)選擇攜帶具有勻霉素-B磷酸轉移酶基因的表達載體的轉染細胞。Palmeretal.，Proc.Natl.aced.sci.USA841055-1059(1987)。或者，可用氨喋呤和麥考酚酸選擇攜帶具有黃嘌呤-烏嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因的表達載體的轉染細胞。Mulliganetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA782071-2076(1981)。產生突變抗體的轉染細胞可用各種方法加以鑒別。例如，可用任何免疫檢測試驗鑒別這種轉染瘤(transfectomas)。實施例1提供了用于這種目的的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的實例。在鑒別轉染瘤后，培養細胞并從培養物上清液中分離抗體。分離技術包括用A蛋白瓊脂糖(用于分離完整抗體)進行親和層析、體積排阻色譜法和離子交換色譜法。詳情見例如Coliganetal.，(eds.)，CURRENTPROTOCOLSINIM-MUNOLOGY，JohnWiley&Sons(1991)。5.制備免疫結合物的方法A.抗體片斷的制備本發明著眼于從完整的突變抗體或從抗原結合抗體片斷制備免疫結合物。抗體片斷可從轉染瘤得到，通過轉染瘤產生的完整突變抗體的蛋白裂解，或通過在輕鏈18-20位上具有天然存在的Asn偶聯糖基化位點的完整抗體的蛋白裂解。通過用具有已誘變的重鏈結構基因的轉染細胞可從轉染瘤直接得到抗體片斷。例如，如果在CH1區域序列后插入終止密碼子，則轉染瘤應產生Fab片斷。或者，如果在編碼重鏈絞鏈區的序列后插入終止密碼子，則轉染瘤應產生Fab′或F(ab′)2片斷。或者，可用公知的蛋白水解技術從完整抗體制備抗體片斷。例如，見Coliganetal.，suprs.作為實例，實施例2提供了用木瓜蛋白酶得到Fab片斷的方法。此外，F(ab′)2片斷可用胃蛋白酶消化完整抗體而得到。用常規的二硫鍵還原劑，如半胱氨酸、二硫蘇糖醇(DTT)等，可將二價片斷裂解為一價片斷。B.結合方法(i)間接結合通過將診斷或治療劑間接結合到完整抗體或其抗原結合片斷上，可制成免疫結合物。這樣的技術在以下文獻中描述Shihetal.，Int.J.Cancer41832-839(1988)；shihetal.，Int.J.Cancer461101-1106(1990)；和Shihetal.，U.S.PatentNo.5,057,313。一般方法是將具有氧化的糖部位的抗體成分與一種載體聚合物反應，這種載體聚合物有至少一個游離氨基，并載有眾多藥物、毒素、螯合物或硼附加物，或載有可檢測的標記物。這一反應產生初級Schiff堿(亞胺)鍵，該鍵可通過還原成二級胺形成最終結合物而得到穩定。載體聚合物較佳為氨基葡聚糖或至少50個氨基酸殘基的多肽，盡管其它實質上等價的聚合物載體也可被使用。為了在診斷和治療使用中易于給藥和有效地對針目標，最終免疫結合物以溶于水性溶液(如哺乳動物血清)為宜。因此，載體聚合物上的加溶官能團將提高最終免疫結合物的血清溶解度。如下所述，加溶官能團對于免疫結合物在體外免疫測定和原位檢測中的應用也是重要的。特別是，以氨基葡聚糖為宜。制備具有氨基葡聚糖載體的免疫結合物的過程典型地從葡聚糖聚合物開始，較有利地是從平均分子量約10,000-100,000的葡聚糖開始。將葡聚糖與氧化劑反應，使達到其碳水化合物環部分有控制的氧化，以產生醛基。根據常規方法，用糖解化學試劑如NaIO4方便地進行這種氧化。然后，將氧化的葡聚糖與多元胺反應，較佳為二胺，更佳為一或多羥基二胺。合適的胺包括乙二胺、丙二胺、或其它類似聚亞甲基二胺類，二亞乙基三胺或類似多胺，1，3-二氨基-2-羥基丙烷，或其它類似羥基化二胺類或多胺類，等等。用過量與葡聚糖的醛基有關的胺以確保醛官能團基本上完全轉變為希夫氏堿基。用還原劑，如NaBH4、NaBH3CN等，引起所得希夫氏堿中間體的還原穩定化作用。所得加成化合物可通過常規大小的柱提純，以除去交聯葡聚糖。引入胺官能團的葡聚糖衍生其它常規方法也可使用，例如，與溴化氰反應，然后與二胺反應。然后，將氨基葡聚糖與準備攜帶的活性型的特殊藥物、毒素、螯合物、硼附加物或標記物的衍生物反應，較佳為用常規方法制備的羧基活化的衍生物，例如，用二環己基碳二亞胺(DCC)或其水溶性變體，形成中間體加成化合物。或者，通過戊二醛縮合反應或通過蛋白質上活化羧基與氨基葡聚糖上的胺基的反應，可將諸如pokeweed抗病毒蛋白或蓖麻蛋白A鏈等多肽毒素偶聯到氨基葡聚糖上。放射性金屬螯合劑或磁共振增強劑是本領域公知的。典型的是1，4，7，10-四氮雜環十二烷四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)和二亞乙基三胺五乙酸(DTAA)的衍生物。這些螯合劑典型地在側鏈上有基團，通過這些基團可將螯合劑連接到載體上。這些基團包括諸如異硫氰酸芐酯，通過此基團可將DOTA、DTPA或EDTA偶聯到載體的氨基上。或者，螯合劑上的羧基或氨基可通過激活或先前的衍生化然后偶聯(均為公知的方法)而偶聯到載體上。通過本領域公知的常規方法，可將諸如酶、螢光化合物、電子轉移劑等標記物連結到載體上。如下面所述，這些標記的載體及由它們制成的免疫結合物可用于體外免疫試驗或原位檢測。硼附加物，如卡硼烷，可用常規方法連結在抗體成分上。例如，如本領域中所公知的，用側鏈上的羧基官能團制備卡硼烷。通過卡硼烷上羧基的激活和與載體上胺的縮合，可獲得卡硼烷與載體，如氨基葡聚糖的結合，以產生中間體結合物。如下面所述，然后將這樣的中間體結合物與抗體成分連結以產生治療上有用的免疫結合物。作為氨基葡聚糖的替換物，可將聚酰胺基胺樹枝狀體(polyamidoaminedendrimer)用作載體聚合物。用例如Tomalia等的方法(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29138-175，1990)可制備合適類型的樹枝狀體分子。用這種方法制得的顯示相同的大小、形狀和電荷，在分子的表面帶有一定量的伯胺基，它們都可用于結合目的。聚酰胺基胺樹枝狀體還帶有叔胺基，它們在生理pH的水溶液中會被質子化，賦予載體分子水溶性。多肽載體也可被用來代替氨基葡聚糖或聚酰胺基胺樹枝狀體，但多肽載體鏈上必須至少具有50個氨基酸殘基，以100-5000個氨基酸殘基為佳。氨基酸中至少有一些應為賴氨酸殘基或谷氨酸或天冬氨酸殘基。賴氨基殘基的側基胺和谷氨酸、天冬氨酸的側基羧化物對于結合藥物、毒素、螯合劑或硼附加物是便利的，合適的多肽載體的例子包括聚賴氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸及其共聚物，以及這些氨基酸和其它氨基酸如絲氨酸的混合聚合物，它們賦予生成物負荷的載體和免疫結合物以滿意的溶解性能。中間結合物與抗體成分的結合由以下作用完成抗體成分的碳水化合物部分的氧化，以及所生成的醛(和酮)羰基與載有藥物、毒素、硼附加物或標記物后載體上留下的氨基進行反應。或者，中間結合物可經氨基與氧化的抗體成分結合，這些氨基是在載有診斷或治療劑后的中間結合物中已經引入的氨基。氧化作用可以用化學方法(如用NaIO4或其它糖解試劑)或酶學方法(如用神經氨酸苷酶和半乳糖氧化酶)來完成。在氨基葡聚糖載體的情況下，不是氨基葡聚糖的所有氨基典型地用于攜帶診斷或治療劑的。氨基葡聚糖的剩余氨基與氧化的抗體成分縮合，形成希夫氏堿加合物，然后通常用氫硼化物還原劑將希夫氏堿加合物還原穩定化。按照本發明，用類似的方法制備其它免疫結合物。載體分子和診斷或治療劑之間的化學計量宜調整到有負載的樹枝狀體和多肽載體具有留作與抗體成分的氧化碳水化合物部分縮合用的游離氨基。如果必需，可通過諸如用DCC激活或與過量二胺反應，使多肽載體上的羧基轉化成胺。用常規技術，如在SephacrylS-300或類似基質上進行的體積排阻色譜法，將最終的免疫結合物純化。對抗體片斷的間接結合在實施例4中闡述。(ii)直接結合免疫結合物可選擇用抗體成分和診斷或治療劑直接結合來進行制備。除了診斷或治療劑是直接與氧化的抗體成分結合的外，一般方法與間接結合法相似。螯合劑與抗體片斷的直接結合在實施例3中闡述。經偶聯于氧化的輕鏈碳水化合物部分上制備免疫結合物的一個特殊優點是氧化反應為診斷或治療劑的結合提供多個位點。因為輕鏈碳水化合物部分并不緊密結合在抗原結合部位上，因此該方法提供了不使用聚合載體而將多種診斷或治療劑直接結合于抗體片斷的途徑，以提高抗體負載容量。在負載的中間載體分子伴有不利的免疫結合物藥代動力學的情況下，這是有利的。人們會意識到，對于下面所述的螯合劑，其它診斷或治療劑可被替換。本領域技術人員能不經實驗而設想出結合方案。而且，本領域技術人員會認識到結合方法的很多可能的改變。在一個實施例中，為了改變血、淋巴或其它細胞外液中完整抗體或其抗原結合片斷的藥化動力學性質，可用碳水化合物部分結合聚乙二醇(PEG)。這對于在放射免疫診斷(RAID)中使用以放射金屬[特別是99m鎳(99mTC)]標記的抗體片斷是特別有利的。99m鎳(99mTC)是治療和診斷應用上特別有吸引力的放射性同位素，因為它是所有核醫學部門容易得到的，價格不貴，給病人最小的放射劑量，具有理想的核成象性能。它的半衰期為6小時，這意味著鎳標記抗體的快速導向(targeting)是合乎需要的。因此，比完整免疫球蛋白顯示快速導向動力學的抗體片斷，如F(ab′)2和F(ab)2，尤其是Fab和Fab′，對于用Tc-99m標記的RAID應用是較適宜的。用Tc-99m標記的片斷來成象的主要缺點是放射活性在腎臟的較高攝取和滯留，導致此器官區域的成象困難。已發現，PEG與Tc-99m標記的抗體片斷的結合引起該片斷的腎臟攝取和保留量的顯著降低。見美國專利申請No.08/309,319，全文在此引作參考。為了將PEG與輕鏈碳水化合物偶聯，可用本領域公知的方法，用高碘酸將碳水化合物部分氧化，并與載有親核基團的PEG衍生物偶聯。例如PEG肼(ShearwaterPolymers，Inc.，Huntsville，Al)與抗體片斷混合，生成腙。或者，可將PEG-胺與氧化的碳水化合物反應，生成希夫氏堿，然后用氰基氫硼化鈉還原處理，形成穩定的仲胺鍵。PEG與Fab抗體片斷的結合在實施例8中闡述。