專利名稱：海膽狀結構納米免疫磁珠的制備方法及其應用的制作方法
海膽狀結構納米免疫磁珠的制備方法及其應用技術領域
本發明屬于免疫學、細胞生物學及磁力學等多方面領域，尤其涉及一種核殼結構納米免疫納米磁珠制備技術領域。
背景技術：
眾所周知，樣品前處理是個非常重要的手段，它的成功與否對樣品的檢測至關重要。利用免疫磁性顆粒來篩選和分離在食物、臨床、土壤等環境中的微生物、細胞、化學元素等目標奮力的方法得到越來越多的肯定。由于免疫磁珠的分離篩選方法的快速、高濃縮比、 操作簡單等優點，在實際中應用很廣泛。免疫磁珠基于抗體對抗原的特異性識別.磁性微珠直接或者間接偶聯在抗體上，從而與細胞相連在高強度、梯度磁場中達到細胞磁性分離的目的等許多優點。
海膽狀結構納米免疫磁珠是一種較新型的免疫磁珠類型，具有顯著地優點。在作為免疫磁珠分離目標抗體時由于其為中間空的特殊結構類型。大大減小了微球的密度，使得微球可以在溶液中懸浮，增大了免疫磁珠與目標抗體的接觸面積，便于分離。在結構上另外一個顯著地優點是多孔結構納米免疫磁珠最外層為海膽狀，很大程度上增加了微球的外比表面積，從而更大的增加了免疫磁珠與目標抗體的接觸面積。海膽狀結構納米免疫磁珠體積極小，為微米甚至納米級別的微球。具有最大的生物相溶性和最小的抗原性。發明內容
本發明的目的是針對免疫磁珠功能的進一步改進，提供一種海膽狀結構納米免疫磁珠的制備方法。
本發明技術方案包括如下步驟1)制備二氧化硅納米球以正硅酸乙酯正硅酸乙酯為前驅物，氨水為催化劑，乙醇為溶劑采用StSber法制備單分散的二氧化娃納米球；2)制備SiO2OFe3O4結構體以二氧化硅納米球作為Fe3O4殼層形成的模板，在25 500C的溫度條件下將FeCl2水溶液與二氧化硅納米球分散液混合，然后經離心，固體物質以水與乙醇交替洗滌后，干燥，制備SiO2O Fe3O4結構體；3)制備SiO2OFe3O4OTiO2核殼結構體將SiO2O Fe3O4結構體與氧化鈦反應，形成SiO2O Fe3O4OTiO2核殼結構體，離心分離，取固體物質用無水乙醇和蒸餾水清洗；4)制備空心@Fe3O4OTiO2結構體通過堿水熱處理SiO2O Fe3O4OTiO2核殼結構體，得到海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結構體；5)對海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結構體的表面進行修飾修飾空心OFe3CMOTiO2結構體的表面。
與對免疫磁珠功能的進一步改進，本發明的有益效果為本發明制備方法所需的設備投資少，原料低廉且利用率高、生產費用低、工藝簡單、易于操作、反應條件溫和、所的材料污染小。達到了現代技術對于綠色環保的要求，是一種非常具有前景的制備免疫磁珠3的可行方法。
在所述步驟3)中，先將SiO2O Fe3O4結構體溶解于乙醇中，然后加入氨水，溫度保持在60°C，攪拌后滴加鈦酸丁酯，經水解縮合反應形成SiO2O Fe3O4OTiO2核殼結構體。
在所述步驟4)中，將SiO2O Fe3O4OTiO2核殼結構體分散水中，加入堿溶液后，再將溶液于110°C環境溫度下反應，得到空心@ Fe3O4OTiO2結構體。
所述堿溶液為NaOH 水溶液，或 KOHLiOHCa (OH) 2 NH3 · H2O。
所述堿溶液的濃度為I. O 2. O mol/L·
由于堿濃度對表面氧化鈦的形貌也起著重要的調節作用，本發明通過控制堿的濃度以增強海膽狀結構納米免疫磁珠的最外層纖維化程度，從而增大海膽狀構納米免疫磁珠的外比表面積。
本發明還提出了海膽狀結構納米免疫磁珠在作為免疫磁珠分離目標抗體時的應用。
先將海膽狀結構納米免疫磁珠加入被檢測樣品中，使被檢測樣品中的目標和免疫磁珠上已固定的抗體產生特異性反應；然后通過磁場下吸附免疫磁珠和已經被免疫磁珠捕獲的被檢測樣品中的目標；最后收集免疫磁珠和已經被免疫磁珠捕獲的被檢測樣品中的目標，用于生物檢測或鋪盤。
本發明海膽狀結構納米免疫磁珠具有良好的磁性。在分離步驟中免疫磁分離效率聞，15分鐘分尚率可達到99 100%。
