細胞外基質產生促進劑的制作方法

專利名稱：細胞外基質產生促進劑的制作方法
技術領域：
本發明系有關皮膚外用劑等藥劑的技術領域。更具體言之，本發明系有關促進由透明質酸等酸性粘多糖及膠原蛋白等纖維性蛋白質等所成的形成真皮的細胞外基質產生的皮膚外用劑等藥劑的發明。
背景技術：
真皮為于表皮之下，由結締組織所成組織。真皮，不像表皮細胞那么緊密塞滿，而是有許多細胞外空間，其部分由所謂“細胞外基質”的巨大分子的網絡結構所充滿。
上述細胞外基質是由真皮內的纖維母細胞等產生的，由透明質酸、硫酸軟骨素等稱為酸性粘多糖的多糖和膠原蛋白、彈性蛋白等纖維性蛋白質構成。
細胞外基質與皮膚的彈性、張力、嬌嫩度、新陳代謝等直接有關，于纖維母細胞等細胞外基質的產生遲鈍則皮膚失去彈性及嬌嫩、變得易發生皺紋、小皺紋、皮膚變粗糙、造成皮膚老化的一個原因。
因此，現在，通過促進此細胞外基質的產生，嘗試著找出保持具張力的嬌嫩皮膚、提供年輕的肌膚的方法。
本發明欲解決的課題，如上述地，發現促進細胞外基質產生的成分在保持年輕的皮膚之中有極重要作用，通過以此成分為有效成分，提供可防止象征皮膚老化的皺紋、小皺紋、皮膚粗糙等，而且于安全性上無問題的皮膚外用劑等藥劑。
發明的公開本發明者針對此課題的解決進行刻意檢討的結果，發現柴胡等屬于柴胡屬的植物的提取物及含于其中的柴胡皂甙等成分通過作用于皮膚內的表皮細胞及纖維母細胞，具有促進細胞外基質的產生，使細胞外基質活化，使皮膚組織正常化的作用而完成了本發明。
亦即，本發明，提供以自屬于柴胡屬植物的提取物為有效成分的細胞外基質的產生促進劑(以下，亦稱為本發明產生促進劑)，尤其是以屬于柴胡屬的植物為柴胡的本發明產生促進劑。
附圖的簡單說明第1圖為表示于人類表皮細胞的透明質酸產生試驗的結果的圖；第2圖為表示于來自人類皮膚的纖維母細胞的透明質酸產生試驗的結果的圖；第3A圖～第3C圖為表示于人類表皮細胞的VII型膠原蛋白產生試驗的結果的生物形態的照片；第4A圖～第4C圖為表示于來自人類皮膚的纖維母細胞的VII型膠原蛋白產生試驗的結果的生物形態的照片。
供實施發明的最佳形態以下，就本發明的實施形態加以說明。
本發明產生促進劑，可將自屬于柴胡屬的植物的提取物作為其有效成分使用。
提供可作為本發明產生促進劑的有效成分的提取物的屬于柴胡屬的植物的植物體，只要含有柴胡皂甙或柴胡皂甙原，并無特別限定。例如可舉得屬于柴胡屬(Bupleurum)的植物如柴胡(日本藥局方第13改正記載名稱Bupleurum falcatum Linne)，別名以滿州柴胡稱呼的北柴胡(Bupleurum chinese DC.)、別名以奧柴胡稱呼的狹葉柴胡(Bupleurumscorzonerifolium Willd.)、膜緣柴胡(Bupleurum marginatum Wall.exDC.)、長白柴胡(Bupleurum komarovianum Lincz.)、重葉柴胡(Bupleurumlongiradiatum Turcz.)、興安柴胡(Bupleurum sibiricum Vest)、空心柴胡(Bupleurum longicaule Wall.ex DC.)、小柴胡(Bupleurum tenueBuch.-Ham ex D.Don)、別名稱為穿葉柴胡的金黃柴胡(Bupleurum aureumFisch.)或多脈柴胡(Bupleurum mulutinerve DC.)等作為本發明產生促進劑的有效成分，作為提取物的原材料。
于上記植物體可選擇的部位亦只要是含有柴胡皂甙或柴胡皂甙原的部位，并無特別限定。例如，上記柴胡的情形，選擇已知含有柴胡皂甙及柴胡皂甙原的根部為優選。
又，作為此等植物體，當然可選擇天然的植物體，人工培養的植物體，例如為提高柴胡皂甙乃至柴胡皂甙原的生成效率培養上記植物體的特定部位衍生的愈傷組織及再將此愈傷組織分化，進行特定部位的器官培養的植物體亦可使用。
另外，基因工程的手法，例如以使大量生成柴胡皂甙或柴胡皂甙原為目的，作出的基因導入株或細胞融合株亦可使用。
又，對于作為生成柴胡皂甙及/或柴胡皂甙原的植物，優選選擇的柴胡，供植物培養的原生質體優選于含煙酸、鹽酸吡哆醇、D-泛酸鈣、對氨基苯甲酸、氯化膽堿、抗壞血酸、維生素A、維生素D3、維生素B12、丙酮酸鈉、檸檬酸、蘋果酸鈉、富馬酸或酪蛋白氨基酸中至少一種的維生素或有機酸的培養基中培養。(參照特開平2-245180號公報)。
又，對柴胡的根進行器官培養時，進行立即使繼續此器官培養實質上已經至側根的數目不增加的狀態為止，將此器官培養培養基的糖類成分(蔗糖、葡糖或果糖等)的濃度限制于對于全部培養基不足2.0重量％加以培養，于此器官培養得以提高柴胡皂甙的生產效率的點而言為優選(參照特開平5-23069號公報)。另外，于培養基中添加香豆素、間羥基苯甲酸、鄰羥基苯乙酸、對羥基苯乙酸、鄰香豆酸、綠原酸、均苯三酚或傘形酮等酚衍生物亦于此器官培養上得以提高柴胡皂甙的生產效率的方面為佳(參照特開平5-18379號公報)。
而且，于對于柴胡等屬于柴胡屬的植物，導入例如得以提高柴胡皂甙的生成的柴胡皂甙合成基因等時，優選將含有關的遺傳密碼的DNA與基因導入對象的屬于柴胡屬的植物的原生質體共存，賦予電脈沖或添加細胞融合劑于有效率地得以實現基因導入(參照特開平6-90771號公報)。
如此所提供的屬于柴胡屬的植物的植物體提取物的制備，可通過為得此提取物的習知方法，例如溶劑提取等而進行。又，于此所謂提取物，顯然可以來自植物體的破碎物的情形，當然亦包含來自進行器官培養等植物組織培養的培養基的情形。
作為有關的溶劑萃取所用的溶劑，可舉例如純化水等水；甲醇、乙醇等1元低級醇類；油醇、硬脂醇、辛基十二烷醇等1元高級醇類；乙二醇、丙二醇、甘油、1，3-丁二醇等多元醇類；丙酮等酮類；乙酸乙酯等酯類；己烷、氯仿、苯等烴系溶劑等，將此等單獨或混合2種以上使用。于此等中，自可廣泛地適用于生體的觀點，以水、乙醇、甘油、1，3-丁二醇的單品或2種以上的混合物為適當。
如此，可得所希望的屬于柴胡屬的植物的植物體的提取物(以下亦稱為提取物)。
于本發明產生促進劑的此提取物的配合量，可按照其具體的提取材料及本發明產生促進劑的劑型、尤其是按照意欲促進產生的細胞外基質的成分而適宜地選擇，并無特別限定。
例如，將柴胡的根的提取物作為本發明產生促進劑的有效成分的情形，對于劑全體以提取物的固形分換算，大致優選于0.00001～10.0重量％的廣范圍加以適宜選擇。
又，本發明產生促進劑中，可將已知含于上記提取物中的柴胡皂甙及/或柴胡皂甙原為有效成分配合。
柴胡皂甙已知為將上記的柴胡的根干燥而得的，自古以來為作為解熱、解毒、鎮痛、強壯、抗炎癥的主要藥物使用的重要的漢方原料的一的“柴胡”的主要藥理成分。
此柴胡皂甙為齊墩果烷型三萜系皂甙，迄今，已分離鑒定出a，c，d，b1，b2等13種的結構。
本發明產生促進劑中，可配合以此等習知的方法分離的柴胡皂甙。
又，本發明產生進劑中，亦可配合實施過大量取得的手段的柴胡皂甙(柴胡皂甙，于上記的柴胡的天然根中只含有0.5～1.5重量％程度)。
作為此大量取得的手段的一例，可舉將含柴胡皂甙之上記提取物使吸附于吸附劑之后，對于此采取種種手段，得以大量取得所希望的種類的柴胡皂甙。