在一個較佳實施方案中，一旦抗體片斷與PEG結合，它就能在控制的條件下用還原劑進行處理，產生游離巰基，使該片斷被Tc-99m直接標記。抗體片斷的控制還原方法是本領域技術人員熟知的。例如，見美國專利5,128,119，全文在此引作參考。在另一較佳實施方案中，通過與巰基化劑如Traut試劑反應，或如美國專利申請No.08/253,772所述，可以非位點特異性的方式在PEG結合的抗體片斷上產生游離巰基，接著用Tc-99m直接標記。在另一較佳實施方案中，將氨基末端雙官能團螯合劑(BFC)聯結于抗體或抗體片斷的氧化的輕鏈碳水化合物上。這些雙官能團試劑含側基巰基和氨基，將其作適當的處理，以緊密地結合放射活性金屬，如186Re、188Re、111Ag和67Cu。通過BFC上的胺或肼官能團可達到BFC與抗體的結合，這些官能團可分別與氧化的碳水化合物上的醛官能團形成亞胺或腙鍵。亞胺鍵可通過用諸如氰基氫硼化鈉之類還原劑的還原反應而達到穩定。在結合階段，螯合劑基團的巰基掩蔽為硫醇酯或二硫化物，在結合物制備后去保護基。BFC可用如下通式Ia、Ib和Ic表示在通式Ia中，X為CH，或X和Z連在一起可為CO；Y為CR4R5、CH2CR4R5或(CH2)2CR4R5，其中R4和R5相同或不同，選自氫、烷基、取代烷基、芳基或取代芳基；Z可為能與蛋白質的氧化碳水化合物基團反應和/或復合的任何基團，或Z可為H；R1為可在不明顯降低蛋白質免疫活性的條件下除去的巰基保護基團；R2和R3可以相同或不同，各代表酰基或取代酰基，或氫，烷基，芳基，取代烷基，或取代芳基，其中烷基或芳基上的取代基是選自巰基、胺或羧酸或其保護衍生物的金屬絡合物形成基；R2和R3也可以是能與蛋白質上氧化碳水化合物基團反應和/或復合的任何基團。在式Ib中，D為H或CH2SR1；E可為能與蛋白質上氧化碳水化合物基團反應和/或復合的任何基團；R1為可在不明顯降低蛋白質免疫活性的條件下除去的巰基保護基團；m為0、1、2或3。在式Ic中，Q可為能與蛋白質上氧化碳水化合物基團反應和/或復合的任何基團；R1為可在不明顯降低蛋白質免疫活性的條件下除去的巰基保護基；每個n各自為2或3。Ia、Ib和Ic的代表性例子如下所示。在某些例子中，抗體結合基團示為(但不限于)酰肼。僅僅顯示了巰基受保護的結構形式(‘R’為酰基、苯甲酰基或2-硫代吡啶基)，雖然金屬配位會涉及巰基去保護的結合物。用本領域公知的方法可達到BFC的合成。某些BFC的代表性合成和結合方法見實施例9-14。用于BFC的巰基保護基可以是在溫和條件下容易除去以在蛋白質存在下重新生成氫硫基而不實際上改變蛋白質活性的任何有機或無機基團。合適的保護基的例子包括硫醇酯、硫代氨基甲酸酯和二硫代物。在一個較佳實施方案中，巰基保護基是苯甲酸硫酯。本領域技術人員對巰基保護和去保護的方法是熟悉的。例如，苯甲酸硫酯可在溫和和選擇性條件下用羥胺進行去保護。但是，當胺為酰肼時，巰基保護為二硫鏈最佳，例如，‘R’官能團為2-吡啶基硫基。在本發明的另一較佳實施方案中，氧化的碳水化合物可被用來結合抗體預導向(pretargeting)的基團。單克隆抗體的預導向對于抗體導向步驟和載抗體劑放射診斷/放射治療傳送步驟的“解偶聯”是有用的。通過減少循環中放射性同位素的量而在靶部位保持抗體的高攝取，可能降低對血液和造血組織的放射劑量，并有較高的靶非靶放射性同位素比。預導向方法的典型例子是在預定步驟使用抗體-抗生物素蛋白(或抗體-抗生物素蛋白鏈菌素)結合物，接著傳送結合于生物素基團的同位素；在預定步驟使用抗體-生物素結合物，接著傳送結合于抗生物素(或抗生物素蛋白鏈菌素)基團的同位素；或在預定步驟使用抗體-生物素結合物，然后傳送抗生物素(抗生物素蛋白鏈菌素)基團，繼而傳送結合于生物素基團的同位素。作為次級導向載體可能發現同樣用途的其它試劑對是例如單股核酸的兩個互補序列；酶及其特異性底物；或蛋白質及其特異性酰基，如內因子和維生素B12。如美國專利申請No.08/051,144所述，另外的導向步驟也是可行的，使用一種以上放射性標記也是可能的，該文獻全文引用于此作為參考。在抗體靶部位達到較高治療量的其它方法包括例如摻入抗體-生物素(抗生物素)-放射性同位素結合物作為后一步同位素傳送載體，導向有抗體-抗生物素(生物素)預導向的靶部位。此例中，抗體-生物素(抗生物素)-放射性同位素結合物有兩個部位，即抗原和抗生物素(生物素)，它們可被作為靶。例如，見美國專利申請No.08/062,662，在此全文引作參考。抗體片斷上輕鏈碳水化合物的存在，使合適的預導向劑與抗體片斷如F(ab′)2的結合具有位點特異性。或者，在載游離巰基的Fab′片斷的情況下，碳水化合物和硫醇官能團的存在使兩種不同基團產生位點特異性結合，這兩種基團各可有不同的化學性質。制備預導向結合物(劃線處)的圖例如下(抗生物素-硫醇)+(馬來酰亞胺-L-酰肼)→(抗生物素-L-酰肼)2(抗生物素-L-酰肼)+(CHO-Fab′-S-S-Fab′-CHO)→(抗生物素)2-F(ab′)2(抗生物素)2-F(ab′)2用2-巰基乙醇還原，生成2×抗生物素-Fab′-SH抗生物素+(琥珀酰亞胺-L-馬來酰亞胺)→(抗生物素-L-馬來酰亞胺)(抗生物素-L-馬來酰亞胺)+(抗生物素-Fab′-SH)→(抗生物素)2-Fab′(抗生物素-CHO)+(酰肼-L-酰肼)→(抗生物素-L-酰肼)2(抗生物素-L-酰肼)+(CHO-Fab′-S-S-Fab′-CHO)→(抗生物素)2-F(ab′)2(抗生物素)2-F(ab′)2用2-巰基乙醇還原，生成2(抗生物素-Fab′-SH)抗生物素-Fab′-SH+(抗生物素-馬來酰亞胺)→(抗生物素)2-Fab′n(生物素-L-酰肼)+(CHO-Fab′-S-S-Fab′-CHO)→(生物素)n-F(ab′)2其中，n為整數，通常為從1至約30；L指一個連結物，碳水化合物、烷基、酰基，或一種結合，它分開兩個不同的反應性官能團，它包含市售蛋白質交聯劑。在上述實施例中，可用抗生物素蛋白鏈菌素代替抗生物素。當需要時，分別用標準試劑，如高碘酸鈉和2-巰基乙醇，可將碳水化合物部分氧化以產生醛，和將二硫鍵還原以產生游離的硫醇。用已知的巰基化劑，如2-iminothiolane，可將巰基引到抗生物素上。在使用前，可任選地阻斷抗生物素(抗生物素蛋白鏈菌素)-Fab′結合物的游離巰基，例如，用碘乙酰胺。或者，游離巰基可用作進一步修飾用的反應基團，例如通過用Tc-99m的放射標記，或通過與諸如經馬來酰亞胺反應而激活的聚乙二醇(PEG)衍生物這樣的藥劑結合，繼而偶聯到游離巰基上。基于F(ab′)2的抗生物素蛋白鏈菌素/抗生物素結合物保留2個非立體阻礙的抗原結合位點和8個生物素結合位點，單價Fab′單位每個Fab′攜帶1個或2個抗生物素蛋白鏈菌素/抗生物素單元，完全保持生物素結合能力。碳水化合物的使用意味著幾個生物素單位可經氧化的碳水化合物偶聯到每一個片斷分子上，而不干擾該片斷的抗原結合能力。在本發明的另一實施方案中，與遠離抗原結合位點的輕鏈糖殘基的結合保證了在第二抗體是抗獨特型(antiidiotypic)抗體時，不發生隨后給予的清除第二抗體的結合干擾。在這種情況下，第二抗體通過其抗原結合位點與循環抗體結合，導向抗體經肝臟清除。應用此系統的優點是在清除步驟中導向抗體的第二位點(例如抗生物素或生物素)不被阻斷。在本發明的另一實施方案中，載有放射性核素的螯合劑可經可代謝鍵連結于氧化的輕鏈糖上，在放射治療和放射診斷應用上使用抗體片斷經常遇到的一個問題是放射標記抗體片斷在腎臟有積聚的的潛在危險。當使用酸或堿不穩定性連結物來形成結合物時，可發生放射性螯合劑從抗體上裂解下來的不利情況。如果螯合劑分子量比較低，它不留在在腎臟而從尿中排出，從而減少腎臟的放射性暴露。適于這種應用的低分子螯合劑包括例如上述雙官能團螯合劑和DOTA或DTPA型螯合劑。這些分子每一種都能用本領域公知的標準方法進行修飾，產生活性官能團，它們能與抗體片斷的氧化碳水化合物上的羰基形成酸不穩定性鍵。合適的酸不穩定性鍵的例子包括腙和氨基硫脲官能團。它們是通過氧化的碳水化合物與分別載有肼、氨基硫脲和硫卡巴肼官能團的螯合劑反應而形成的。DTPA的硫卡巴肼衍生物的制備和結合在實施例15中闡述。或者，可用堿可裂解性連結物，它們被用于促進雙官能團螯合劑-99TC標記的片斷從腎臟清除。例如，見Weberetal.，Bioconjug.Chem.1431(1990)。雙官能團螯合劑與輕鏈碳水化合物經肼鍵的偶聯可在連結間隔物臂中摻入堿敏感性酯基。這種含酯連結物單位的例子為乙二醇二(琥珀酰亞胺基琥珀酸亞乙酯)(EGS，購自PiercechemicalCo.，Rockfood，IL)，它有2個1，4-二丁酸單位的2個末端N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯衍生物，每個經2個烷酯連結于單個乙二醇基團。一個NHS酯可被合適的含胺BFC(如2-氨基芐基DTPA)取代，而另一個NHS酯與限量肼反應。所生成的肼用于與抗體或抗體片斷的輕鏈碳水化合物偶聯，形成含2個烷酯官能團的抗體-BFC鍵。這種結合物在生理pH下是穩定的，但在堿性pH下易裂解。在本發明的另一實施方案中，通過將診斷或治療劑連結于碳水化合物部分和游離硫氫基(巰基)上，可構建“二價免疫結合物”。這一游離巰基可位于抗體成分的絞鏈區。6.免疫結合物用于診斷和治療A.免疫結合物用于診斷用放射標記的單克隆抗體進行診斷成象的方法是公知的。例如，見Srivas-tava(ed.)，RADIOLABELEDMONOCLONALANTIBODIESFORIMAG-INGANDTHERAPY，PlenumPress(1988)；Chase，“MedicalApplicationsofRadioisotopes，”inREMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES，18thEdition，Gennaroetal.(eds.)MackPublishingCo.，PP.624-652(1990)；和Brown，“ClinicalUseofMonoclonalAntibodies，”inBIOTECH-NOLOGYANDPHARMACY，Pezzutoetal.(eds.)，Chapman&Hall，pp.227-249(1993)。這種技術也稱作免疫閃爍照相法(immunoscintigraphy)，采用r-照相機檢測結合于單克隆抗體上的r發射的放射性同位素的定位。