海膽狀空心Fe3O4OTiO2結構磁分離優點1、分離速度快、效率高、可重復性好；2、操作簡單、不需要復雜手段或昂貴的設備；3、不影響被分離細胞或其他生物的生物學性狀和性能。
圖I為本發明中采用溶膠-凝膠法與模板法等相結合的方法制備多孔海膽狀結構納米免疫磁珠的制備示意圖。
圖2為SiO2球模板的SEM圖片。
圖3 為為 SiO2OFe3O4 的 SEM 圖片。
圖4 為 SiO2O Fe3O4 OTiO2 的 SEM 圖片。
圖5為海膽狀空心Fe3O4OTiO2的SEM圖片。
具體實施方式
一、如圖I所示，制備海膽狀結構納米免疫磁珠I、利用改進的StSber法制備單分散氧化娃納米球采用St0ber法，以10 ml TEOS (正硅酸乙酯正硅酸乙酯)為前驅物，30 ml氨水為催化劑，200 ml乙醇為溶劑，制備單分散的二氧化硅納米球，干燥后待用。
取得的二氧化硅納米球的SEM圖片如圖2所示。
2、制備 SiO2O Fe3O4 結構體配制O. 6g/100ml的FeCl2水溶液，待用。
以二氧化硅納米球作為Fe3O4殼層形成的模板，在25 50°C的溫度條件下，將 FeCl2水溶液加入到二氧化硅納米球分散液中，FeCl2水溶液和二氧化硅納米球的混合質量比為I : 1，經2小時后，將混合物離心，取固體物質以水與乙醇交替洗滌，再經50°C干燥， 即取得SiO2O Fe3O4結構體，待用。
取得的SiO2OFe3O4的SEM圖片如圖3所示。
3、制備 SiO2O Fe3O4OTiO2 核殼結構體取O. 5 g SiO2O Fe3O4結構體，超聲溶解在200ml乙醇中，加1.2ml氨水。溫度保持在 600C，攪拌lOmin，逐滴加入2ml鈦酸丁酯，發生水解縮合反應，反應時間為2小時即可，生成的二氧化鈦包覆在SiO2O Fe3O4表面，獲得SiO2O Fe3O4OTiO2核殼結構體，離心分離，取固體物質，用無水乙醇和蒸餾水清洗，待用。
取得的S_ Fe3O4 OTiO2的SEM圖片如圖4所示。
4、制備空心O Fe3O4OTiO2結構體將O. Ig制備得到的SiO2O Fe3O4OTiO2，超聲分散在15ml水中，再加入濃度為I 2mol/ L的NaOH水溶液，或者KOHLiOHCa(OH)2 NH3 · H2O溶液15ml，然后，將溶液轉移至50ml反應釜中，110°C反應2個小時，得到空心@ Fe3O4OTiO2結構體。
取得海膽狀的空心Fe3O4OTiO2的SEM圖片如圖5所示。
5、對海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結構體的表面進行抗體修飾。
取O. Ig海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結構體，對具有磁性的海膽狀的空心Fe3O4OTiO2 結構體依次進行氨基化修飾、醛基化修飾。
海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結構體的氨基化修飾將O. 4mL氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)滴加到海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結構體的乙醇懸浮液中，并在室溫下攪拌7h。然后，利用外加磁場，將APTES修飾的磁性顆粒從反應介質中分離出，并用乙醇溶液對其清洗 5次，取得氨基化復合顆粒。
在修飾完APTES之后，對海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結構體的醛基化修飾將氨基化復合顆粒加入到50 mL質量分數為3%的戊二醛的磷酸緩沖溶液(PBS)中，并在37°C下攪拌 3h后，用PBS溶液對其清洗3次，取得磁珠。
醛基化磁珠與多克隆抗體偶聯取400μ L磁珠，加5ml多克隆抗體(用 Na2CO3-NaHCO3 I 500稀釋)，37°C振蕩(確保顆粒不沉淀)反應2h。用Na2CO3-NaHCO3清洗3 次。