更具體言的，將上記提取物與吸附劑接觸，使柴胡皂甙吸附于吸附劑，將柴胡皂甙以外之上記提取物中的成分自此吸附劑除去后(吸附過程)，使吸附于此吸附劑的柴胡皂甙洗脫，可得純化的天然型柴胡皂甙(由只于13位有雙鍵者所代表的如此存在于天然物中的柴胡皂甙柴胡皂甙a，柴胡皂甙c及柴胡皂甙d)。
又，此上記提取物吸附于吸附劑的吸附過程終了后，將鐵(III)離子與柴胡皂甙接觸[例如，可將氯化鐵(FeCl3)等鐵(III)鹽溶等鐵(III)離子溶液直接與天然型柴胡皂甙接觸。]、可得具二烯構造的柴胡皂甙(例如，于13位及14a位有雙鍵型的柴胡皂甙的柴胡皂甙b1、柴胡皂甙h及柴胡皂甙b2等)。
其中，柴胡皂甙b1為將天然型的柴胡皂甙a轉換所得的具二烯構造的柴胡皂甙，同樣地對于柴胡皂甙c對應的為柴胡皂甙h，對于柴胡皂甙d，對應地為柴胡皂甙b2。
作為于此等過程所用的吸附劑，可舉例如活性炭、苯乙烯-二乙烯基苯系的合成吸附劑、丙烯酸系的合成吸附劑等。又，亦可舉硅膠與疏水基組合的素材的合成吸附劑，聚酰胺膠、經修飾的葡聚糖膠等。
使用適當的洗脫劑將吸附于此等吸附劑的所需皂甙的種類的柴胡皂甙洗脫，將此按須要需使用高效液相色譜法等純化，可取得所要的柴胡皂甙。
除上述例子中的柴胡皂甙的外的其它柴胡皂甙，如柴胡皂甙e，柴胡皂甙f，柴胡皂甙g等也可按照習知的制備方法進行制備。
本發明產生促進劑亦可配合此等柴胡皂甙a、柴胡皂甙b1、柴胡皂甙b2、柴胡皂甙c、柴胡皂甙d、柴胡皂甙e、柴胡皂甙f、柴胡皂甙g或柴胡皂甙h的任何柴胡皂甙。
而此等柴胡皂甙中，柴胡皂甙a、柴胡皂甙b1、柴胡皂甙b2、柴胡皂甙c或柴胡皂甙d，尤其有強的透明質酸產生促進作用，優選作為本發明產生促進劑的有效成分。
上記柴胡皂甙于本發明產生促進劑的配合量，可按照選擇的柴胡皂甙的種類及本發明產生促進劑的具體劑型、更外，尤其是意欲促進產生的細胞外基質的成分加以適宜選擇，并無特別限定，大體上，相對于制劑全體，優選為0.000001～10.0重量％的廣大范圍。
本發明產生促進劑中，亦可配合為上記柴胡皂甙的甙原成分的柴胡皂甙原。
柴胡皂甙原為上記的柴胡皂甙成分的甙原成分，亦即柴胡皂甙的非糖質部分。
具體言的，為柴胡皂甙b1的甙原部分的柴胡皂甙原A，為柴胡皂甙h的甙原部分的柴胡皂甙原C，為柴胡皂甙h的甙原部分的柴胡皂甙原D，為柴胡皂甙c的甙原部分的柴胡皂甙原E，為柴胡皂甙a的甙原部分的柴胡皂甙原F，為柴胡皂甙d的甙原部分的柴胡皂甙原G等，亦可配合于本發明產生促進劑之中。
此等柴胡皂甙原，通過上記柴胡皂甙水解即可獲得。
具體言的，藉于鹽酸及硫酸等酸性條件下的脫糖反應，可得上記的柴胡皂甙原。
于本發明產生促進劑中之上記的柴胡皂甙原的配合量，可按照選擇的柴胡皂甙原的種類及本發明產生促進劑的具體劑型，以及，尤其是意欲促進產生的細胞外基質成分加以適宜選擇，并無特別限定，大致對于制劑的全體，優選為0.000001～10.0重量％的廣范圍。
為如此所制造之上述有效成分的屬于柴胡屬植物的提取物、柴胡皂甙或柴胡皂甙原，藉將其1種或2種以上組合，配合于劑中，而提供促進細胞外基質的產生，以及基于此細胞外基質的產生促進，亦可通過使皮膚組織正常化，可發揮抑制皺紋、小皺紋、防止皮膚變得不嬌嫩、皮膚老化的優良效果的本發明產生促進劑。
通過本發明產生促進劑的作用，促進產生的細胞外基質，如上述主要由纖維母細胞產生，具體言的，以透明質酸、硫酸軟骨素等酸性粘多糖及膠原蛋白、彈性蛋白、纖維蛋白原、層粘連蛋白(ラミリン)的纖維性蛋白質構成。
酸性粘多糖將大量水保持于其分子內，呈膠狀，此膠內的水擔任將營養成分、代謝產物、激素等自血管浸透至組織中的細胞的工作。因而，促進酸性粘多糖于細胞外基質的產生，則不只使肌膚變得嬌嫩，而且可促進皮膚的新陳代謝，防止皮膚老化。
又，纖維性蛋白質，保持組織的形態、擔任賦予皮膚彈性等機能。因而，促進細胞外基質的纖維性蛋白質的產生，則帶給皮膚彈力，抑制皺紋及小皺紋。
本發明產生促進劑，可促進此兩類細胞外基質構成成分的產生。
以此意義，本發明產生促進劑為有作為“酸性粘多糖產生促進劑”的側面及作為“纖維性蛋白質產生促進劑”的側面的兩側面的細胞外基質產生促進劑。
尤其，本發明產生促進劑，于酸性粘多糖之中，強力促進透明質酸的產生，于纖維性蛋白質之中，強力促進膠原蛋白的產生。
以此意義，有關上記的本發明的酸性粘多糖產生促進劑，特別地，1.具有作為“透明質酸產生促進劑”的側面，有關本發明的纖維性蛋白質產生促進劑，特別地，2.具有作為“膠原蛋白產生促進劑”的側面。
1.對于透明質酸等酸性粘多糖產生促進劑透明質酸具有基于保持細胞間隙的水分、形成組織內膠凍狀的基質而保持細胞，保持組織的潤滑性與柔軟性、抵抗機械性障礙等外力及防止細菌感染等許多機能(《生物產業》BIO INDUSTRY，第8卷，346頁，1991年)。例如，皮膚的透明質酸量，隨著年齡的增長而減少，伴隨著出現所謂小皺紋及老年斑等皮膚老化。作為如此的老化皮膚的改善劑，提議出許多配合膠原蛋白及透明質酸的化妝品，但這些只發揮皮膚表面的保溫效果，并非得以本質上改善老化肌膚。
本發明產生促進劑，通過促進為酸性粘多糖的透明質酸的纖維母細胞及表皮細胞等產生，將皮膚從內部活化，可解決此從來的技術所遭遇的問題。
將本發明產生促進劑，尤其是促進透明質酸等酸性粘多糖的產生作為目的使用，而且于以前述的提取物為有效成分的情形，提取物于本發明產生促進劑的配合量，可依其提取材料及本發明產生促進劑的劑型加以適宜選擇，并無特別限定。
例如，將柴胡的根的提取物作為有效成分使用的情形，對于全體的劑，以提取物的固形部分換算，優選為0.00001～10.0重量％，特優選為0.00005～5.0重量％。
又，將本發明產生促進劑，尤其是促進透明質酸等酸性粘多糖的產生作用為目的使用，而且，于以前述的柴胡皂甙為有效成分的情形，柴胡皂甙于本發明產生促進劑中的配合量，可按照所選的柴胡皂甙的種類及本發明產生促進劑的具體劑型等加以適宜選擇，并非得無異議地確定，對于全體的劑大致于0.000001～10.0重量％為優選，更優選地，于0.00001～1.0重量％的范圍。
又，將本發明產生促進劑，尤其是促進透明質酸等酸性粘多糖的產生為目的使用，而且，于以前述的柴胡皂甙原為有效成分的情形，柴胡皂甙原于本發明產生促進劑的配合量，可依所選的柴胡皂甙原的種類及本發明產生促進劑的具體劑型等加以選擇，并非一定無商議余地，對于全體的劑大致為0.000001～10.0重量％為優選，特優選地為0.00001～1.0重量％的范圍。
又，上記的柴胡皂甙具皮膚賦活效果，從以前即已知(參照特公平4-36137號公報)，其皮膚賦活效果，只限于人類皮膚纖維母細胞的增殖促進效果及自此效果所衍生的大鼠創傷治療促進效果及于人類實際使用試驗的肌膚變粗的改善效果，對于纖維母細胞增殖促進作用以外的具體性作用機制完全不知道。
當然，柴胡皂甙的促進透明質酸等酸性粘多糖的產生的作用，對于細胞外基質的產生促進作用當然完全不知道。
2.對于膠原蛋白等纖維性蛋白質產生促進劑皮膚大體上具有角質層、表皮、基底膜及真皮的結構。而，由電子顯微鏡觀察的于基底膜與真皮的間的纖維性構造體為錨定纖維。一組錨定纖維的一端進入基底膜的致密層(ラミナデンサ)，另一端進入由含IV型膠原蛋白及層粘連蛋白等物質所成的“錨定斑(アンカリンゲプラ-ク”。又，別組的錨定纖維更深地伸入真皮內，與其他的錨定斑凝集，得以形成巨大的網狀構造。如此的網狀構造被認為于表皮與真皮間的結合中擔任重要的任務(Keene，《細胞生物學雜志》J.Cell Biol.，104611-621，1987)。