診斷成象法可用于診斷心血管疾病和感染性疾病。Brown，同上。本發明注目于免疫結合物診斷心血管疾病的應用，例如，含抗肌球蛋白片斷的免疫結合物可用于伴有急性心肌梗塞的心肌壞死成象。含結合血小板和血纖維蛋白的抗體片斷的免疫結合物可用于深部靜脈血檢形成的成象。此外，含結合于活化血小板的抗體片斷的免疫結合物可用于動脈粥樣硬化斑的成象。本發明的免疫結合物還可用于感染性疾病的診斷。例如，含結合特異性細菌抗原的抗體片斷的免疫結合物可用于膿腫定位。此外，含結合粒細胞和炎性白細胞的抗體片斷的免疫結合物可用于細菌感染部位的定位。大量研究評估了單克隆抗體在癌的閃爍照相檢測上的應用。例如，見Brown(同上)及其中的文獻。研究復蓋了實體瘤的主要類型，如黑素瘤、結腸直腸癌、卵巢癌、乳癌、肉瘤和肺癌。本發明注目于用含結合可確定癌的腫瘤標記物的抗體片斷的免疫結合物檢測癌。這些腫瘤標記物的例子包括癌胚抗原、甲胎蛋白、癌基因產物、腫瘤相關細胞表面抗原和壞死相關細胞內抗原。除了診斷外，單克隆抗體成象可用于監測治療反應，檢測疾病的復發和引導后續的臨床結論。對于診斷成象，可用中介官能團將放射性同位素直接或間接地結合到抗體片斷上。這種中介官能團包括DOTA、DTPA和EDTA。傳送給患者的輻射劑量保持在盡可能低的水平。這是通過同位素的選擇來達到的，此種選擇是將最短半衰期、最少體內存留和可檢出和精確測量的同位素的最小量進行最佳結合。可結合于抗體、適于診斷成象的放射性同位素的例子包括99mTc和111In。研究表明，抗體片斷，特別是Fab和Fab′，提供有利的腫瘤/本底比(Brown，同上)。用Fab和Fab′抗體片斷制備免疫結合物是本發明的一個較佳實施方案。但是，使用T(ab)2或T(ab)′2導向載體時保持二價，導致比一價片斷高的靶部位抗體絕對量，在某些組織可導致較好的靶非靶比。為了體內診斷的目的，本發明中有用的免疫結合物還可用順磁性離子來標記。磁共振成象特別有用的元素包括GdIII、Mn、Dy和Fe離子。在本發明的一個實施方案中，將多重螯合劑分子，如DTPA，直接結合于抗體片斷的氧化輕鏈碳水化合物上，使大量順磁性離子發生螯合，而不需要中介載體。人們觀察到，某些類型中介載體的使用對用金屬螯合劑得到的磁共振成象結果具有有害的作用。例如，見Wiener，etal.，MagneticResonanceinMedicine311-8(1994)。因此，螯合劑的這種方式的直接結合消除了這種問題。在本發明的另一實施方案中，免疫結合物用聚酰胺基胺樹枝狀體作為中介載體，用于螯合基團如DTPA的附著。這種樹枝狀體被證明用作磁共振成象的順磁性離子的載體，比其它分子具有幾個優點。例如，見wiener等，同上。本發明還注目于使用免疫結合物體外檢測特殊抗原的存在。在這樣的免疫試驗中，可在液相中或結合于固體載體上來利用免疫結合物。例如，可將完整抗體或其抗原結合片斷附著于聚合物，如氨基葡聚糖，以便將抗體成分連結到不溶性支持物如聚合物包被的珠、板或管上。或者，可用本發明的免疫結合物檢測從組織學樣本制得的組織切片上特殊抗原的存在。這樣的原位檢測可通過將可檢性標記免疫結合物施用于組織切片上而完成。原位檢測可用于測定受檢測組織中特定抗原的存在和該抗原的分布。原位檢測的一般技術是本領域技術人員熟知的，例如，見Ponder，“CellMark-ingTechniquesandTheirApplication，”inMAMMALIANDEVELOP-MENTAPRACTICALAPROACH，Monk(ed.)，IRLPress，pp.115-138(187)；Coliganetal.，supra。可檢標記物，如酶、熒光化合物、電子轉移劑等，可用本領域公知的常規方法連結到載體上。這些標記載體和由它們制成的免疫結合物可用于體外免疫試驗和原位檢測，如標記物直接與抗體結合所制成的抗體結合物一樣。但是，本發明的免疫結合物載有多重標記物，在抗體或抗體片斷與靶抗原的結合只達到低程度的情況下，即可提高免疫試驗或組織學方法的靈敏度。B.免疫結合物用于治療免疫結合物可用于治療病毒和細菌感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病和癌癥。Brown，supra。這種治療的目的是將放射性、毒素或藥物的細胞毒劑量釋放到靶細胞，而使非靶組織的暴露降低到最小程度。如上面所討論的，放射性同位素通過螯合劑可直接或間接地連結到完整抗體或其抗原結合片斷上。例如，67Cu因其61.5小時半衰期和富產β粒子和γ射線而被認為是放射免疫治療較有希望的放射線同位素之一，可用螯合劑對溴乙酰胺基芐基四乙胺基四乙酸(TETA)與抗體成分結合。Chade，supra。或者，發射高能β粒子的90Y可用二亞乙基三氨基五乙酸(DTPA)，或更好用四氮雜環十二烷四乙酸(DOTA)，如此處所述，與完整抗體或其抗體片斷偶聯。抗體片斷輕鏈碳水化合物部分在多價螯合劑分子的直接結合上的應用對DOTA用作90Y螯合劑所伴有的問題提供了有吸引力的潛在的解決。現已證明，DOTA是較佳的90Y螯合劑，因為90Y-DOTA配合物的高結合常數和很低的解離速率。例如，見Cameraetal.，J.Nucl.Med.35882-888(1994)。然而，由于金屬結合很低的動力學，因而難以得到DOTA免疫結合物90Y標記上的高摻入。例如，見Wuetal.，Bioory.MedChem.Lett.4449-454(1994).Wu等(同上)最近討論了聚酰胺基胺樹枝狀體中介物用于將10-11個DOTA分子經非位點特異性方法結合于完整抗體，這增加了90Y配合率，將結合物的特異活性提高到可接受的水平。在本發明中，同樣高數量的DOTA分子可直接結合到抗體片斷的輕鏈碳水化合物上，增加了90Y配合率，使不用中間結合物而能制備高摻入的結合物。或者，在載有兩種類型碳水化合物的IgG上，輕鏈碳水化合物可和重鏈碳水化合物一起用作載半抗原的部位，從而增加免疫結合物載半抗原的容量。或者，可將類似于Wu等所用的樹枝狀體用作中間載體，可有更大量DOTA分子結合，可達到免疫結合物中90Y的更高摻入。Wu等用非位點特異性結合方法，吸達到1∶1樹枝狀體與抗體比率。在本發明中，輕鏈碳水化合物上存在大量糖殘基，它們都是潛在的結合部位，使載體抗體比率大于整體。此外，因為碳水化合物不侵害抗原結合位點，免疫結合物的免疫活性不會明顯降低。或者，可將硼附加物，如卡硼烷，連結到完整抗體或其抗原結合片斷上，如本領域所公知的，卡硼烷可制成側鏈上有羧基官能團。通過激活卡硼烷上的羧基及與載體上的胺縮合，可達到卡硼烷與載體(如氨基葡聚糖)的連結。然后將此中間結合物結合于抗體成分。在投用免疫結合物后，用熱中子輻射硼附加物，并轉化為放射性原子，這些放射性原子經α發射衰變產生高毒性、短射程效應。此外，免疫結合物可制成其中治療劑是毒素或藥物。制備這種免疫結合物有用的毒素包括蓖麻蛋白、紅豆堿、pokeweed抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素和假單孢菌內毒素。制備這種免疫結合物有用的藥物包括阿霉素、柔紅霉素、甲氨喋呤、美法林(melphalin)、苯丁酸氮芥、長春生物堿類、5-氟脲嘧啶和絲裂霉素-C。C.免疫結合物的投用通常，免疫結合物的投用劑量根據諸如患者年齡、體重、性別、一般醫學情況和已往醫學史等因素而改變。典型地較合乎需要的是提供接受者免疫結合物的劑量在約1pg/kg至10mg/kg(藥劑的量/患者體重)的范圍內，但也可投用較低或較高的劑量。例如，很多研究證明了用0.1-1.0mg劑量的成功的診斷成象，而另一些研究用超過10mg的劑量顯示定位作用改善。Brown(同上)。對于治療應用，通常每天投用約10-200mg免疫結合物，共數天。為了降低患者的敏感性，可能需要降低劑量和/或采用從其它種來的抗體和/或低變態反應性抗體，如雜交人或初級抗體。給患者投用免疫結合物可采用靜脈內、動脈內、腹腔內、肌肉內、皮下、胸膜內、鞘內注射，經區域導管輸注，可經傷口內直接注射。當注射投用免疫結合物時，可以連續輸注，或單次或多次注射。用于熱中子激活治療的載硼附加物載體的免疫結合物通常以類似的方法進行。但是，在進行中子輻射前須等到非導向免疫結合物清除掉為宜。如從美國專利No.4,624,846所獲悉的，使用第二抗體可加速這種清除。本發明的免疫結合物可按已知方法配方制成藥學上有用的組合物，免疫結合物和藥學上可接受的載體就這樣合并在混合物中。如果組合物的投用可被接受治療的患者耐受，這種組合就被叫作“藥學上可接受的載體”。磷酸鹽緩沖的滅菌鹽水是藥學上可接受的載體的一個例子。其它合適的載體是本領域技術人員熟知的。例如，見REMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENES，18thEd.(1990)。為了免疫治療的目的，以治療有效量給病人投用免疫結合物和藥學上可接受的載體。免疫結合物和藥學上可接受的載體的合用被稱作以“治療有效量”投用，如果所投量是生理學上顯著的。如果一種藥劑的存在導致接受治療的患者生理學上可測定的變化，則該藥劑是生理學上顯著的。在治療應用中，可用外加的藥學方法控制免疫結合物的作用時間。通過使用聚合物來復合或吸收免疫結合物可制成緩釋制劑。例如，生物相容性聚合物包括poly(ethylene-co-vinylacetate)基質及硬脂酸二聚物和癸二酸的聚酐共聚物基質。Sherwoodetal.，Bio/Technology101446-1449(1992)。免疫結合物從這種基質釋放的速率取決于免疫結合物的分子量、基質內免疫結合物的量和分散的顆粒的大小。Saltzmanetal.，Biophysical.J.55163-171(1989)；andSherwoodetal.，supra。其它固體劑型在REMINGTON′SPHARMA-CEUTICALSCIENCES，18thEd.(1990)中描述。在一般描述本發明后，通過參考下面的實施例將更容易理解本發明，這些實施例是作為例證提出的，除非詳細說明，它們不是為了限制本發明。實施例1用在輕鏈可變區FR1區域缺乏天然存在的Asn糖基化位點的單克隆抗體制備免疫結合物(a)通過誘變引入Asn糖基化位點通過改變編碼氨基酸殘基18-20的核苷酸序列，在單克隆抗體輕鏈可變區FR1區域的第18位氨基酸上引入Asn糖基化位點。