專利名稱：人工細胞外基質及其制備方法
技術領域：
本發明涉及人工細胞外基質及其制備方法。
背景技術：
臨床上神經外科醫師在手術中常利用自體顱骨骨膜，頸肌筋膜、帽狀腔膜，闊筋膜等自體組織修補硬腦膜缺損，但是取這些材料不僅花費時間長，有時這些組織自身受到損傷而不能被利用，有的部位自身就沒有完整的可利用的組織，常導致沒有足夠的面積能被利用。移植其他組織不僅需要術前規劃，準備第二個手術部位，增加手術和麻醉時間，還要產生新的創傷。另外，即使使用自身組織，自身組織的缺氧常會誘導下方皮質的炎癥反應， 導致腦膜與腦之間的粘連。目前臨床應用的人工硬腦膜材料主要分為同種異體材料、異種材料、合成材料和天然材料四個類型。同種異體腦膜是最早用于臨床的非自體的修復材料。這種材料是從死亡的人體腦取得，經過冷凍干燥加工后作為商品出售。優點為制備簡單、能直接使用、植入方便，可以長期保存，保留了新鮮腦膜的生理特性即早期成纖維細胞的滲入和血管再生，它能融合到周圍的正常組織內而消除排斥反應。但是異體硬腦膜有3個顯著的弱點一是材料來源受到限制，捐獻者缺乏，而且還存在倫理方面的問題；二是傳染性蛋白質因子(Prion)的存在，根據日本厚生省1997年3月發布的調查報告，766名克羅伊茨費爾特-雅各布(Creutz feldt-JakobSyndrome (disease), CJD)患者中，觀例經歷過人體干燥硬腦膜修補術，與JCD 百萬分之一的自然發生率相比，作過硬腦膜修補術的人J⑶發病率明顯高于自然發病率， 為此，厚生省發布使用異體干燥腦膜的禁令，同時世界衛生組織亦發布手術中禁止使用人異體硬腦膜的緊急公告，所以目前有些國家已取消使用冷凍人體硬腦膜作為修補材料；三是價格昂貴超過了病員的承受能力。國內外，異種硬腦膜修復材料是在臨床應用較多的品種，主要是用牛心包膜和羊心包膜制備。異種硬腦膜修補材料的優點是便于獲取，制備簡單，防漏性能較好。但是由于近年來動物源性材料的安全問題，有的國家已經限制該類材料的使用。合成材料容易成型加工，易于消毒，無傳遞病毒的風險。常用于硬腦(脊)膜修補的材料有硅橡膠、聚丙烯、聚四氟乙烯等。但是這些材料僅具有機械充填的功能，而無促組織再生的能力，特別在材料處理不好情況下，日長容易產生滲漏，甚至會引起毛細血管出血，產生慢性炎癥。天然材料是經過加工提純的天然生物大分子物質，可用于硬腦脊膜修補的材料有膠原、殼聚糖、硫酸軟骨素等。它們被稱為人工細胞外基質，是良好的組織工程支架材料。它們除了具有機械屏障作用外，還可作為細胞生長的良好基質，有傳遞細胞化學信號的功能， 因此能促進組織再生。在此過程中，材料本身發生降解，最終被愈合的自身組織替代。這一點正是現代再生醫學要求和提倡的。但是這些材料也有缺點，比如降解速率過快，以致自身新腦膜還未完全形成而材料已經降解。
發明內容
本發明的目的是提供一種有良好的可控降解性能的人工細胞外基質及其制備方法。本發明所提供的人工細胞外基質，主要由殼聚糖、膠原蛋白、透明質酸鈉和賴氨酸制備而成。本發明的人工細胞外基質，其中，所述殼聚糖、所述膠原蛋白、所述透明質酸鈉和所述賴氨酸通過交聯劑交聯。本發明的人工細胞外基質，其中，所述殼聚糖、所述膠原蛋白、所述透明質酸鈉和所述賴氨酸的質量比為(0. 1 400) (1 400) (0.1 5000) (0. 1 5000)。本發明的人工細胞外基質，其中，所述交聯劑選自如下任一種或任幾種甲醛、戊二醛、碳化二亞胺、雙環氧化合物、京尼平和原花青素。本發明所提供的人工細胞外基質的制備方法，包括如下步驟將殼聚糖膠體溶液、膠原蛋白水凝膠、透明質酸鈉水溶液和賴氨酸水溶液混合，再加入交聯劑反應；交聯好的混合凝膠冷凍干燥，獲得所述的人工細胞外基質。本發明的人工細胞外基質的制備方法，其中，所述殼聚糖、所述膠原蛋白、所述透明質酸鈉和所述賴氨酸的質量比為(O. 1 400) (1 400) (0. 1 5000) (0. 1 5000)。本發明的人工細胞外基質的制備方法，其中，所述交聯劑選自如下任一種或任幾種甲醛、戊二醛、碳化二亞胺、雙環氧化合物、京尼平和原花青素。