錨定纖維的主要構成成分已知為VII型膠原蛋白。據認為此VII型膠原蛋白分子由分子量約300KDa的α1鏈的3條鏈所成，分子間藉二硫鍵形成二聚體，此再締合形成纖維。因而明白，此VII型膠原蛋白于表皮與真空間的結合占有非常重要的位置。于培養系，表皮細胞與纖維細胞皆為微量時仍會形成VII型膠原蛋白。然而，對于生體內的VII型膠原蛋白的代謝如何受控制亦有許多不明白的點。
作為解明錨定纖維于皮膚的任務的線索，可舉已明白VII型膠原蛋白的變異為其原因的一的“先天性表皮水皰癥”。于此疾患，由于VII型膠原蛋白基因上的變異，不能形成錨定纖維，表皮層與真皮層變成無法結合，其結果，維持本來的皮膚構造變為困難(Christiano，《自然遺傳學》Nature Genet.462-66，1993)。
于正常的皮膚，有伴隨生理上老化及光老化，錨定纖維的數目減少的報告(辻卓夫，日皮會志，105963-975，1995，Tidman和Eady，《皮膚病學研究雜志》J.Invest.Dermatol.，83448-453，1984)。于活體外培養系，亦報告來自排水高的皮膚的纖維母細胞的情形為錨定纖維的主成分的VII型膠原蛋白的產生蛋白質含量及mRNA含量皆下降(Chen.《皮膚病學研究雜志》J.Invest.Dermatol.，102205-209，1994)。
借涂布維生素A酸可改善皺紋等象征老化的現象為所熟知，亦有報告將維生素A酸連續涂布于為紫外線所傷的皮膚，錨定纖維的數目顯著地增加。此暗示錨定纖維數的恢復與皺紋的改善有關(Woodley，JAMA，2633057-3059，1990)。
如此，通過明白錨定纖維與皮膚老化等相關性，于保持年輕肌膚的目的，再認識保持此錨定纖維數及質的重要性。
本發明產生促進劑，可通過促進為纖維性蛋白質的膠原蛋白于纖維母細胞及表皮細胞等產生，使提高錨定纖維的數與質，使細胞外基質活化及皮膚組織正常化，進一步充實表皮與真皮的間的結合，防止皺紋及小皺紋，恢復幼齡時的皮膚構造，又可防止皮膚的老化。
將本發明產生促進劑，特別是促進膠原蛋白等纖維性蛋白質的產生非為目的使用，且于以前述提取物為有效成分的情形，提取物于本發明產生促進劑中的配合量，依其提取材料及本發明產生促進劑的劑型，可適宜選擇，并無特別限定。
例如，以柴胡的根的提取物作為有效成分使用的情形，對于全體的劑，以提取物的固形部分換算，優選為0.00001～10.0重量％，特優選為0.00005～5.0重量％。
又，將本發明產生促進劑，特別是促進膠原蛋白等纖維性蛋白質的產生為目的使用，且以前述的柴胡皂甙為有效成分的情形，柴胡皂甙于本發明產生促進劑的配合量，可依所選的柴胡皂甙的種類及本發明產生促進劑的具體劑型，加以適宜選擇，并非得無異議地確定，對于全體的劑大致以0.000001～10.0重量％為優選，特優選地為0.00001～1.0重量％的范圍。
又，將本發明產生促進劑，尤其是促進膠原蛋白等纖維性蛋白質的產生為目的使用，且于以前述的柴胡皂甙原為有效成分的情形，柴胡皂甙原于本發明產生促進劑中的配合量，可依所選的柴胡皂甙原的種類及本發明產生促進劑的具體劑型等，加以適宜選擇，并非得無異議地確定，對于全體的劑大致以0.000001～10.0重量％為優選，特優選地為0.00001～1.0重量％的范圍。
又，如前述，柴胡皂甙具皮膚賦活效果，從以前即為已知(參照特公平4-36137號公報)，其皮膚賦活效果，只限于人類皮膚纖維母細胞的增殖促進效果及自此效果所衍生的大鼠創傷治愈促進效果及人類實際使用時的改善肌膚變粗的效果，對于纖維母細胞增殖促進作用以外的具體的作用機制完全不知道。
當然，對于柴胡皂甙于促進膠原蛋白質等纖維性蛋白質產生的作用完全不知道。
本發明產生促進劑得采用例如水溶液、油液、其他溶液、乳液、霜、凝膠、懸浮液、微膠囊、粉末、顆粒、膠囊、固形劑等形式。以從來已習知的方法制備成此等形式后，作為洗劑(化妝水)、乳液劑、霜劑、軟膏劑、硬膏劑、泥罨劑、氣溶膠劑、水-油2層系、水、油-粉末3層系、注射劑、內服劑(片劑、散劑、顆粒劑、丸劑、糖漿劑、糖錠劑等)、栓劑等，可涂布、貼附、噴霧、注射、飲用、插入于身體。此等劑型中，洗劑、乳液劑、霜劑、軟膏劑、硬膏劑、泥罨劑、氣溶膠劑等皮膚外用劑，為適宜本發明的目的的劑型。又，于此所記的皮外用劑包括醫藥品、醫藥外用品(軟膏劑等)、化妝品[洗面料、乳液、面霜、凝膠、香精(美容液)、面膜等基礎化妝品；粉底、口紅等上妝用化妝品；口腔化妝品、芳香化妝品、毛發化妝品、身體化妝品等)，以下以同樣的意義使用。
于得采用此等形式及劑型的本發明產生促進劑，按照所希望的劑型，可以適當添加通常習知的賦形劑及香料等為代表的油脂類、高級脂肪酸、高級醇、合成酯油、表面活性劑、防腐劑、金屬離子阻斷劑、水溶性高分子、增粘劑、顏料等粉末成分、紫外線防止劑、保濕劑、抗氧化劑、pH調整劑、洗凈劑、干燥劑、乳化劑。另外，將其他的藥效成分等成分配合于本發明產生促進劑，只要其配合不會損害所期望的效果的范圍內即可。
作為油脂類，可舉鱷梨油、山茶油、月見草油、甲魚油、麥克第米亞核油(マカデミアナッツ油)、玉米油、貂油、橄欖油、菜籽油、卵黃油、麻油、杏仁油(パ-ミック油)、小麥胚芽油、山茶花油、蓖麻油、亞麻仁油、葵花籽油、棉籽油、蘇子油、大豆油、花生油、茶籽油、榧子油、米糠油、中國桐油(シナギリ油)、日本桐油、西蒙得木油、胚芽油、三甘油、三辛酸甘油酯、三異棕櫚酸甘油酯等液體油脂；可可脂、椰子油、馬脂、硬化椰子油、棕櫚油、牛脂、羊脂、硬化牛脂、棕櫚核油、豚脂、牛骨脂、日本蠟核油、硬化油、牛腳油、日本蠟、硬化蓖麻油等固體油脂；蜂臘、小燭樹蠟、棉蠟、巴西棕櫚蠟、月桂子蠟、水蠟樹蠟、鯨蠟、褐煤蠟、糠蠟、羊毛脂、木棉花蠟、乙酸羊毛脂、液狀羊毛脂、甘蔗蠟、羊毛脂脂肪酸異丙酯、十二酸己酯、還原羊毛脂、西蒙得木蠟、硬質羊毛脂、蟲膠蠟、聚氧乙烯(以下略為POE)羊毛脂醇醚、POE羊毛脂醇乙酸酯、POE膽固醇醚、羊毛脂脂肪酸聚乙二醇酯、POE氫化羊毛脂醇醚等等蠟類；液體石蠟、天然地蠟、角鯊烯、鯊肝油烷、石蠟、純地蠟、凡士林、微晶性蠟等油分。
作為高級脂肪酸可舉月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、山萮酸、油酸、12-羥基硬脂酸、十一烯酸、妥魯酸(ト一ル酸)、異硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、廿碳五烯酸(EPA)、廿二碳六烯酸(DHA)等。
作為高級醇，可舉例如月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇、山愈醇、肉豆蔻醇、油醇、鯨脂蠟醇等直鏈醇；一硬脂基甘油醚(鯊肝醇)、2-癸基十四醇、羊毛脂醇、膽固醇、植物固醇、己基十二醇、異硬脂醇、辛基十二醇等支鏈醇等。