作為例示，在用MPC-11細胞制成的鼠單克隆抗體PKAPPA(11)24的輕鏈可變區骨架1序列上發現氨基酸序列Arg18Val19Ser20(Rabbittsetal.，Can.J.Biochem.58176-187(1980)；Kabatetal.，SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGI-CALINTEREST，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices(1993))。18位上的Arg殘基是由AGG序列編碼的(同上)。因此，誘變技術的目的是將核苷酸序列從AGG改變成編碼Asn的AAC。按照Orlandi等的一般方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA863833-3837(1989)。用聚合酶鏈反應(PCR)技術引入Asn糖基化位點。在此方法中，從約5×108MPC-11細胞(ATCCCCL167)制備細胞總RNA，用標準方法在寡(dT)纖維素上從總RNA選出mRNA。用VKIFOR引物，即Orlandi等描述的VK區3′引物，進行第一股cDNA合成。將含10μgmRNA、20pmolVKIFOR引物、250μM每一dNTP、10mM二硫蘇糖醇、100mMTris-HCl(pH8.3)、10mMMgCl2和140mMKCl的50μl反應混合物70℃培育10分鐘，然后冷卻。加入逆轉錄酶(46單位)，將混合物42℃培育1小時。反應混合物90℃加熱5分鐘終止反應。或者，采用以VKIFOR為引物的SUPERSCRIPTTM預擴增系統(Gibco/BRL；Gaithersburg，MD)，從MPL-11細胞所得的細胞總RNA合成第一股cDNA，除了第18-20氨基酸編碼Asn糖基化位點的外，用編碼VK區開頭20個氨基酸的5′引物擴增VK序列。如上所述，在本實施例中，18位氨基酸殘基由AAC編碼。PCR反應混合物含10μl第一股cDNA產物，9μl10×PCR緩沖液(500mMKCl、100mMTris-HCl(pH8.3)，15mMMgCL2和0.01％(W/V)明膠)，5μlVKIFOR和5′引物，及5單位AMPLITAQTMDNA聚合酶(PerkinElmerCetus；Norwalk，CA)。將混合物用石蠟油復蓋，用預設計加熱程序板控制溫度循環30次。典型的循環包括94℃變性1分鐘，50℃退火1.5分鐘和72℃聚合1.5分鐘。將DNA樣品用乙醚提取2次，苯酚提取1次，苯酚/氯仿提取1次，然后用乙醇沉淀。或者，可用下面的瓊酯糖電泳提純DNA樣品。用標準技術在2％瓊酯糖凝膠上提純擴增了的VK片斷。然后用限制性內切酶PvuII和BglII消化約300個堿基對的VK片斷，并連結到克隆化載體的互補限制區。各種克隆化載體均有市售。例如，pGEMTM載體(Promega；Madison，WI)和ZAPEXPRESSTM載體(StratageneCloningSystems；LaJolla，CA)對于克隆VK片斷是有用的。或者，可使用含合適的免疫球蛋白啟動子和引導(leader)序列的載體。例如，見Orlandietal.，supra。用標準的氯化鈣方法將連結的DNA轉化到DHSα活化的大腸桿菌細胞。為了分析克隆化的DNA，在SOC(2％細菌用胰胨、0.5％細菌用一酵母浸膏、10mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4、和10mM葡萄糖)中將轉化體(transformants)37℃培養過夜。SOC培養基含適當的抗生素以選擇含載體的細菌得以生長。例如，SOC培養基含50μg/ml氨芐西林以選擇攜帶pGEMTM載體的細菌得以生長。用標準技術制備克隆的小質粒(Miniplasmid)DNA制品。并用其作限制消化分析。用Sangeretal.，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA755463-5467(1977))的二脫氧法對陽性克隆的DNA測序。用DNA序列測定結果確認PCR反應并未引入不需要的突變，突變是在18-20區域引入的。(b)哺乳動物細胞的轉染用限制性內切酶從staging載體切下含18位上有Asn糖基化位點的VK序列的DNA片斷。然后將此DNA片斷克隆進合適的哺乳動物表達載體。這一表達載體應含恒定區、免疫球蛋白強化因子、強化因子和藥物選擇標記物的編碼序列(例如，勻霉素抗性基因)。例如，見Orlandietal.，supra。用標準技術，通過電插入將含突變VK區的線性化輕鏈表達載體10μg和線性化重鏈表達載體10-30μg共轉染到哺乳動物細胞中。例如，用Coetal.，J.Immunol.1481149-1154(1992)的技術或用Sambrooketal.，supra，或CURRENTPROROCOLSINMOLECULARBIOLOGY，Ausubeletal.，eds.，JohnWiley&Sons(1989)中描述的類似技術，轉染約106個SP2/0-AG14非分沁性骨髓瘤細胞(ATCCCRL1581)。轉染后，細胞在96孔微量滴定板上在無血清完全雜并瘤培養基(GIBCO/BRL)中于37℃、5％二氧化碳下生長。兩天后，加入含適當選擇藥物(如勻霉素)的培養基開始選擇過程。典型地，在電插入后2-3周形成克隆。將克隆轉移到24孔碟上進行擴展。(c)分泌抗體的轉染瘤克隆的測試用ELISA測試法選擇分泌抗體的轉染瘤克隆。簡言之，將從融合孔得到的上清液稀釋，每種稀釋液100μl，加三份到用綿羊抗小鼠IgG特異性抗體(TheBindingSiteLtd.；SanDiego，CA)預包被的ELISA微量滴定板上。微量滴定板室溫培養1小時后，用洗滌緩沖液(含0.05％聚山梨醇酯-20的PBS)洗板三次，除去未結合的蛋白質。使結合的抗體與聯結了過氧化物酶的山羊抗小鼠IgG特異性抗體(HyCloneLabratories；Logan，Utah)反應。用洗滌緩沖液洗板三次后，每孔加100μl底物溶液(3.3mg/ml鄰苯二胺和0.12％過氧化氫(以0.02M檸檬酸鹽緩沖液，pH(5.0)配成))。在黑暗中顯色30分鐘，每孔加入50μl4MHCl停止反應。用自動ELISA板讀數儀(Bio-TekInstrument；Winooski，VT)測定在490nm處吸光度。或者，用以山羊抗人Fab或κ特異性抗體(JacksonImmunoResearch；WestGrove，PA)包被ELISA微滴定板和用聯結過氧化酶的山羊抗人Fc特異性抗體(JacksonImmunoResearch；WestGrove，PA)測定結合抗體，可檢測嵌合的或人化的突變抗體。(d)抗體純化和分析使轉染瘤生長成500ml無血清培養基的培養物，直至融合。將培養物離心使細胞成團，上清液經0.2μ膜過濾。使上清液依靠重力以0.5-1ml/分速率通過3mlA蛋白柱，分離抗體。然后用20mlPBS洗柱，用含0.1M甘氨酸和10mMEDTA的溶液(pH3.5)10ml洗脫結合的抗體。在10μl3MTris(pH8.6)的存在下，收集1ml洗脫部分。測定在280nm處吸光度，檢出抗體的存在，將顯示本底以上吸光度的洗脫部分集中，過濾，對PBS透析，用Centricon30(Am-icon；Beverly，MA)濃縮。抗體的最終濃縮液用ELISA測定，用含0.01％(W/V)疊氮化鈉的PBS將抗體濃縮液調整為1mg/ml。用標準技術，在還原條件下，通過純化的抗體或抗體片斷在4-20％梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的電泳，確定輕鏈糖基化作用。例如，見CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY，Coliganetal.，eds.，JohnWiley&Sons(1991)。輕鏈糖基化的存在以較高的表觀分子量和多條輕鏈帶的存在為象征。(e)結合物的制備如下面所述，可用直接或間接方法得到免疫結合物。實施例2抗體片斷的制備通過誘變重鏈表達載體中的重鏈結構基因，可從轉染瘤得到Fab、Fab′、F(ab)2或F(ab′)2片斷。通過插入接著CH1區序列的終止密碼子完成Fab表達。可是，Fab′或F(ab′)2表達是通過在編碼重鏈絞鏈區的序列后插入終止密碼子而完成的。用Coliganetal.，supra所描述的體積排阻色譜法、離子交換色譜法或親和層析法，從轉染瘤培養物上清液中提純抗體片斷。或者，用一種市售純化系統，和QuickMAB柱(Sterigen；SantaClara，CA)，來純化片斷。或者，可用蛋白分解從完整抗體制備抗體片斷。這些技術是本領域技術人員熟知的。例如，見Coliganetal.，supra，pp.2.8.1-2.8.10。也見Stanworthetal.“ImmunochemicalAnalysisofHumanandRabbitImmunoglobulinsandTheirSubunits，”inHANDBOOKOFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY，Vol.1，D.M.Weir，ed.，BlackwellScientificpp12.1-12.46(1986)和Parham，“PreparationandPurificationofActiveFragmentsfromMouseMonoclonalAntiobidies，”Id.atpp.14.1-14.23。作為例子，可用預活化的木瓜蛋白酶從得自IgG2a和IgG2b的IgG1或Fab片斷制備F(ab)2片斷，如下所述。木瓜蛋白酶的激活方法是將2mg/ml木瓜蛋白酶(2×重結晶的懸浮液，Sigma#P3125)和0.05M半胱氨酸(游離堿，結晶形；Sigma#C7755)在37℃水浴中培養30分鐘。為了除去半胱氨酸，將木瓜蛋白酶/半胱氨酸混合物施加于以20ml乙酸鹽/EDTA緩沖液(0.1M乙酸鹽，3mMEDTA，pH5.5)平衡過的PD-10柱(Pharmacia#G-25)。測量在280nm處的吸光度來分析流分，合并含蛋白質的2個或3個流分。用下式得出預活化木瓜蛋白酶的濃度吸光度280nm/2.5＝預活化木瓜蛋白酶mg/ml為了制備用于消化的抗體，用10mg抗體，在2-5mlPBS中，對乙酸鹽/EDTA緩沖液透析。