利用生物素共軛修飾的辦法可以把抗體穩定地修飾到抗生蛋白鏈菌素上。為了避免交叉反應，試驗過程中利用親和純化的多克隆抗體。改變不同的保護基團，如牛血漿蛋白可以降低蛋白質或其他生物分子的非特異性吸附。另外，實驗過程中通過SPR，QCM, SEM, AFM等方法對抗體固定進行跟蹤表征以確保抗體的良好連接。
二、海膽狀結構納米免疫磁珠在作為分離目標抗體示例將待檢測樣品和海膽狀核殼結構納米免疫磁珠加入到樣品管中。樣品管在勻速旋轉、 變速旋轉、靜止富集或正反向旋轉狀態的不同組合下，樣品管中的被檢測樣品中的目標和免疫磁珠上已固定的抗體產生特異性反應；在固定磁場下，把免疫磁珠和已經被免疫磁捕獲的被檢測樣品中的目標吸附在樣品管內壁；收集免疫磁珠和已經被免疫磁捕獲的被檢測樣品中的目標，用于生物檢測或鋪盤。
海膽狀空心Fe3O4OTiO2結構磁分離優點1、分離速度快、效率高、可重復性好；2、操作簡單、不需要復雜手段或昂貴的設備；3、不影響被分離細胞或其他生物的生物學性狀和性能。
權利要求
1.一種海膽狀結構納米免疫磁珠的制備方法，其特征在于包括如下步驟 1)制備二氧化硅納米球以正硅酸乙酯正硅酸乙酯為前驅物，氨水為催化劑，乙醇為溶齊U，采用StSber法制備單分散的二氧化娃納米球； 2)制備Si02@Fe304結構體以二氧化硅納米球作為Fe304殼層形成的模板，在25 50°C的溫度條件下將FeC12水溶液與二氧化硅納米球分散液混合，然后經離心，固體物質以水與乙醇交替洗滌后，干燥； 3)制備Si02@Fe304iTi02核殼結構體將Si02@ Fe304結構體與氧化鈦反應，形成Si02i Fe304iTi02核殼結構體，離心分離，取固體物質用無水乙醇和蒸餾水清洗； 4)制備空心@Fe304@Ti02結構體通過堿水熱處理Si02@ Fe304@Ti02核殼結構體，得到海膽狀的空心Fe304@Ti02結構體； 5)對海膽狀的空心Fe304@Ti02的表面進行修飾修飾空心OFe304iTi02結構體的表面。
2.根據權利要求I所述海膽狀結構納米免疫磁珠的制備方法，其特征在于在所述步驟3)中，先將Si02@ Fe304結構體溶解于乙醇中，然后加入氨水，溫度保持在60°C，攪拌后滴加鈦酸丁酯，經水解縮合反應形成Si02@ Fe304iTi02核殼結構體。
3.根據權利要求I所述海膽狀結構納米免疫磁珠的制備方法，其特征在于在所述步驟4)中，將Si02@ Fe304@Ti02核殼結構體分散水中，加入堿溶液后，再將溶液于110°C環境溫度下反應，得到空心@ Fe304iTi02結構體。
4.根據權利要求I或3所述海膽狀結構納米免疫磁珠的制備方法，其特征在于在所述步驟4)中所述堿溶液為NaOH水溶液，或KOHLiOHCa (OH) 2 ΝΗ3·Η20。
5.根據權利要求I或3所述海膽狀結構納米免疫磁珠的制備方法，其特征在于在所述步驟4)中，堿溶液的濃度為I. O 2. O mol/1。
6.如權利要求I所述海膽狀結構納米免疫磁珠在作為免疫磁珠分離目標抗體時的應用，其特征在于先將海膽狀結構納米免疫磁珠加入被檢測樣品中，使被檢測樣品中的目標和免疫磁珠上已固定的抗體產生特異性反應；然后通過磁場下吸附免疫磁珠和已經被免疫磁珠捕獲的被檢測樣品中的目標；最后收集免疫磁珠和已經被免疫磁珠捕獲的被檢測樣品中的目標，用于生物檢測或鋪盤。
全文摘要
海膽狀結構納米免疫磁珠的制備方法及其應用，屬于免疫學、細胞生物學及磁力學等多方面領域，本發明通過順序制備二氧化硅納米球、SiO2@Fe3O4結構體、SiO2@Fe3O4@TiO2核殼結構體、空心@Fe3O4@TiO2結構體，最后對海膽狀的空心Fe3O4@TiO2結構體的表面進行修飾。本發明制備方法所需的設備投資少，原料低廉且利用率高、生產費用低、工藝簡單、易于操作、反應條件溫和、所的材料污染小。達到了現代技術對于綠色環保的要求，是一種非常具有前景的制備免疫磁珠的可行方法。
文檔編號B82Y40/00GK102921357SQ201210432468
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月2日 優先權日2012年11月2日
發明者董文鈞, 沈金明, 沈旸 申請人:江蘇康寶電器有限公司