作為合成酯油可舉例如肉豆蔻酸異丙酯、辛酸鯨蠟酯、肉豆蔻酸辛基十二酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸己酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、油酸癸酯、二甲基辛酸己基癸酯、乳酸鯨蠟酯、乳酸肉豆蔻酯、乙酸羊毛脂酯、硬脂酸異鯨蠟酯、異硬脂酸異鯨蠟酯、12-羥基硬脂酸膽固醇酯、二-2-乙基己酸乙二醇酯、二季戊四醇脂肪酸酯、一異硬脂酸N-烷基二醇酯、二癸酸新戊二醇酯、蘋果酸二異硬脂酸酯、二-2-庚基十一酸甘油酯、三-2-乙基己酸三羥甲基丙烷、三異硬脂酸三羥甲基丙烷、四-2-乙基己酸季戊四醇酯、三-2-乙基己酸甘油酯，三異硬脂酸三羥甲基丙烷、鯨蠟基-2-乙基己酸酯、2-乙基己基棕櫚酸酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三-2-庚基十一酸甘油酯、蓖麻油脂肪酸甲酯、油酸油酯、乙酸鯨蠟醇酯(セトステァリルアルコ-ル)、乙醇甘油酯、棕櫚酸2-庚基十一酯、己二酸二異丁酯、N-月桂酰-L-谷氨酸-2-辛基十二酯、己二酸二-2-庚基十一酯、乙基月桂酸酯、癸二酸二-2-乙基己酯、肉豆蔻酸2-己基癸酯、棕櫚酸2-己基癸酯、己二酸2-己基癸酯、癸二酸二異丙酯、琥珀酸2-乙基己酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、檸檬酸三乙酯等。
作為硅酮類舉例如二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、甲基氫聚硅氧烷等鏈狀聚硅氧烷；十甲基聚硅氧烷、十二甲基聚硅氧烷等、四甲基四氫聚硅氧烷等環狀聚硅氧烷；形成3維網絡結構的硅氧烷樹脂、硅橡膠等。
作為表面活性劑，可將陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑、非陰離子界面活性劑的任一者配合于本發明產生促進劑。
作為陰離子表面活性劑可舉例如肥皂用基劑、十二酸鈉、棕櫚酸鈉等脂肪酸肥皂、十二基硫酸鈉、十二基硫酸鉀等高級烷基硫酸酯鹽、POE十二基硫酸三乙醇胺、POE十二基硫酸鈉等烷基醚硫酸酯鹽、十二酰肌氨酸鈉等N-酰基肌氨酸；N-肉豆蔻酰基-N-甲基牛磺酸鈉、椰子油脂肪酸甲基牛磺酸鈉、十二基甲基牛磺酸鈉等高級脂肪酸酰胺磺酸鹽；POE油基醚磷酸鈉、POE硬脂基醚磷酸等磷酸酯鹽；二-2-乙基己基磺基琥珀酸鈉、單十二酰基單乙醇酰胺聚氧乙烯磺基琥珀酸鈉、十二基聚丙二醇磺基琥珀酸鈉等磺基琥珀酸鹽；線性十二基苯磺酸鈉、線性十二基苯磺酸三乙醇胺、線性十二基苯磺酸等烷基苯磺酸或其鹽；N-十二酰基谷氨酸一鈉，N-硬脂酰谷氨酸二鈉、N-肉豆蔻酰基-L-谷氨酸一鈉等N-酰基谷氨酸鹽、硬化椰子油脂肪酸甘油硫酸鈉等高級脂肪酸酯硫酸酯鹽；土耳其紅油等硫酸化油；POE烷基醚碳酸、POE烷基芳基醚碳酸鹽、α-烯磺酸鹽、高級脂肪酸酯磺酸鹽、二級醇硫酸酯鹽、高級脂肪酸烷基醇酰胺硫酸酯鹽、十二酰基一乙醇酰胺琥珀酸鈉、N-棕櫚酰基天冬氨酸二三乙醇胺、酪蛋白鈉等。
作為陽離子表面活性劑可舉例如氯化硬脂基三甲銨、氯化十二基三甲銨等烷基三甲銨鹽；氯化二硬脂基二甲銨等二烷基二甲銨鹽；氯化聚(N，N’-二甲基-3，5-亞甲基哌啶鎓鹽)，氯化十六基吡啶鎓鹽等烷基吡啶鎓鹽；烷基季銨鹽，烷基二甲基芐銨鹽，烷基異喹啉鹽，二烷基嗎啉鹽，POE烷胺，烷胺鹽，聚氨基脂肪酸衍生物，戊醇脂肪酸衍生物，氯芐烷銨、氯化芐乙氧銨等。
作為兩性表面活性劑，可舉例如2-十一基-N，N，N-(羥乙羧甲基)-2-咪唑啉鈉、2-椰脂基-2-咪唑啉氫氧化物-1-羧羥乙氧基2鈉鹽等咪唑啉系兩性表面活性劑；2-十七基-N-羧甲基-N-羥乙基咪唑啉甜菜堿、十二基二甲氨基乙酸甜菜堿、烷基甜菜堿、酰胺甜菜堿、磺基甜菜堿等甜菜堿系兩性表面活性劑。
非離子表面活性劑可舉例如脫水山梨醇單油酸酯、脫水山梨醇-異硬脂酸酯、脫水山梨醇一月桂酸酯、脫水山梨醇一棕櫚脂酸酯、脫水山梨醇一硬脂酸酯、脫水山梨醇倍半油酸酯、脫水山梨醇三油酸酯、五-2-乙基己酸二甘油脫水山梨醇酯、四-2-乙基己酸二甘油脫水山梨醇酯等脫水山梨醇脂肪酸酯類；一棉籽油脂肪酸甘油酯、一芥酸甘油酯、倍半油酸甘油、一硬脂酸甘油、α，α’-油酸焦谷氨酸甘油、一硬脂酸甘油蘋果酸酯等甘油聚甘油脂肪酸類；一硬脂酸丙二醇酯等丙二醇脂肪酸酯類；硬化蓖麻油衍生物，甘油烷基醚，聚氧乙烯一甲基聚硅氧烷基共聚物等親油性非離子表面活性劑。
另外，可例示POE脫水山梨醇一油酸酯、POE脫水山梨醇一硬脂酸酯、POE脫水山梨醇一油酸酯、POE脫水山梨醇四油酸酯等POE脫水山梨醇脂肪酸酯類；POE山糖醇一月桂酸酯、POE山梨糖醇一油酸酯、POE山梨糖醇五油酸酯、POE山梨糖醇一硬脂酸酯等POE山梨糖醇脂肪酸酯類；POE甘油一硬脂酸酯，POE甘油一異硬脂酸酯，POE甘油三-異硬脂酸酯等POE甘油脂肪酸酯類；POE一油酸酯，POE二硬脂酸酯，POE一二油酸酯、硬脂酸乙二醇酯等POE脂肪酸酯類；POE十二基醚，POE油基醚，POE硬脂基醚，POE山萮基醚，POE 2-辛基十二基醚、POE膽甾烷醇醚等POE烷基醚類；POE辛苯基醚，POE壬苯基醚，POE二壬基苯醚等POE烷苯基醚類；普魯洛尼克(プルロ二ツク)等普魯洛尼克型類，POE·聚氧丙烯(以下略為POP)十六基醚，POE·POP 2-癸基十四基醚，POE·POP一丁基醚，POE·POP氫化羊毛脂，POE·POP甘油醚等POE·POP烷基醚類；四尼克(ラトロ二ツク)等四POE·四POP乙二胺縮合物類；POE蓖麻油，POE硬化蓖麻油，POE硬化蓖麻油一異硬脂酸酯，POE硬化蓖麻油三異硬脂酸酯；POE硬化蓖麻油一焦谷氨酸一異硬脂酸二酯、POE硬化蓖麻油馬來酸等POE蓖麻油或硬化蓖麻油衍生物；POE山梨糖醇酯蜂蠟等POE蜂蠟·羊毛脂衍生物；椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、十二酸一乙醇酰胺、脂肪酸異丙醇酰胺等烷醇酰胺；POE丙二醇脂肪酸酯、POE烷基胺，POE脂肪酸酰胺，蔗糖脂肪酸酯、POE壬苯基甲醛縮合物，烷乙氧基二甲胺氧化物、三油基磷酸等親水性非離子表面活性劑等。
作為防腐劑可舉例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丁酯等。
作為金屬離子阻斷劑可舉例如乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸鈉鹽等乙二胺四乙酸堿金屬鹽、乙二胺四乙酸鈣鹽等乙二胺四乙酸堿土金屬鹽等。
作為水溶性高分子，亦可將天然的高分子、半合成的高分子、合成的高分子、無機的高分子的任一者配合于本發明產生促進劑中。
天然的水溶性高分子，可舉例如阿拉伯膠、黃蓍膠、半乳聚糖、奇露布(キヤロブ)膠、愈創木膠(ゲァ-ガム)、刺梧桐樹膠、角叉膠、果膠、瓊脂、女王子(ケインスシ-ド)(木瓜)(マホメロ)、藻膠(アルゲコロイド)(褐藻萃取物)、淀粉(米，玉蜀黍、馬鈴薯、小麥)等植物系高分子；葡聚糖、琥珀酰葡聚糖、果聚糖等微生物系高分子；羧甲基淀粉、羥丙甲基淀粉等淀粉系高分子；膠原蛋白、酪蛋白、白蛋白、明膠等動物系高分子等。
半合成的水溶性高分子可舉例如甲基纖維素、硝基纖維素、乙基纖維素、羥丙甲基纖維素、羥乙基纖維素、纖維素硫酸鈉、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素鈉(CMC)，結晶纖維素、纖維素粉末等纖維素系高分子，藻酸鈉、藻酸丙二醇酯等藻酸系高分子等。