將500μg預活化木瓜蛋白酶加到透析過的抗體溶液中，將混合物渦旋。在37℃水浴中培養6-12小時后，加入結晶碘乙酰胺(Sigma#I6125)至終濃度為0.03M，使木瓜蛋白酶失活。然后將混合物對1升PBS(pH8.0)4℃透析6-12小時。為了除去未消化的抗體和Fc片斷，將混合物施加于用PBS(pH8.0)平衡過的A蛋白-瓊脂糖柱。按每份2ml收集未結合的流分，并合并，濃縮至總體積為5ml或小于5ml后，用體積排阻色譜法將蛋白質分級，用SDS-PAGE分析結果。實施例3在F(ab′)2片斷輕鏈可變區的FR1區域的碳水化合物部分直接結合(a)鼠LL2F(ab′)2片斷與螯合劑的結合LL2是已顯示對非何杰金氏(Non-Hodgkins)B細胞淋巴瘤的診斷和治療有效的鼠單克隆抗體(Goldenbergetal.，J.Clin.Oncol.9548-564(1991)；Murthyetal.，Eur.J.Nucl.Med.19394-401(1992))。LL2F(ab′)2片斷與氨基芐基DTPA(DTPA)或含長鏈連結物的DTPA衍生物-CSNH(CH2)10NH2(LC-DTPA)結合。簡言之，通過用偏高碘酸鈉(5.68mg/ml的溶液210μl)0℃處理1小時，使在約1ml用50mM乙酸鹽緩沖的0.9％鹽水(ABS；pH5.3)中的LL2F(ab′)2片斷(2.5mg)在黑暗中氧化。將反應混合物用乙二醇(20μl)處理以分解未反應的高碘酸鹽，用以PBS(pH6.1)平衡過的SephadexG-50/80柱(Pharmacia；Piscataway，NJ)純化已氧化的抗體片斷。然后將氧化的片斷與過量DTPA或LC-DTPA反應。室溫下經40小時后，用NaBH3CN還原Schiff堿。用以0.1M乙酸鹽(pH6.5)平衡的離心過的體積排阻柱(SephadexG-50/80)提純結合的抗體。測定在280nm處吸光度，測得抗體結合物的濃度。用金屬結合試驗測得每分子抗體片斷的螯合劑分子比。該試驗是這樣進行的將等分試樣LL2F(ab′)2-螯合劑結合物與0.1M乙酸銨(pH7)和2M三乙醇胺混合，將混合物與加了乙酸鈷57的已知過量的乙酸鈷在室溫下培養。30分鐘后，加入EDTA(pH7)至終濃度10mM。再培養10分鐘后，用即時薄層色譜法(ITLC)分析混合物，用10mMEDTA展開。通過在γ-計數儀上將ITLC條分段計數測得結合于抗體的放射活性的部分。結果表明，每個抗體片斷有約6分子DTPA，每個抗體片斷有約5分子LC-DTPA。(b)LL2F(ab′)2-螯合劑結合物的免疫反應性測定用ELISA試驗測定LL2F(ab′)2-DTPA和LL2F(ab′)2-LC-DTPA結合物的免疫反應性。結果證明，LL2F(ab′)2與DTPA和LC-DTPA的結合物顯示同樣的對LL2抗獨特型抗體的結合活性。此外，在競爭結合試驗中測試LL2F(ab′)2-DTPA和LL2F(ab′)2-LC-DT-PA結合物的免疫反應性。在這些實驗中，用人嵌合LL2(IgG/κ)與LL2F(ab′)2或其結合物競爭對Raji淋巴瘤細胞(ATCCCCL86)的結合。將Raji細胞在補充了10％胎牛血清和2mML-谷氨酰胺的DMEM培養基中培養。細胞維持于37℃、5％二氧化碳中。細胞培養基和成分得自Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)。在這些研究中，在各種濃度LL2F(ab′)2或其結合物存在下，在補充了1％胎牛血清和0.01％(W/V)疊氮鈉的PBS100μl(終體積)(PBS-FA)中，將1μg嵌合LL2(IgG/κ)與5×105個Raji細胞一起培養。混合液于4℃培養30分鐘，然后用PBS洗滌三次，除去未結合的抗體。加入含以異硫氰酸熒光素標記的山羊抗人Fc特異性抗體的溶液(在PBS-FA中的貯備液20倍稀釋濃度)100μl，4℃培養30分鐘。測定競爭后嵌合LL2殘余結合程度，用PBS洗滌混合物三次后，用FACSCAN熒光激活細胞分檢器測定熒光強度。這些研究的結果證明，LL2F(ab′)2和其結合物顯示同樣的對Raji細胞的結合。因此，這些研究證明，兩種結合物與未結合的LL2F(ab′)2片斷相比，均有免疫反應并顯示結合活性。(c)用111銦標記LL2F(ab′)2-螯合劑結合物用111銦標記如下。用乙酸銨將氯化銦111緩沖于pH5.5，使乙酸鹽終濃度為約0.2M。加乙酸銦111到LL2F(ab′)2-結合物的0.1M乙酸鹽(pH6.5)溶液中，混合物培養約1小時。反應混合物含9.7μgLL2F(ab′)2-DTPA和72.6μCi111銦，或10μgLL2F(ab′)2-LC-DTPA和126.7μCi111銦。通過將標記混合物與10mMEDTA培養10分鐘，接著作ITLC測定，用10mMEDTA展開，分析111銦的摻入程度。在此試驗中，未結合的111銦移動到溶液前沿，而抗體結合的111銦保留在原位。通過ITLC(與人血清蛋白共同點樣)，用水∶乙醇∶氨(5∶2∶1)溶液展開，測試任何膠態111銦的存在。在此系統中，原位的放射活性部分代表膠態111銦。此外，用放射性高壓液相色譜法(放射性HPLC)分析全部標記混合物。這些研究結果表明，111銦標記的LL2F(ab′)2-DTPA有7.47μCi/μg蛋白質的比放射性，用ITLC測定111銦摻入量為97.4％，或用放射性-HPLC測定111銦摻入量為92.5％。另外，111銦標記的LL2F(ab′)2-LC-DTPA的比放射性為12.67μCi/μg蛋白質，111銦摻入95.6％(用ITLC測定)或94％(用放射性HPLC測定)。膠態111銦的量典型地為約1-3％。(d)用90釔標記如上所述制備LL2F(ab′)2-螯合劑結合物。用90釔標記結合物如下。簡言之，將市售氯化釔90(DuPontNEN；17.68μl；5.63mCi)用35.4μl0.5M乙酸鹽(pH6.0)緩沖。將溶液室溫下放置5-10分鐘，然后用于放射標記。90釔標記的LL2F(ab′)2-DTPA是這樣制備的乙酸釔90(128.7μCi)和LL2F(ab′)2-DTPA(30μg；8.3μl)混合，室溫下培養1小時，用90μl0.1M乙酸鹽(pH6.5)稀釋。90釔標記的LL2F(ab′)2-LC-DTPA的制備乙酸釔90(109.5μCi)和LL2F(ab′)2-LC-DTPA(30μg；7.6μl)混合，室溫下培養1小時，用90μl0.1M乙酸鹽(pH6.5)稀釋。如上所述，在兩個溶劑系統用ITLC和HPLC檢測標記過程的結果。90釔標記的LL2F(ab′)2-DTPA的比放射性為4.29μCi/μg蛋白質，而90釔標記的LL2F(ab′)2-LC-DTPA的比放射性為3.65μCi/μg蛋白質。放射性HPLC分析表明，LL2F(ab′)2-DTPA中摻入90釔96％，而LL2F(ab′)2-LC-DTPA中摻入90釔90％。實施例4F(ab′)2片斷輕鏈可變區FR1區域碳水化合物部分的間接結合(a)中間結合物的制備用Shih等的方法(Int.J.Cancer41832-839(1988))，將鼠LL2F(ab′)2片斷經葡聚糖與阿霉素結合。簡言之，溶解1g葡聚糖(m.w.18KD；SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)在70ml水中制備氨基葡聚糖。加入0.5g偏高碘酸鈉將葡聚糖部分氧化生成多醛葡聚糖，溶液室溫下攪拌過夜。用Amiconcell(YM10膜；MWCO＝10,000)濃縮混合物后，用SephadexG-25色譜法提純多醛葡聚糖后，冷凍干燥，得到約900g白色粉末。然后用2當量1，3-二氨基-2-羥基丙烷在水相中在室溫下將多醛葡聚糖處理24小時。向混合物中加入氫硼化鈉(每2.15mmol1，3-二氨基-2-羥基丙烷加0.311mmol)使生成的Schiff堿穩定化。將混合物室溫培養6小時。用SephadexG-25柱提純氨基葡聚糖。阿霉素(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)的活化在干的反應小瓶中的0.1mmol阿霉素中加入1ml無水DMF，再加入N-羥基琥珀酰亞胺(23mg，0.2mmole；Sigma)的無水DMF(750ml)溶液和1，3-二環己基碳化二亞胺(41.5mg，0.2mmol；Sigma)的無水DMF(750μl)溶液。在無水條件下，將反應混合物在室溫下、黑暗中攪拌16小時。在此溶劑系統中，副產物，即脲衍生物不能很好地沉淀。將沉淀離心，溶液存于-20℃密封瓶中。將氨基葡聚糖(18KD；10mg)溶解在2mlPBS(pH7.2)中，逐漸加入0.7ml上述N-羥基琥珀酰亞胺活化的阿霉素溶液，制成阿霉素-葡聚糖中間結合物。每摩爾氨基葡聚糖存在50摩爾阿霉素。溶液在室溫下攪拌5小時，除去沉淀后，用SephadexG-25柱提純結合物。阿霉素-葡聚糖結合物的特征是阿霉素/葡聚糖之比為14。或者，如Shih等(Int.J.Cancer41832-839(1988))所述，將阿霉素與1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺反應，制成阿霉素-葡聚糖結合物。又見Shihetal.，CancerResearch514192-4198(1991)。(B)中間結合物與LL2F(ab′)2的位點特異性連接通過用偏高碘酸鈉(800μl21.5mg/ml溶液)室溫處理60分鐘，將5mlPBS(pH5.5)中的LL2F(ab′)2片斷(25mg)在黑暗中氧化。用乙二醇(50μl)處理反應混合物，使未反應的高碘酸鹽分解，用以0.05MHEPES(pH7.4)平衡的SepadexG-25柱提純氧化的抗體片斷。然后將氧化的片斷濃縮成5mg/ml(在0.05MHEPES(pH7.4)中)，并與阿霉素-葡聚糖結合物(22mg)反應。室溫下24小時后，用NaBH3CN還原Schiff堿。用SephadexCL-6B柱提純結合的抗體。用這種方法，可以將約9個阿霉素分子偶聯在1個LL2F(ab′)2片斷上，在輕鏈可變區FR1區域的碳水化合物位點上。這個比值是通過測阿霉素濃度(A482)和蛋白質濃度(A280)而確定的。用上述流動細胞計數法測得，結合物保留了未結合LL2F(ab′)2片斷的80％免疫活性。實施例5人化MN14的VKFR1區域上Asn偶聯的糖基化位點的引入將Asn偶聯的糖基化位點引入人化MN14的VKFR1區域，這是結合癌胚抗原的抗體。簡言之，用實施例1中所述的PCR法，將編碼Arg18的核苷酸序列誘變成編碼Asn18的核苷酸序列。在這種情況下，將從用于人化MN14的輕鏈表達載體而來的DNA用作PCR模板。將Orlandi等的VKFORI引物用作3′端引物。5′端引物由編碼MN14VK區開頭20個氨基酸的57聚物組成，除了在18位編碼Asn的密碼子之外。將約300個堿基對的PCR產物用PvuII和BglII消化，并連接到staging或克隆化載體的互補位點上。采用標準的氯化鈣方法，如見Ausubeletal.，supra，用staging或克隆化載體轉化DH5α活性細胞。將含有在18位氨基酸上有Asn-糖基化位點的人化MN14VK序列的DNA片斷亞克隆進帶pShyg的輕鏈表達載體。用線性化輕鏈表達載體和用線性化重鏈表達載體通過電插入將SP2/0-AG14非分泌性骨髓瘤細胞共轉染。用勻霉素-B選擇轉染瘤，并培養產生抗體。在SDS-PAGE還原凝膠上純化和分析抗體。糖基化的人化MN14的輕鏈與非糖基化的MN14輕鏈相比，移動成多條帶，并以較高的分子量移動。此結果表明，新的Asn偶聯的糖基化位點被用于碳水化合物加成。顯然，糖基化MN14抗體和非糖基化MN14抗體的MN14阻斷活性被發現是基本相同的。因此，在人化MN14的VKFR1區上的糖基化并不影響免疫反應性。實施例6F(ab′)2片斷輕鏈可變區FR1區域的碳水化合物部分上DOTA的直接結合(a)鼠RS7F(ab′)2片斷與DOTA的結合MAbRS7是對肺、胃、膀胱、乳房、卵巢、子宮和前列腺癌有反應性的快速內在化抗體(Steinetal.，1990，CancerRes.，501330-1336)。用上面描述的方法，將糖基化位點NVT引入RS7的VK區18-20位上。如上所述，將糖基化的RS7在SP2/0-AG14骨髓瘤細胞中表達，制備F(ab′)2。將2mgRS7的F(ab′)2片斷用1ml0.1M磷酸鹽緩沖的0.9％氯化鈉溶液(pH7.2)(PBS)配制，在其中加入400μl2.84mg/ml偏高碘酸鈉。將反應混合物在黑暗中、室溫下攪拌90分鐘，加入20μl乙二醇終止氧化反應。在用PBS(pH6.1)平衡的SephadexG-25體積排阻柱(Pharmacia；Piscataway，NJ)提純氧化的抗體片斷。用Centricon30(Amicon；Beverley，MA)將抗體再濃縮成2mg/ml，用過量2-對氨基芐基-1，4，7，10-四氮雜環十二烷四乙酸(NH2-B2-DOTA)處理。將混合物4℃反應48小時。加入10倍摩爾過量(對抗體而言)的氰基硼氫鈉，接著攪拌30分鐘，使Schiff堿就在混合物中還原。用離心體積排阻柱(SephadexG-50/80)提純DOTA-F(ab′)2結合物，該柱用酸洗的成分和無金屬緩沖介質制成，以0.1M乙酸鹽緩沖的0.9％氯化鈉溶液(ABS，pH6.5)平衡過。用在280nm處的吸光度測定抗體結合物的濃度，用實施例3所述鈷57結合試驗測定每摩爾抗體的螯合劑的比例。用81μl0.5MABS(pH6)處理市售氯化釔90(8.9mCi，27μl)，將溶液渦旋混合，放置15分鐘，然后用于下面的標記。在酸洗過的塑料小瓶中所放的DOTA標記的RS7F(ab′)2結合物(1mg，73μl)中，加入乙酸釔90(4.94mCi，60μl)ABS液。將小瓶內容物輕輕地渦旋混合，于室溫下放置1小時。然后，邊攪拌邊向標記的小瓶中加入850μl0.1MABS。如實施例3所述，用二溶劑系統即時薄層色譜法和高效液相色譜法測試標記結果。實施例7用聚酰胺基胺樹枝狀體作為中間載體在F(ab′)2片斷輕鏈可變區FR1區域的碳水化合物部分的間接結合(a)中間結合物的制備將按上述氧化的鼠RS7F(ab′)2片斷，通過形成2個聚酰胺基胺樹枝狀體，與DOTA結合。樹枝狀體用Tomalia等的方法(Angew.Chem.Int.Ed.En-gl.29138-175(1990))制備。將樹枝狀體(10μM，在8ml水中)與150μM2-(對-異硫氰酸根合芐基)-1，4，7，10-四氮雜環十二烷基四乙酸在40℃、pH9的條件下反應24小時，周期性加入0.2MNaOH以維持溶液pH于9.0。用配有3000MW截值濾膜的攪拌室(stirredcell)(Amicon，MA)進行超濾，除去未反應的配基。冷凍干燥后，將樹枝狀體螯合劑結合物再懸浮于ABS，如實施例6所述，結合到RS7F(ab′)2片斷上。實施例8Hz-PEQ(甲氧基聚乙二醇酰肼)與F(ab′)2輕鏈碳水化合物部分的結合結合草案(a)在pH6、0℃條件下，用高碘酸鈉(20mM終濃度)將IMMU-LL2-F(ab′)2碳水化合物部分氧化90分鐘。以離心沉降柱(centrifugedspin-column)技術，用SephadexG-50-80，在PBS(pH6.0)中，從過量的高碘酸鹽中分離出氧化的片斷。加入摩爾過量(50和300倍)的甲氧基-PEG酰肼(MW5000，ShearwaterPolymers，Inc.，Hunts-ville，AL)，到純化的氧化中間體中，得到腙鍵合。反應在室溫下進行2小時。用含SephadexG-50-80，0.1M磷酸鈉(pH7)的離心沉降柱提純產物，用體積排阻HPLC，采用BioSilSEC-400柱，以0.2M磷酸鈉，0.02％疊氮化鈉(pH6.8)洗脫，對產物進行分析。結果表明，采用50倍摩爾過量的反應，有16％未修飾的F(ab′)2，采用300倍摩爾過量的Hz-PEG反應，只有2.3％未修飾的F(ab′)2。結合草案(b)在26℃下，用29.4μl0.5MNaIO4(700×2.1×10-8mol)將IMMU-LL2F(ab)2，200μl(2.1mg，2.1×10-8mol)氧化45分鐘。在兩個連續的2.4ml離心沉降柱(SephadexG-50-80，0.1M磷酸鈉，pH7)上從過量NaIO4中分離出氧化的片斷。將205μl(1.52mg，1.52×10-8mol)氧化的IMMU-LL2F(ab′)2與22.8mg(300×1.52×10-8mol)甲氧基-Hz-PEG(MW5000)于25℃培養1小時，完成甲氧基-Hz-PEG與氧化的片斷的結合。在Sephadex-G-50-80沉降柱(4個連續的2.4ml柱)上提純結合物，用0.1M磷酸鈉(pH7)洗脫。在用0.2M磷酸鈉、0.15M氯化鈉、0.02％疊氮鈉(pH6.8)洗脫的BioSil400體積排阻柱上進行的HPLC分析顯示兩個新的峰7.4分鐘(16.9％)和8.3分鐘(83.1％)。實施例9雙官能團螯合劑(5)的制備下面的實施例闡述了本發明中所用的特別好的雙官能團螯合劑的制備方法。用本實施例中制備的雙官能團螯合劑放射性標記具有側基巰基的蛋白質或抗體，并在放射免疫成象或放射免疫治療方法中使用標記的蛋白質或抗體，這屬于本領域技術人員的技術范圍之內。反應順序如下所示。(a)向冷卻于4℃氬氣下的N-ε-(叔丁氧基羰基)賴氨酸的四氫呋喃(THF)溶液中，邊攪拌邊滴加甲硼烷-四氫呋喃復合物(1當量)。2小時后，通過小心加入含水THF使過量甲硼烷分解。然后將反應混合物與5M氫氧化鈉一起回流10-18小時，分解硼酸酯。此含水溶液用氯仿完全提取，用鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，在旋轉蒸發器上濃縮至干，得到2-氨基-6-N(叔丁氧基羰基)氨基-1-己醇(1)。(b)將化合物(1)于4℃下溶于乙醇，并在溶液中通入甲醛氣體(在氬氣流中加熱仲甲醛而制成)10分鐘。然后緩緩加入硼氫化鈉(10當量)，溫度保持于4℃。將混合物蒸發至干，滴加0.1MHCl到殘渣中，接著很快地加入飽和碳酸氫鈉溶液。該溶液以乙酸乙酯萃取，鹽水洗滌，有機層用無水硫酸鈉干燥，并濃縮至干。產物再用甲醛和硼氫化鈉作如上處理，得到2-(N，N-二甲基氨基)-6-〔N-(叔丁氧基羰基)氨基〕-1-己醇，(2)。(c)在4℃下，向(2)的二氯甲烷溶液中加入無水碳酸鉀(20當量)，將懸浮液劇烈攪拌，同時滴加過量亞硫酰氯。1小時后，在旋轉蒸發器上除去溶劑和過量亞硫酰氯，殘渣用乙酸乙酯得取。蒸發至干，得到1-(N，N-二甲基氨基)-5-(叔丁氧基羰基)氨基-1-氯甲基戊烷，(3)，如果需要，該產物可用硅膠色譜法進一步提純。(d)向(3)的甲苯溶液中加入1，8-二氮雜二環〔5.4.0〕十一碳-7-烯(2.2當量)，接著加硫代苯甲酸(1.1當量)，將溶液回流出熱。在硅膠板上用薄層色譜法(TLC)監測反應的進程，用5％磷鉬酸甲醇液顯色。反應完成時，將有機提取物蒸發至干，殘渣再溶于氯仿，用水洗一次，用無水硫酸鈉干燥，蒸發，得到粗品S-苯甲酰基-2-(N，N-二甲基氨基)-5-(叔丁氧羰基)氨基硫醇，(4)。用快速色譜法將此化合物進一步提純。(e)在室溫下邊攪拌邊向(4)的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸(10當量)。2小時后，將溶劑蒸發至干，得到(5)，該產物直接用于和抗體片斷氧化的碳水化合物部分結合。實施例10雙官能團螯合劑(5)與氧化抗體的偶聯將LL2F(ab′)2片斷(2.5mg)放在約1ml50mM乙酸鹽緩沖的0.9％鹽水(ABS；pH5.3)中，在黑暗中，用偏高碘酸鈉(210μl5.68mg/ml的溶液)0℃處理1小時，進行氧化。反應混合物用乙二醇(20μl)處理，分解未反應的高碘酸鹽，將氧化的抗體片斷用以PBS(pH6.1)平衡的SephadexG-50/80粒(Pharmcia；Piscataway，NJ)提純。然后將氧化的片斷與過量螯合劑(5)反應。室溫下反應40小時后，用NaBH3CN還原希夫氏堿。用以0.1M乙酸鹽(pH6.5)平衡的離心體積排阻柱(SephadexG-50/80)提純結合抗體。測定280nm處吸光度，測得抗體結合物的濃度。實施例11雙官能團螯合劑(10的制備(6)R′＝Boc，R″＝CH2CO21Bu，R＝OH(7)R′＝Boc，R″＝(CH2)2OH，R＝OH(8)R′＝Boc，R″＝(CH2)2Cl，R＝Cl(9)R′＝Boc，R″＝(CH2)2SCOPh，R＝SCOPh(a)邊攪拌邊向2-氨基-6-N(叔丁氧羰基)氨基-1-己醇(1)的無水乙腈溶液中加入無水碳酸鈉，接著加溴乙酸叔丁酯(2.2當量)。