合成的水溶性高分子，可舉例如聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯甲基醚(PVM)、聚乙烯甲基醚、羧乙烯基聚合物(CARBOPOL等)的乙烯系高分子，聚氧乙烯系高分子；聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物系高分子；聚丙烯酸鈉、聚丙烯酸乙酯、聚丙烯酰胺等丙烯酸系高分子；聚乙烯亞胺、陽離子聚合物；皂土、硅酸鋁鎂，礬輝石(ラポライト)、鋰蒙脫石、硅酸酐等無機系水溶性高分子等。
作為增粘劑，可積極地使用上記的水溶性高分子，可舉例如角叉膠、刺梧桐樹膠、黃蓍膠、奇露布膠、女王子(木瓜)、酪蛋白、葡聚糖、明膠、果膠酸鈉、藻酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素、CMC、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、PVA、PVM、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚丙烯酸鈉、羥乙烯基聚合物、刺槐豆膠(ロ一カスビ一ソガム)、愈創木膠、羅望子膠、二烷基二甲基銨硫酸纖維素、呫噸膠、硅酸鋁鎂、皂土、鋰蒙脫石等。
粉末成分可舉例如滑石、高嶺土、云母、絹云母、白云母、金云母、紅云母、黑云母、氧化鋰云母、蛭石、碳酸鎂、硅酸鍶、硅酸鋇、硅酸鈣、硅酸鎂、鎢酸金屬鹽、鎂、二氧化硅、沸石、硫酸鋇、燒結硫酸鈣(燒石膏)、磷酸鈣、氟磷灰石、羥基磷灰石、陶瓷粉、金屬皂(肉豆蔻酸鋅、棕櫚酸鈣、硬脂酸鋁等)，氮化硼等無機粉末；聚酰胺樹脂粉末(尼龍粉末等)、聚乙烯粉末、聚甲基丙烯酸甲酯粉末、聚苯乙烯粉末、苯乙烯與丙烯酸的共聚物樹脂粉末；苯并胍胺樹脂粉末、聚四氟化乙烯粉末、纖維素粉末等有機粉末；二氧化鈦，氧化鋅等無機白色顏料；氧化鐵(氧化鐵紅)、鈦鐵等無機紅色系顏料；γ-氧化鐵等無機褐色系顏料；黃氧化鐵、黃土等無機黃色顏料；里氧化鐵、炭黑，次氧化鈦等無機黑色系顏料；錳紫、鈷紫等無機紫色系顏料；氧化鉻、氫氧化鉻；鈦酸鈷等無機綠色系顏料；群青、紺青等無機藍色系顏料；氧化鈦涂膜的云母，氧化鈦涂膜的氧化鉍、氧化鈦涂膜的滑石，著色氧化鈦涂膜的云母，三氯氧化鉍、魚鱗箔等珍珠色顏料；鋁粉、銅粉等金屬粉末顏料；可舉紅色201號、紅色202號、紅色204號、紅色205號、紅色220號、紅色226號、色228號、紅色405號、橙色203號、橙色204號、黃色205號、黃色401號、藍色404號、等有機顏愈；紅色3號、紅色106、紅色227號、紅色230號、紅色401號、紅色505號、橙色205號、黃色4號、黃色5號、黃色202號、黃色203號、綠色3號、藍色1號等鋯、鋇或鋁色淀等有機顏料；葉綠素，β-胡蘿卜素等天然色素；鈦黃，卡沙明(カ-サミン)、紅花赤等色劑等。
抗紫外線劑(包括為化學性吸收紫外線的物質的“紫外線吸收劑”及藉物理作用將紫外線散射或反射的物質的“紫外線阻斷劑”的兩者)，可舉例如對氨基苯甲酸等對氨基苯甲酸系紫外線吸收劑；氨茴酸甲酯等氨胺茴酸系紫外線吸收劑；水楊酸辛酯、水楊酸苯酯、水楊酸高酯等水楊酸系紫外線吸收劑；對甲氧基肉桂酸異丙酯、對甲氧基肉桂酸辛酯、對甲氧基肉桂酸-2-乙基己酯、二對甲氧基肉桂酸一-2-乙基己酸甘油酯、[4-雙(三甲硅氧基)甲基甲硅烷基-3-甲基丁基]-3，4，5-三甲氧基肉桂酸酯等肉桂酸系紫外線吸收劑；2，4-二羥基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸鈉等二苯甲酮系紫外級吸收劑；尿刊寧酸、尿刊寧酸乙酯、2-苯基-5-甲基苯并噁唑、2-(2’-羥基-5’-甲苯基)苯并三唑、4-叔丁基-4’-甲氧基二苯酰甲烷等紫外線吸收劑。
又，亦可舉與上記粉末成分重復者，例如氧化鈦、滑石、洋紅、皂土、陶土、氧化鋅等紫外線阻斷劑。
保溫劑可舉例如聚乙二醇、丙二醇、二丙二醇、1，3-丁二醇、己二醇、甘油、二甘油、木糖醇、多醇(マルチト一ル)、麥芽糖、D-甘露糖醇、水飴、葡萄糖、果糖、乳糖、軟骨素硫酸鈉、透明質酸鈉、腺苷磷酸鈉、乳酸鈉、膽汁酸鹽、吡咯烷酮碳酸、葡糖胺、環糊精等。
作為藥效成分，首先可舉維生素類，維生素A油、視黃醇、乙酸視黃醇、棕櫚酸視黃醇等維生素A類；核黃素、丁酸核黃素，黃素腺嘌呤核苷酸等維生素B2類；維生素B6鹽酸鹽、維生素B6二辛酸鹽等維生素B6類；L-抗壞血酸、L-抗壞血酸一棕櫚酸酯、L-抗壞血酸二棕櫚酸酯、L-抗壞血酸-2-硫酸鈉、L-抗壞血酸磷酸酯、DL-α-生育酚-L-抗壞血酸磷酸二酯二鉀、L-抗壞血酸硬脂酸酯、L-抗壞血酸-2-葡糖苷等維生素C類；泛酸鈣、D-泛醇、泛醇基乙基醚、乙酰基泛醇乙基醚等泛酸類；維生素D2(麥角骨鈣化固醇)、膽鈣化固醇等維生素D類；α-生育酚、乙酸生育酚、煙酸DL-α-生育酚、琥珀酸DL-α-生育酚等維生素E類；維生素P，生物素等。
又，亦可舉胎盤提取物，谷胱甘肽、虎耳草提取物、熊果甙等美白劑；蜂王膠，感光素401號，幼牛血液提取物等皮膚賦活劑；壬酸戊酰胺、煙酸芐酯、煙酸β-丁氧基乙酯，辣椒素，姜酮，斑蝥酊，魚石脂，咖啡因，鞣酸，α-冰片，肌醇六煙酸酯，環扁桃酯，肉桂三甲基甘氨酸，芐唑啉，乙酰基膽堿，維拉帕米，頂花防己堿，γ-谷維醇等血行促進劑；硫，2，7-二甲基噻蒽等抗脂漏劑；甘草酸衍生物，甘草次酸衍生物，愈、水楊酸衍生物，日扁柏醇、氧化鋅、脲基海因等消炎劑；雌二醇，乙炔基雌二醇等雌激素劑；精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、酪氨酸、色氨酸等氨基酸類等抗炎劑；鞣酸、檸檬酸等收斂劑；L-薄荷醇，冰片等清涼劑；氯化溶菌酶等。
另外，可將具多樣藥效的各種提取物配合于本發明產生促進劑。例如，葡萄提取物、蕺菜提取物、錦葵、枇杷提取物、黃柏提取物、薏苡仁提取物、獐牙菜提取物、番紅花提取物、川芎提取物、鳶尾花提取物、黃連提取物、黃香草木犀提取物、樺樹提取物、百合花提取物、野芝麻提取物、甘草提取物、芍藥提取物、肥皂草提取物、芒柄花根提取物、絲瓜提取物、辣椒提取物、金雞納提取物、當歸提取物、陳皮提取物、虎耳草提取物、苦參提取物、萍蓬草提取物、茴香提取物、櫻草提取物、玫瑰提取物、地黃提取物、檸檬提取物、大蒜提取物、射干提取物、紫草提取物、蘆薈提取物、菖蒲根提取物、桉提取物、迷迭香提取物、問荊提取物、鼠尾草提取物、百里香提取物、茶提取物、海草提取物、黃瓜提取物、丁香提取物、懸鉤子提取物、蜜蜂花提取物、胡蘿卜提取物、七葉樹提取物、桃提取物、桃葉提取物、桑提取物、矢車菊提取物、金縷梅提取物、生姜提取物、十六液玫瑰提取物、胎盤提取物、胸腺提取物、蠶絲提取液等。
又，此等藥效成分之中，將雌二醇、乙炔基雌二醇等雌激素劑或射干提取物配合于本發明產生促進劑中，則可確認協同的透明質酸產生促進效果。
又，此等藥效成分之中，將L-抗壞血酸、L-抗壞血酸一棕櫚酸酯、L-抗壞血酸二棕櫚酸酯、L-抗壞血酸-2-硫酸鈉、L-抗壞血酸磷酸酯、DL-α-生育酚-L-抗壞血酸磷酸二酯二鉀，L-抗壞血酸硬脂酸酯，L-抗壞血酸-2-葡糖苷等維生素C類配合于本發明產生促進劑，則可確認協同的膠原蛋白產生促進效果。