將混合物回流攪拌6-10小時，然后用乙酸乙酯提取。溶液蒸發至干，用硅膠色譜法提純，得到(6)，得率68-75％。(b)在室溫下，邊攪拌邊向(6)的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸(10當量)。1小時后真空除去溶劑，殘渣溶于干THF。將溶液冷卻至4℃，經15分鐘滴加甲硼烷-THF復合物(3當量)。攪拌2小時后，用含水THF分解過剩的甲硼烷，通過與5M氫氧化鈉水溶液回流10-18小時分解硼酸酯。用乙酸乙酯提取混合物，用鹽水洗滌有機溶液，用無水硫酸鈉干燥，真空蒸發至干。殘渣用THF∶水(1∶1)溶解，用0.1MNaOH將pH調至10。分次加入碳酸二丁酯(Di-t-butyldicarbonate)(2.2當量)，需要時加0.1MNaOH保持pH于9-10。完成加成反應后1小時，將溶液用乙酸乙酯萃取，有機層干燥，真空蒸發。殘渣用硅膠色譜法得到(7)。(c)向冷卻至4℃的(7)的氯仿溶液中加入無水碳酸鉀(20當量)，懸浮液劇烈攪拌，同時滴加過量亞硫酰氯。1小時后，在旋轉蒸發器上除去溶劑和過量的亞硫酰氯，殘渣用乙酸乙酯提取，蒸發至干，得到(8)。(d)向(8)的甲苯溶液中加入1，8-二氮雜二環〔5.4.0〕十一碳-7-烯(1.8當量/氯化物基團)，接著加入硫代苯甲酸(1.4當量/氯化物基團)，將溶液回流加熱。在硅膠板上用薄層色譜法(TLC)監測反應的進程，用5％磷鉬酸乙醇液顯色。當反應完成時，將有機提取物蒸發至干，殘渣再溶于氯仿，用水洗1次，用無水硫酸鈉干燥，真空蒸發，得到粗品(9)，該產物用快速色譜法提純。(9)的1HNMR譜(400MHz)顯示信號于7.95(m，6H)，7.55(t，3H，J＝8)，7.42(m，6H)，3.25-2，75(m，13H)，1.6-1.2(m，6H)，1.44(s，9H)。(e)在室溫下邊攪拌邊向(9)的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸(10當量)。24小時后將溶劑蒸干，得到(10)，如面的實施例10所述，該產物直接用于結合反應。實施例12雙官能團螯合劑(14)的制備(11)R′＝OH，R″＝NO2(12)R′＝OH，R″＝NHBoc(13)R′＝SCOPh，R″＝NHBoc(14)R′＝SCOPh，R″＝NH2(a)向二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)二酐的DMF溶液中加入三乙胺(1當量)，接著加入4-硝基苯乙胺(0.25當量)。攪拌2小時后，加入0.1MNaOH(過量)。1小時后，用0.1MHCl將溶液酸化，真空蒸發。將有機殘渣溶解在無水THF中，用硫酸鎂干燥，冷卻于4℃。經15分鐘滴加甲硼烷-THF復合物(6當量)。攪拌2小時后，加入0.1MHCl分解硼酸酯。加入過量飽和碳酸氫鈉溶液，用乙酸乙酯提取混合物。有機溶液用鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，真空蒸干，得到(11)。(b)邊攪拌邊向(11)的甲醇溶液中加入鈀炭催化劑(0.1當量)。將懸浮液置于氫氣氛圍下，使還原反應進行到TLC指示無(11)存在。將反應混合物用氬氣吹掃3次，濾去催化劑，蒸發至干。用THF∶水(1∶1)溶解殘渣，用0.1MNaOH調節pH至10。分次加入碳酸二叔丁酯(2.2當量)，需要時加0.1MNaOH使pH維持于9-10。加成反應完成1小時后，將溶液用乙酸乙酯萃取，真空蒸發。殘渣用硅膠色譜法得到(12)。(c)在4℃下，向(12)的氯仿溶液中加入無水碳酸鉀(20當量)，將懸浮液劇烈攪拌，同時滴加過量亞硫酰氯。1小時后，在旋轉蒸發器上除去溶劑和過量亞硫酰氯，殘渣用乙酸乙酯提取。真空除去溶劑，將殘渣溶解在甲苯中。加入1，8-二氮雜二環〔5.4.0〕十一碳-7-烯(2.2當量)，接著加入硫代苯甲酸(1.1當量)，溶液加熱回流。5小時后，蒸干有機提取物，將殘渣再溶于氯仿，用水洗一次，用無水硫酸鈉干燥，真空蒸發，得到粗品(13)，該產物用快速色譜法進一步提純。(d)在室溫下，向(13)的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸(10當量)。2小時后蒸干溶劑，如上面實施例10所述，殘渣直接用于結合反應。實施例13雙官能團螯合劑(19)的制備(15)R′＝CO2′Bu，R″＝O′Bu(16)R′＝CH2OH，R″＝NH(CH2)2-p-C6H4NO2(17)R′＝CH2OH，R″＝NH(CH2)2-p-C6H4NHBoc(18)R′＝CH2SCOPh，R″＝NH(CH2)2-p-C6H4NHBoc(19)R′＝CH2SCOPh，R″＝NH(CH2)2-p-C6H4NH2(a)向1，4，8，11-四氮雜環十四烷的無水乙腈溶液中加入無水碳酸鈉，接著加入溴乙酸叔丁酯(6當量)。將混合物加熱回流6-10小時，然后用乙酸乙酯提取。蒸干溶液，用硅膠色譜法提純，得到(15)。(b)在室溫下向(15)的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸(10當量)。24小時后，將溶劑蒸干，殘渣溶于最小量的DMF。將溶液冷卻至4℃，加入亞硫酰氯(過量)。2小時后，將溶液真空蒸發除去過量亞硫酰氯，并加入三乙胺(10當量)，然后加入4-硝基苯乙胺(0.25當量)。分次加入粉末狀硼氫化鈉以還原剩余的酰氯基團，然后加入0.1MHCl。將溶液用乙酸乙酯萃取，用鹽水洗滌有機溶液，真空蒸發。殘渣用硅膠色譜法得到純品(16)。(c)邊攪拌邊向(16)的甲醇溶液中加入鈀炭催化劑(0.1當量)。將懸浮液置于氫氣氛圍下，使還原反應進行到TLC指示無(16)存在。將反應混合物用氬氣吹掃3次，濾去催化劑，蒸發至干。殘渣用THF∶水(1∶1)溶解，用0.1MNaOH將pH調節至10，分次加入碳酸二叔丁酯，需要時加入0.1MNaOH使pH維持在9-10。加成反應完成后1小時，用乙酸乙酯萃取溶液，將有機層干燥，真空蒸發。殘渣用硅膠色譜法得到(17)。(d)在4℃下，向(17)的氯仿溶液中加入無水碳酸鉀(20當量)，將懸浮液劇烈攪拌，同時滴加過量亞硫酰氯。1小時后，在旋轉蒸發器上除去溶劑和過量的亞硫酰氯，殘渣用乙酸乙酯提取。真空去除溶劑，殘渣溶解在甲苯中。加入1，8-二氮雜二環〔5.4.0〕十一碳-7-烯(1.8當量/氯化物基團)，然后加入硫代苯甲酸(1.4當量/氯化物)將溶液加熱回流。5小時后，將有機提取物蒸發至干，殘渣再溶于氯仿，用水洗1次，用無水硫酸鈉干燥，真空蒸發，得到粗品(18)，再用快速色譜法提純。(e)在室溫下，向(18)的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸(10當量)。2小時后將溶劑蒸干，得到(19)。如上面實施例10所述，直接用于結合反應。實施例13雙官能團螯合劑(21)的制備(20)R′＝NHBoc(21)R′＝NH2(a)向冷卻至4℃的N-BocN′-甲基乙二胺的二氯甲烷溶液中加入三乙胺(10當量)，接著加入氯乙酰氯(1.1當量)。攪拌30分鐘后，加水，分離有機層，干燥，真空濃縮至干。用甲苯溶解殘渣，加入1，8-二氮雜二環〔5.4.0〕十一碳-7-烯(2.2當量)，然后加入硫代苯甲酸(1.1當量)，將溶液加熱回流。5小時后，將有機提取物蒸發至干，殘渣再溶于氯仿，用水洗一次，用無水硫酸鈉干燥，真空蒸發，得到粗品(20)，用快速色譜法進一步提純。(b)在室溫下，向(20)的二氯甲烷溶液加入三氟乙酸(10當量)。2小時后，將溶劑蒸干，得到(21)，如上面實施例10所述，直接用于結合反應。實施例14雙官能團螯合劑(23)的制備(23)R′＝NHBoc(24)R′＝NH2(a)向冷卻至4℃的N-Boc-肼的二氯甲烷溶液中加入三乙胺(10當量)，然后加二甲基丙烯酰氯(1.1當量)。攪拌30分鐘后，加水，分離有機層，干燥，真空濃縮至干。用甲苯溶解殘渣，加入1，8-二氮雜二環〔5.4.0〕十一碳-7-烯(2.2當量)，然后加入硫代苯甲酸(1.1當量)，將溶液加熱回流。5小時后，將有機提取物蒸發至干，殘渣再溶于氯仿，用水洗滌一次，用無水硫酸鈉干燥，真空蒸發至干，得到粗品(22)，用快速色譜法提純。用甲醇鈉甲醇液將硫醇基去保護，將硫醇再保護成2-吡啶硫基實體。(b)在室溫下向(22)的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸(10當量)。2小時后將溶劑蒸發至干，得到(23)，如上面實施例10所述，直接用于結合反應。實施例15DTPA氨基脲衍生物的制備，結合和放射性標記，產生具有酸不穩定性鍵的免疫結合物(a)對-(硫代氨基脲基)芐基-DTPA的制備將對-(異氰酸根合)芐基DTPA(19.7μmol)放在0.5ml水中，與6.6μl55％水合肼的水溶液(6當量)混合，用固體碳酸鈉將溶液的pH調節為9.13。將清徹的反應混合物37℃培養4小時。然后將pH提高到12.8，用高真空泵除去水。殘渣用異丙醇提取兩次以除去殘余的肼，并溶解在0.3ml水中。將pH調節到6.5，得到所需產物的水溶液，濃度為60μmol/ml。(b)對-(硫代氨基脲基)芐基-DTPA與氧化的抗體片斷LL2F(ab′)2碳水化合物部分的偶聯用終濃度14.3mM的偏高碘酸鈉處理LL2F(ab′)2片斷(0.8ml；1.95mg/ml)(在50mM乙酸鹽緩沖的鹽水(pH5.3中)，0℃(冰浴)培養1小時。用乙二醇(2μl)分解過量的高碘酸鹽，在以0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡的離心體積排阻柱上提純氧化的抗體。將氧化抗體的溶液配成150mM，相對于氯化鈉，將pH調節至6.2(用固體磷酸鈉，一價的)，然后用300倍摩爾過量的對-(硫代氨基脲基)芐基-DTPA處理。將反應混合物渦旋，在黑暗中室溫培養18小時。在以0.1M乙酸鹽(pH6.5)平衡的離心體積排阻柱上提純結合物，在Centricon30濃縮器上濃縮。結合物的HPLC分析顯示一個單峰，與未修飾的抗體的峰保留時間相同。(c)每個LL2F(ab′)2的螯合劑數目的測定將40μg上述結合物用過量乙酸鈷標記，以50-200,000cpm鈷57放射性同位素示蹤。