實施例以下用實施例等，就本發明加以說明。但本發明的技術范圍并非由此等實施例所限定。
樣品的制備(1)試驗樣品的制備將柴胡的干燥根500克，浸漬于10倍量的50％1，3-丁二醇水溶液，于70℃提取1天。將此靜置于冷暗所，使成熟后，過濾，得上記干燥根的提取物(以下，稱為柴胡提取物)4700克。
于制備此柴胡提取物的過程所得的濾液通過合成吸附劑[Diaion HP-2(三菱化學公司制)]的柱后，以40％氯化鐵溶液，分別將柴胡皂甙a及柴胡皂甙d轉變為柴胡皂甙b1及柴胡皂甙b2。
以乙醇洗脫柴胡皂甙后，將其洗脫液減壓濃縮，使干。此干物溶于甲醇后，進行硅膠柱分級處理及高效液相層析法處理，得柴胡皂甙b1(以下亦稱為SSb1)。
柴胡皂甙原，任一者皆經由將如上所得的柴胡皂甙以前述的習知方法做脫糖反應而得。
透明質酸產生試驗及實際使用試驗(1)對于人類表皮細胞的透明質酸產生能力的作用的評估使用來自人類包皮的表皮細胞(克拉波(クラボウ)公司制品以下，稱為表皮細胞。)評估柴胡提取物及SSb1對表皮細胞的透明質酸產生能力的作用。亦即，將懸浮于KGM培養基(以下稱為表皮細胞用培養基倉敷紡績公司制)的表皮細胞(5×104細胞/孔)播種于24孔培養用培養板(Falcon公司制品)，培養至成會合培養(培養條件37℃·5％ CO2)。接著，換成含10.0微克/毫升的柴胡提取物或0.1微克/毫升的SSb1之上記表皮細胞用培養基(于對照組，換成無添加此等樣品之上記表皮細胞用培養基)，于同樣條件下培養48小時。48小時后，取培養上清液，測定培養上清液液中的透明質酸量。此透明質酸量，使用測定用試劑盒“透明質酸板‘中外’”(中外制藥制)測定。
此結果示于

圖1。于圖1，于含柴胡抽取物的體系及含SSb1的體系的任一者，與對照組相比，表皮細胞皆增加產生的透明質酸量。
因而，對柴胡提取物及SSb1的任一者，確認皆具促進人類表皮細胞的透明質酸產生的作用。
(2)對于人類皮膚纖維母細胞的透明質酸產生能力的作用的評估使用來自人類皮膚纖維母細胞的[自外科手術所得的皮膚，以explant法所得者以下稱為纖維母細胞]，評估柴胡提取物及SSb1對于此纖維母細胞的透明質酸產生能力的作用。亦即，將懸浮于1％FBS/DMEM培養基[FBS培養基使用GIBCO公司制，DMEM培養基使用日水制藥公司制]的纖維母細胞(1×104細胞/孔)播種于24孔培養用培養板(Falcon制品)，培養至成會合培養(培養條件37℃·5％ CO2)。接著，換成含有各樣品的含樣品線纖母細胞用培養基。柴胡提取物的濃度為10.0微克/毫升，SSb1的濃度為0.1微克/毫升(于對照組，換成無添加此等樣品之上記表皮細胞用培養基)，于同樣條件下培養48小時。
48小時后，取培養上清液，測定培養上清液中的透明質酸量。此透明質酸量，使用測定試劑盒“透明質酸板‘中外’”(中外制藥制)測定。
結果示于圖2。于第2圖，于含柴胡提取物的系及含SSb1的系的任一系，與對照組的情形比，纖維母細胞產生的透明質酸量皆增加。
因而，于柴胡提取物及SSb1的任一者，皆確認促進人類纖維母細胞的透明質酸產生。
(3)實際使用試驗對于示于第1A表的處方的實施例1A，實施例2A及比較例1A所得的劑，分別實施示于下面的使用試驗。又，配合量為重量％。
第1A表實施例1A 實施例2A 比較例1A(1) 鯨蠟醇(セトステァリルアルコ-ル)3.5 3.5 3.5(2) 角鯊烷40.0 40.040.0(3) 蜂蠟 3.0 3.0 3.0(4) 還原羊毛脂 4.0 4.0 4.0(5) 對羥基苯甲酸乙酯 0.3 0.3 0.3(6) 聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單棕櫚酸酯 2.0 2.0 2.0(7) 硬脂酸一甘油酯 3.0 3.0 3.0(8) 柴胡提取物 3.0--(9) 柴胡皂甙b1 -0.05 -(10) N-硬脂酰谷氨酸鈉 0.5 0.5 0.5(11) 香料 0.03 0.03 0.03(12) 1，3-丁二醇5.0 5.0 5.0(13) 聚乙二醇1500 5.0 5.0 5.0(14) 純水 殘余 殘余 殘余<制法>將(1)～(11)的原料加熱溶解，制備油相。一方面，將(12)及(13)溶于純水，保持于70℃制備水相。而，將前記油相一面加至此水相中，一面攪拌。接著，進行勻漿機處理，使乳化粒子碎裂后，一面攪拌一面急速冷卻，得所希望的霜劑。
此實際使用的試驗，將隨機提取的年齡30至71歲的健康成年女性作為受試者，一組為30名，令連續使用各實施例或比較例的劑歷4周后，對于(甲)皮膚的嬌嫩度的改善效果，(乙)皮膚的緊繃、松弛的改善效果，及(丙)對皺紋、小皺紋的改善效果，以以下的計點判斷，評估30名的平均點數。
(甲)對皮膚的嬌嫩度的改善效果的計點非常改變 3點改善 2點稍微改善1點無改善效果 0點惡化 -1點(乙)對皮膚的緊繃·松弛的改善效果的計點非常改善 3點改善 2點稍微改善 1點無改善效果 0點惡化 -1點(丙)對皺紋·小皺紋的改善效果的計點非常改變 3點改善 2點稍微改善 1點無改善效果 0點惡化 -1點此實際使用試驗的結果示于第2A表第2A表嬌嫩度緊繃·松弛 雀斑·小皺紋實施例1A2.8 2.7 2.3實施例2A2.5 2.4 2.0比較例1A0.7 0.6 0.5此結果，于使用實施例1A或實施例2A的劑的組，對于任一評估項目，與使用比較例1A的劑的組比較，可認定優越的改善效果。
由以上3種試驗，明白通過本發明的產生促進劑，促進細胞外基質成分的一的透明質酸的產生，另外通過此透明質酸的產生促進，將細胞外基質活化，皮膚組織亦正常化，本發明產生促進劑確認有防止皮膚老化的效果。
VII型膠原蛋白產生試驗及實際使用試驗(1)對人類表皮細胞的VII型膠原蛋白產生能力的作用的評估使用來自人類包皮的表皮細胞(克拉波公司制品；以下稱為表皮細胞)，評估柴胡提取物及SSb1對表皮細胞的VII型膠原蛋白產生能力的作用。亦即將懸浮于KGM培養基(以下稱為表皮細胞用培養基倉敷紡績公司制)的表皮細胞(5×103細胞/孔)種于滑動室(Nunc公司制)，接著，換成含有10.0微克/毫升的柴胡提取物或0.1微克/毫升的SSb1之上記表皮細胞用培養基(于對照組，換成無添加此等樣品之上記表皮細胞用培養基)，于37℃、5％ CO2下培養48小時。
而，自體系除去表皮細胞培養用培養基后，表皮細胞以多聚甲醛固定，將此與對VII型膠原蛋白的單克隆抗體(Sakai，L.Y.，等，《細胞生物學雜志》J.Cell.Biol.，103，1577-1586，1986)及FITC標記二次抗體(Sigma公司制)反應，以熒光顯微鏡觀察后，進行照片攝影。
結果示于第3A圖(對照組)，第3B圖(含SSb1的體系)及第3C圖(含柴胡提取物的體系)[第3A圖～第3C圖任一者皆為生物的形態照片)。由此等照片可明白，于含柴胡提取物的系及含SSb1的體系的任一體系，與對照組的情形比較，被熒光標記的表皮細胞數多，顯然地VII型膠原蛋白的產生增加。