30分鐘后，用EDTA將標記混合物配成10mM，分析抗體中鈷的摻入(用浸漬硅膠的玻璃纖維條進行ITLC，用10mMEDTA作色譜展開)。從結合于抗體的放射活性分數，結合物和所用Co/57Co溶液的相對摩爾量，得到每個抗體片斷的螯合劑數目為1.25。(d)用Y-90放射標記結合物將5μl(50μg)對-(硫代縮氨基脲基)芐基-DTPA-F(ab′)2結合物在0.1mM乙酸鈉(pH6.5)中的溶液與4μlY-90乙酸鹽(95.5μCi)混合，培養1小時，作摻入分析。在與10mMEDTA培養10分鐘后，對標記混合物的等分試樣進行即時薄層色譜分析。Y-90摻入量為77.3％，1.2％放射活性存在于膠體狀態。放射性HPLC顯示摻入量為64％。(e)用In-111放射標記結合物將60μg對-(硫代縮氨基脲基)芐基-DTPA-F(ab′)2結合物溶液與124μCi乙酸銦111(以0.22M乙酸銨緩沖的氯化銦111混合，放在室溫下45分鐘。與10mMEDTA培養后分析標記混合物的等分試樣，顯示結合物中摻入In11186％.用0.1M乙酸鹽將樣品稀釋到90μl，與10μl0.1MDTPA溶液(pH7)培養10分鐘。用體積排阻色譜法進行2次相繼的提純，得到In111標記的結合物。上面提到特別好的實施方案，但可以理解，本發明并不受此限制。本領域普通技術人員會想起對所公開的實施方案可作各種改變，這些改變在本發明的范圍內，由下面的權利要求所限定。本說明書中提到的所有出版物和專利申請表示與本發明有關的本領域技術人的技術水平。所有出版物和專利申請均在此引為參考，其程度就好象每個出版物或專利申請都明確地、分別地指出其全文引為參考一樣。權利要求1.突變重組抗體或抗體片斷，在所述抗體或抗體片斷的輕鏈約18位上具有非天然Asn糖基化位點。2.按權利要求1所述的抗體片斷，其中所述抗體片斷選自Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、Fv和單鏈Fv。3.制備糖基化突變重組抗體或抗體片斷的方法，其特征在于包括以下步驟(a)培養表達和糖基化含一突變輕鏈和一重鏈的突變抗體或抗體片斷的轉化宿主細胞，所述宿主細胞以一表達載體進行了轉化，表達載體中克隆進了編碼約在18位氨基酸上含非天然Asn糖基化位點的突變輕鏈的突變DNA分子；(b)從所述培養的宿主細胞回收表達和糖基化的突變抗體或抗體片斷。4.一種可溶性免疫結合物，包含(a)糖基化的抗體片斷，該抗體片斷選自Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、Fv和單鏈Fv，該抗體片斷包括輕鏈可變區和所述輕鏈可變區約18位氨基酸上結合的碳水化合物部分；(b)負載的載體，包含具有至少一個游離氨基的聚合物載體和共價結合于聚合物載體的多種藥物、毒素、螯合劑、硼附加物或可檢測的標記分子，其中所述負截的載體通過所述聚合物載體的所述至少一個游離氨基與所述抗體片斷的所述碳水化合物部分共價結合，其中所述免疫結合物保持所述抗體片斷的免疫反應性。5.按權利要求4所述的可溶性免疫結合物，其中所述抗體片斷是在所述抗體片斷的約18位氨基酸上具有非天然Asn糖基化位點的突變抗體片斷。6.按權利要求4所述的可溶性免疫結合物，其中所述聚合物載體選自氨基葡聚糖、至少50個氨基酸長度的多肽和聚酰胺基胺樹枝狀體。7.按權利要求4所述的可溶性免疫結合物，其中所述可檢測的標記分子選自90Y、186Re和GdIII、抗生物素、抗生物素蛋白鏈菌素和生物素。8.按權利要求4所述的可溶性免疫結合物，其中所述螯合劑選自1，4，7，10-四氮雜環十二烷四乙酸和式(I)所示化合物其中，X為CH，或X和Z連在一起可為CO；Y為CR4R5、CH2CR4R5或(CH2)2CR4R5，其中R4和R5相同或不同，選自氫、烷基、取代烷基、芳基或取代芳基；Z可為能與所述抗體片斷的所述碳水化合物部分反應的任何基團，或Z可為H；R1為在不明顯降低所述蛋白質免疫反應性的條件下可除去的巰基保護基團；R2和R3可以相同或不同，各代表酰基或取代酰基，或氫，烷基，芳基，取代烷基，或取代芳基，其中烷基或芳基上的取代基是選自巰基、胺或羥酸或其保護衍生物的金屬絡合物形成基；R2和R3也可以是能與所述抗體片斷的所述碳水化合物部分反應的任何基團，或式(II)所述化合物其中，D為H或CH2SR1；E可為能與所述抗體片斷的所述碳水化合物部分反應的任何基團，R1為在不明顯降低蛋白質免疫反應性的條件下可除去的巰基保護基團；m為0、1、2或3，或式(III)所示化合物其中，Q可為能與所述抗體片斷的所述碳水化合物部分反應的任何基團；R1為在不明顯降低蛋白質免疫反應性的條件下可除去的巰基保護基；每個n各自為2或3。9.按權利要求4所述的可溶性免疫結合物，其中所述螯合劑經選自氨基硫脲和酰肼組成的化合物的酸不穩定性連結物而共價結合于所述聚合物載體。10.制備免疫結合物的方法，其特征在于將負載的載體共價結合于抗體片斷的碳水化合物部分，其中所述抗體片斷選自Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、Fv和單鏈Fv，其中所述抗體片斷在所述抗體片斷的輕鏈上在約18位氨基酸上含有碳水化合物部分，其中所述負載的載體包括具有至少一個游離氨基的聚合物載體和共價結合于聚合物載體的多重藥物、毒素、螯合劑、硼附加物或可檢測的標記分子，其中所述負載的載體通過所述聚合物載體的所述至少一個游離氨基與所述抗體片斷的所述碳水化合物部分共價結合，其中所述免疫結合物保留所述抗體片斷的免疫反應性。11.一種可溶性免疫結合物，包含(a)糖基化的抗體片斷，該抗體片斷選自Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、Fv和單鏈Fv，該抗體片斷包括輕鏈可變區，所述輕鏈可變區約18位氨基酸上結合有碳水化合物部分；(b)至少一個非抗體部分，該非抗體部分選自藥物、毒素、螯合劑、聚乙二醇、硼附加物和可檢測的標記分子，其中每個所述非抗體部分共價結合于所述抗體部分的所述碳水化合物部分，其中所述免疫結合物保持所述抗體片斷的免疫反應性。12.按權利要求11所述的可溶性免疫結合物，其中所述抗體片斷是在所述抗體片斷的約18位氨基酸上含非天然Asn糖基化位點的突變抗體片斷。13.按權利要求11所述的可溶性免疫結合物，其中所述可檢測的標記分子選自90Y、186Re和GdIII、抗生物素、抗生物素蛋白鏈菌素和生物素。14.按權利要求11所述的可溶性免疫結合物，其中所述螯合劑選自1，4，7，10-四氮雜環十二烷四乙酸和式(I)所示化合物其中，X為CH，或X和Z連在一起可為CO；Y為CR4R5、CH2CR4R5或(CH2)2CR4R5，其中R4和R5相同或不同，選自氫、烷基、取代烷基、芳基或取代芳基；Z可為能與所述抗體片斷的所述碳水化合物部分反應的任何基團，或Z可為H；R1為在不明顯降低所述蛋白質免疫反應性的條件下可除去的巰基保護基團；R2和R3可以相同或不同，各代表酰基或取代酰基，或氫，烷基，芳基，取代烷基，或取代芳基，其中烷基或芳基上的取代基是選自巰基、胺或羥酸或其保護衍生物的金屬絡合物形成基；R2和R3也可以是能與所述抗體片斷的所述碳水化合物部分反應的任何基團，或式(II)所述化合物其中，D為H或CH2SR1；E可為能與所述抗體片斷的所述碳水化合物部分反應的任何基團，R1為在不明顯降低蛋白質免疫反應性的條件下可除去的巰基保護基團；m為0、1、2或3，或式(III)所示化合物其中，Q可為能與所述抗體片斷的所述碳水化合物部分反應的任何基團；R1為在不明顯降低蛋白質免疫反應性的條件下可除去的巰基保護基；每個n各自為2或3。15.按權利要求11所述的可溶性免疫結合物，其中所述螯合劑經選自氨基硫脲和酰肼組成的化合物的酸不穩定性連結物而共價結合于所述聚合物載體。16.制備免疫結合物的方法，其特征在于將非抗體部分共價結合于抗體片斷的碳水化合物部分，其中所述抗體片斷選自Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、Fv和單鏈Fv，其中所述抗體片斷在所述抗體片斷的輕鏈上在約18位氨基酸上含有碳水化合物部分，其中所述非抗體部分選自藥物、毒素、螯合劑、聚乙二醇、硼附加物和可檢測的標記分子，其中所述免疫結合物保留所述抗體片斷的免疫反應性。17.制備免疫結合物的方法，其特征在于將非抗體部分共價結合于抗體片斷的碳水化合物部分，其中所述抗體片斷選自Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、Fv和單鏈Fv，其中所述抗體片斷在所述抗體片斷的輕鏈上在約18位氨基酸上含有碳水化合物部分，其中所述非抗體部分選自藥物、毒素、螯合劑、聚乙二醇、硼附加物和可檢測的標記分子，其中所述免疫結合物保留所述抗體片斷的免疫反應性。18.用于診斷哺乳動物疾病存在的組合物，其特征在于包括免疫結合物和藥學上可接受的載體，其中所述免疫結合物包含可檢測的標記物和抗體片斷，在所述抗體片斷的輕鏈約18位氨基酸上連結有碳水化合物部分，其中所述可檢測標記物結合于所述抗體片斷的所述碳水化合物部分，其中所述抗體片斷與所述疾病的相關抗原特異性結合。19.用于治療哺乳動物疾病的組合物，其特征在于包括免疫結合物和藥學上可接受的載體，其中所述免疫結合物包含在所述抗體片斷輕鏈約18位氨基酸上連結有碳水化合物部分的抗體片斷和選自藥物、毒素、螯合劑、聚乙二醇、硼附加物和治療用放射性同位素的非抗體部分，其中所述非抗體部分共價結合于所述抗體片斷的所述碳水化合物部分，其中所述抗體片斷與所述疾病的相關抗原特異性結合。全文摘要本發明涉及含抗體片斷的結合物該抗體片斷通過輕鏈可變區約18位的碳水化合物部分共價結合于診斷或治療劑。本發明還涉及含在輕鏈可變區約18位上有糖基化部位的完整抗體的免疫結合物，該輕鏈可變區是通過編碼該輕鏈的核苷酸序列的誘變引入抗體的。得到的免疫結合物保留抗體片斷或完整抗體的免疫反應性，將診斷或治療劑導向靶組織。因此，本發明注重這種免疫結合物的診斷和免疫治療應用。本發明還涉及這種免疫結合物的制備方法。文檔編號A61K51/02GK1142775SQ94194907公開日1997年2月12日申請日期1994年12月5日優先權日1993年12月8日發明者H·J·漢森,倫水恩,J·謝文茨,G·L·格里菲思,S·V·戈文丹申請人:免疫醫學股份有限公司