(2)對人類皮膚纖維母細胞的VII型膠原蛋白產生能力的作用的評估使用來自人類皮膚的纖維母細胞[自外科手術所得的皮膚，以explant法所得者)以下稱為纖維母細胞]，評估柴胡提取物及SSb1對于此纖維母細胞的VII型膠原蛋白產生能力的作用。亦即，將懸浮于1％FBS/DMEM培養基[FBS培養基GIBCO公司制，DMEM培養基日水制藥公司制以下，稱為纖維母細胞用培養基。]的纖維母細胞(5×103細胞/孔)種于前述的滑動室，接著換成含有各樣品的含樣品的纖維母細胞用培養基。使柴胡提取物的濃度為231.5微克/毫升，SSb1的濃度為0.1微克/毫升(于對照組，換成無添加此等樣品之上記表皮細胞用培養基)，于37℃、5％ CO2下培養48小時。
而自系除去表皮細胞培養用培養基后，纖維母細胞以多聚甲醛固定，將其與對VII型膠原蛋白的單克隆抗體(Sakai，L.Y.，等，《細胞生物學雜志》J.Cell.Biol.，103，1577-1586，1986)及FITC標記二次抗體(Sigma公司制)反應，以熒光顯微鏡觀察后，進行照片攝影。
結果示于第4A圖(對照組)，第4B圖(含SSb1的系)及第4C圖(含柴胡提取物的系)[第4A圖～第4C圖任一者皆為生物的形態照片]。自此等照片可明白，于含柴胡提取物及含SSb1的系的任一系，與對照組的情形比較，顯然被熒光標記的表皮細胞數多，VII型膠原蛋白的產生增加。
(3)于活體外于皮膚三維模型休系的對于VII型膠原蛋白產生能力的作用的評估于由來自人類皮膚的纖維母細胞與表皮細胞所成的三維皮膚模式，進行柴胡提取物及SSb1對VII型膠原蛋白產生能力的作用的評估。
亦即，將纖維母細胞(1×105細胞/毫升)懸浮膠原蛋白溶液(膠原蛋白使用高研公司的I-PA)于冰上制備后，于37℃使膠原蛋白膠凝。其后，自培養皿壁面剝離，以后于纖維母細胞用培養基中培養，使膠原蛋白凝膠收縮，制備真皮模型。
于此真皮模型上種2×105細胞/平方厘米的表皮細胞，于5％FBS/DMEM-KGM培養基(FBS培養基GIBCO公司制，DMEM培養基日水制藥公司制，KGM培養基倉敷紡績公司制)培養，制備皮膚模型。制備皮膚模型后，第1周換成添加樣品的此培養基。又，使柴胡提取物的濃度為231.5微克/毫升，SSb1的濃度為0.1微克/毫升(于對照組，換成無添加此等樣品之上記表皮細胞用培養基)，于37℃、5％ CO2下培養2周。
皮膚模型于液氮中固定包埋，制備切片后，將此與對VII型膠原蛋白的單克隆抗體(Sakai，L.Y.，等，《細胞生物學雜志》J.Cell.Biol.，103，1577-1586，1986)及FITC標記二次抗體(Sigma公司制)反應，于熒光顯微鏡觀察后，進行照片攝影(無圖示)。
此結果，于柴胡提取物及SSb1的任一體系，與對照組的情形比較，明白被熒光標記的表皮細胞數多，VII型膠原蛋白的產生增加。
(4)實際使用試驗對于于示于第1B表所示的處方的實施例1B，實施例2B及比較例1B所得的劑，分別實施以下所示的實際使用試驗。又，配合量為重量％。
第1B表實施例1A實施例2A 比較例1A(1) 鯨蠟醇 3.5 3.5 3.5(2) 角鯊烷 40.040.0 40.0(3) 蜂蠟3.0 3.0 3.0(4) 還原羊毛脂 4.0 4.0 4.0(5) 對羥基苯甲酸乙酯0.3 0.3 0.3(6) 聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單棕櫚酸 2.0 2.0 2.0(7) 硬脂酸一甘油酯 3.0 3.0 3.0(8) 柴胡提取物 0.5 - -(9) 柴胡皂甙b1 - 0.1-(10) N-硬脂酰谷氨酸鈉0.5 0.5 0.5(11) 香料0.030.03 0.03(12) 1，3-丁二醇 5.0 5.0 5.0(13) 聚乙二醇15005.0 5.0 5.0(14) 純水 殘余 殘余 殘余<制法>將(1)～(11)的原料加熱溶解制備油相。一方面，將(12)及(13)溶于純水，保持于70℃，制備水相。然后將前記油相一面攪拌一面添加至此水相中。接著，進行勻漿機處理，將乳化粒子碎裂后，一面攪拌一面急速冷卻，得所希望的霜劑。
此實際使用試驗，以隨機提取的年齡36歲至69歲的健康成年女性為受試者，1組為30名，令連續使用各實施例或比較例的劑歷4周后，對于(甲)皮膚的緊繃、松弛的改善效果及(乙)皺紋、小皺紋的改善效果以以下的計點判斷，以30名的平均點評估。
(甲)對皮膚的緊繃·松弛的改善效果的計點非常改變 3點改善 2點稍微改善 1點無改善效果 0點惡化-1點(乙)對皺紋·小皺紋的改善效果的計點非常改變 3點改善 2點稍微改善 1點無改善效果 0點惡化 -1點此實際使用試驗的結果示于第2B表。
第2B表緊繃·松弛 雀斑·小皺紋實施例1B 2.6 2.3實施例2B 2.7 2.2實施例1B 0.5 0.6此結果，于使用實施例1B或實施例2B的劑的組，對于任一評估項目，可確認與使用比較例1B的劑的組比較，有優越的改善效果。
以上，從4種試驗，通過本發明產生促進劑，促進細胞外基質成分的一的VII型膠原蛋白的產生，而且通過此VII型膠原蛋白的產生促進，活化細胞外基質，又使皮膚組織正常化，另外強化皮膚與真皮間的結合力，其結果，本發明產生促進劑以防止皮膚老化上有優越的效果。
以下，公開將種種處方的本發明產生促進劑作為處方例此等任一者的產生促進劑于上記的實際使用試驗，可得與上記實施例同等“保持皮膚嬌嫩度”、“防止皮膚緊繃、松弛”，另外“防止皮膚的雀斑”等結果。
乳液(1)配合量(重量％)硬脂酸 6.0脫水山梨醇一硬脂酸酯 2.0聚氧乙烯(20摩爾)脫水山梨醇一硬脂酸酯 1.52-(2’-羥基-5’-甲苯基)苯并三唑8.0丙二醇 10.0柴胡提取物 10.0防腐劑、抗氧化劑 適量香料 適量純水 余額<制法>
于純水中加丙二醇，加熱保持于70℃(水相)。一方面，混合其他成分、加熱溶融，保持于70℃(油相)。于前記水相中，一面攪拌，一面添加此油相，進行預先乳化。接著，以勻漿機將體系的乳化粒子碎裂，且使成均勻后，一面徹底攪拌一面急速冷卻，得乳液。
乳液(2)配合量(重量％)硬脂酸 6.0一硬脂酸脫水山梨醇酯2.0一硬脂酸聚氧乙烯(20摩爾)脫水山梨醇酯1.52-(2’-羥基-5’-甲苯基)苯并三唑 8.0丙二醇 10.0柴胡皂甙b21.0防腐劑、抗氧化劑適量香料 適量純水 余額<制法>
與處方例1-1同樣制備。
霜劑(1)配合量(重量％)聚氧乙烯(20摩爾)鯨蠟醇酯 1.0甲苯基聚硅氧烷(20cs) 2.0液體石蠟 3.02-羥基-4-甲氧基二苯甲酮 5.0柴胡皂甙d 0.3丙二醇5.0甘油 2.0乙醇 15.0羧乙烯基聚合物0.3羥丙基纖維素 0.12-氨甲基丙醇 0.1防腐劑 適量香料 適量純水 適量<制法>
于純水中加丙二醇，加熱、保持于70℃(水相)。一方面，混合其他成分，加熱溶融，保持于70℃(油相)。于前記水相中，將此油相一面攪拌，一面添加進行預先乳化。接著，以勻漿機將體系的乳化粒子碎裂，且使均一后，一面徹底攪拌、一面急速冷卻，得霜劑。
霜劑(2)配合量(重量％)聚氧乙烯(20摩爾)鯨蠟醇酯1.0甲苯基聚硅氧烷(20cs)2.0液體石蠟3.02-羥基-4-甲氧基二苯甲酮 5.0柴胡皂甙d 0.5丙二醇 5.0甘油2.0乙醇15.0羧乙烯基聚合物 0.3羥丙基纖維素0.12-氨甲基丙醇0.1防腐劑 適量香料適量純水適量<制法>
與處方例2-1同樣制備。
防曬用美容液(1)配合量(重量％)硬脂酸 3.0鯨蠟醇 1.0羊毛脂衍生物 2.0流動石蠟 2.0硬脂酸2-乙基己酯 2.01，3-丁二醇 6.0聚氧乙烯(10摩爾)一油酸酯 2.0一硬脂酸甘油酯 2.0三乙醇胺 1.02-羥基-4-甲氧基二苯甲酮 3.0對甲氧基肉桂酸辛酯 2.0柴胡皂甙a 0.05香料適量純水余額<制法>
于純水中加1，3-丁二醇及三乙醇胺，加熱、保持于70℃(水相)。一方面，混合其他成分，加熱溶融，保持于70℃(油相)。于前記水相中，將此油相一面攪拌，一面添加進行預先乳化。接著，以勻漿機將體系的乳化粒子碎裂，且使均一后，一面徹底攪拌、一面急速冷卻，得防曬用美容液。
防曬用美容液(2)配合量(重量％)硬脂酸 3.0鯨蠟醇 1.0羊毛脂衍生物2.0液體石蠟2.0硬脂酸2-乙基己酯2.01，3-丁二醇 6.0聚氧乙烯(10摩爾)一油酸酯2.0一硬脂酸甘油酯 2.0三乙醇胺1.02-羥基-4-甲氧基二苯甲酮 3.0對甲氧基肉桂酸辛酯 2.0柴胡皂甙a 0.001香料適量純水余額
<制法>
與處方例3-1同樣制備。
乳化型化妝粉底(W/O乳化型)(1)配合量(重量％)有機改性蒙脫石 0.5異辛酸鯨蠟酯2.0八甲基環四硅氧烷2.0十甲基環五硅氧烷5.0二甲基聚硅氧烷(6cs) 5.0液體石蠟3.0氯化二(十八基)二甲基銨 0.2聚氧烯基改性有機聚硅氧烷5.04-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷 0.3一-2-乙基己酰基二對甲氧基肉桂酸甘油酯 1.0微粒子氧化鈦5.0油醇0.5硬脂酸 0.5二異硬脂酸脫水山梨醇酯 4.0抗氧化劑適量香料適量滑石1.5尼龍粉 1.0純水余額檸檬酸鈉0.51，3-丁二醇 5.0柴胡皂甙b20.5<制法>
于純水中加檸檬酸鈉、1，3-丁二醇、柴胡皂甙b2及抗氧化劑，于70℃加熱攪拌(水相)。將微粒子氧化鈦、滑石及尼龍粉充分混合粉碎(粉末部分)。將其他成分混合，加熱融解，保存于70℃(油相)。前記水相中加粉末部分，于70℃，以勻漿機處理。再加油相，以勻漿機將乳化粒子碎裂均一化后一面徹底攪拌一面急速冷卻，得乳化型化妝粉底。
乳化型化妝粉底(W/O乳化型)(2)配合量(重量％)有機改性蒙脫石 0.5異辛酸鯨蠟酯 2.0八甲基環四硅氧烷 2.0十甲基環戊硅氧烷 5.0二甲基聚硅氧烷(6cs)5.0液體石蠟 3.0氯化二(十八基)二甲基銨 0.2聚氧烯基改性有機聚硅氧烷 5.04-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷0.3一-2-乙基己酰基二對甲氧基肉桂酸甘油酯 1.0微粒子氧化鈦 5.0油醇 0.5硬脂酸 0.5二異硬脂酸脫水山梨醇酯 4.0抗氧化劑 適量香料 適量滑石 1.5尼龍粉 1.0純水 余額檸檬酸鈉 0.51，3-丁二醇 5.0柴胡提取物 5.0<制法>
與處方例4-1同樣制備。
粉狀粉底(1)配合量(重量％)微粒子氧化鈦 7.0滑石 40.0云母 余額尼龍粉 10.0紅氧化鐵 1.0黃氧化鐵 2.0黑氧化鐵 0.2二甲基聚硅氧烷 1.0棕櫚酸-2-乙基己酯9.0倍半油酸脫水山梨醇酯 1.0N，N-二甲基PABA辛酯 0.3柴胡皂甙原A 0.2防腐劑 適量抗氧化劑 適量香料 適量<制法>
將微粒子氧化鈦、滑石、云母、尼龍粉、紅氧化鐵、黃氧化鈦、黑氧化鐵及柴胡皂甙原A以配合機充分粉碎混合(粉末部分)。于此粉末部分加二甲基聚硅氧烷、棕櫚酸-2-乙基己酯、倍半油酸脫水山梨醇酯、N，N-二甲基PABA辛酯，防腐劑抗氧化劑后，將香料噴霧均一混合。以粉碎機將此粉碎后，充填于容器、成型，得粉底。
粉狀粉底(2)配合量(重量％)微粒子氧化鈦 7.0滑石40.0云母 余額尼龍粉 10.0紅氧化鐵 1.0黃氧化鐵 2.0黑氧化鐵 0.2二甲基聚硅氧烷 1.0棕櫚酸-2-乙基己酯9.0倍半油酸脫水山梨醇酯 1.0N，N-二甲基PABA辛酯 0.3柴胡皂甙原A 5.0防腐劑 適量抗氧化劑 適量香料 適量<制法>
與處方例5-1同樣制備[處方例6-1]油性粉底(1)配合量(重量％)微粒子氧化鈦 10.0云母 22.4高嶺土 10.0尼龍粉末 5.0紅氧化鐵 0.5黃氧化鐵 0.5黑氧化鐵 0.1液體石蠟余額二甲基聚硅氧烷 10.0倍半油酸脫水山梨醇酯 2.0甲氧基肉桂酸辛酯 5.0柴胡皂甙原D 0.01香料適量微晶粒蠟 6.0巴西棕櫚蠟 3.0<制法>
將微粒子氧化鈦、云母、陶土、尼龍粉、紅氧化鐵、黃氧化鈦、黑氧化鐵以配合機充分粉碎混合(粉末部分)。另將香料以外的其他成份混合于其中，以85℃予以加熱熔解(油相)。在此油相中將上述粉末在攪拌下添加的。而后添加香料，予以充份磨碎分散后，將其充填于容器中成型，獲得油性粉底。
油性粉底(2)配合量(重量％)微粒子氧化鈦 10.0云母 22.4陶土 10.0尼龍粉末 5.0紅氧化鐵 0.5黃氧化鐵 2.0黑氧化鐵 0.1液體石蠟 余額二甲基聚硅氧烷 10.0倍半油酸脫水山梨醇酯 2.0甲氧基肉桂酸辛酯 5.0柴胡皂甙原D 0.005香料 適量微晶粒蠟 6.0巴西棕櫚蠟 3.0與處方例6-1同樣制備。
產業上的利用可能性本發明產生促進劑促進細胞外基質，更具體言的，透明質酸等酸性粘多糖與膠原蛋白等纖維性蛋白質的產生，細胞外基質的活化與皮膚組織的正常化，另外通過強化表皮與真皮間的結合力得以發揮發止皮膚老化的效果。
權利要求
1.一種細胞外基質的產生促進劑，其系以得自屬于柴胡屬植物的提取物為有效成分。
2.根據權利要求1的細胞外基質的產生促進劑，其中得自屬于柴胡屬植物的提取物的原料為該植物的根部。
3.根據權利要求1或2的細胞外基質的產生促進劑，其中該屬于柴胡屬的植物為柴胡。
4.一種細胞外基質的產生促進劑，其系以柴胡皂甙及/或柴胡皂甙原為有效成分。
5.根據權利要求1至4中任一項的細胞外基質的產生促進劑，其為皮膚外用劑。
6.根據權利要求1至5中任一項的細胞外基質的產生促進劑，其系促進酸性粘多糖及纖維性蛋白質的產生。
7.根據權利要求1至5中任一項的細胞外基質的產生促進劑，其系促進酸性粘多糖的產生。
8.根據權利要求1至5中任一項的細胞外基質的產生促進劑，其系促進纖維性蛋白質的產生。
9.根據權利要求6或7的細胞外基質的產生促進劑，其中該酸性粘多糖為透明質酸。
10.根據權利要求6或8的細胞外基質的產生促進劑，其中該纖維性蛋白質為膠原蛋白。
全文摘要
本發明系有關一種可促進細胞外基質,更具體言的,可促進透明質酸等酸性粘多糖與膠原蛋白等纖維性蛋白質的產生,通過細胞外基質的活化與皮膚組織的正常化,及表皮與真皮間的結合力的強化而得以發揮防止皮膚老化效果的產品。此產品以得自屬于柴胡等柴胡屬的植物的提取物,或進一步以存在于此提取物的柴胡皂甙及柴胡皂甙原為有效成分。藉將此劑為皮膚外用劑使用,可促進上記的酸性粘多糖及纖維性蛋白質等對纖維母細胞等產生。
文檔編號A61K8/97GK1241133SQ9880148
公開日2000年1月12日 申請日期1998年10月5日 優先權日1997年10月7日
發明者中山泰一, 圷信子, 西山敏夫, 堀井和泉 申請人:株式會社資生堂