本發明的人工細胞外基質的制備方法，其中，所述殼聚糖膠體溶液為0. 1 5mg/ ml殼聚糖的乙酸溶液，所述乙酸溶液中乙酸的濃度為0. lml/lOOml 0. 5ml/100ml ；所述膠原蛋白水凝膠中膠原蛋白的濃度為1 50mg/ml ；所述透明質酸鈉水溶液中透明質酸鈉的濃度為0. 1 100mg/ml ；所述賴氨酸水溶液中賴氨酸的濃度為0. 1 100mg/ml。本發明的人工細胞外基質的制備方法，其中，所述冷凍干燥的溫度為-80°C 40 "C。本發明的人工細胞外基質具有良好的可控降解性能，良好的生物相容性能和組織修復性能，可作為臨床適用的新型人工硬腦膜。
具體實施例方式實施例1、人工細胞外基質0. Olml/lOOml的乙酸溶液中加入脫乙酰度60%的經過純化的殼聚糖，攪拌2小時，配制成0. lmg/ml的殼聚糖膠體溶液。將0. lmg/ml殼聚糖膠體溶液、lmg/ml膠原蛋白水凝膠、0. lmg/ml透明質酸鈉水溶液和0. lmg/ml賴氨酸水溶液放入交聯罐中混合，0. lmg/ml殼聚糖膠體溶液、lmg/ ml膠原蛋白水凝膠、0. lmg/ml透明質酸鈉水溶液和0. lmg/ml賴氨酸水溶液的體積比為 1:1:1: 1，再加入碳化二亞胺混均，碳化二亞胺與殼聚糖的質量比為0.001 1，50°C 反應2小時，降溫至室溫，將交聯好的混合凝膠裝入凍干盤于_80°C 40°C條件下真空冷凍干燥48小時得到人工細胞外基質。人工細胞外基質的外觀為白色的片狀矩形，表面有晶體光澤，肉眼或放大鏡下可見材料呈無規則短纖維網絡狀結構，用手感知有一定的韌性，外表潔凈無污點。人工細胞外基質的長為4. 32 4. 56cm,寬為4. 24 4. 54cm,厚為0. 5 0. 9cm。人工細胞外基質的化學性能人工細胞外基質的熾灼殘渣0. 3%，pH值7. 1，人工細胞外基質的重金屬含量(以鉛計)小于lOug/g。人工細胞外基質的生物學性能無菌檢驗(GB/T 19973. 2-2005)人工細胞外基質符合無菌規定。細胞毒性試驗(GB/T 16886.5-200 檢測人工細胞外基質的細胞毒性為 0 1級。細菌內毒素試驗(EN455-3-2000)檢測人工細胞外基質的細菌內毒素小于0. 5EU/ ml。Ames試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。染色體畸變試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。微核試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。致敏試驗(GB/T 16886. 10-2005) 檢測無致敏反應。急性供毒試驗(ISO 10993-11 2006)檢測無急性生身毒性反應。植入后局部反應試驗(ISO 10993-6 :2007)，人工細胞外基質植入1周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細胞、嗜中性粒細胞及少量多核巨細胞，材料周圍有肉芽組織包繞。植入4周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細胞、嗜中性粒細胞。植入12周后，植入部位有極少的淋巴細胞、嗜中性粒細胞，試樣材料被降解吸收，無肉眼可辨別異物。上述結果說明本實施例中的人工細胞外基質具有良好的可控降解性能的，良好的生物相容性能和組織修復性能。實施例2、人工細胞外基質0. 5ml/100ml的乙酸溶液中加入脫乙酰度70%的經過純化的殼聚糖，攪拌10小時，配制成5mg/ml的殼聚糖膠體溶液。 將5mg/ml殼聚糖膠體溶液、50mg/ml膠原蛋白水凝膠、100mg/ml透明質酸鈉水溶液和100mg/ml賴氨酸水溶液放入交聯罐中混合，5mg/ml殼聚糖膠體溶液、50mg/ ml膠原蛋白水凝膠、100mg/ml透明質酸鈉水溶液和100mg/ml賴氨酸水溶液的體積比為 80 80 50 50，再加入戊二醛，戊二醛與殼聚糖膠體溶液的體積比為1 400混均， 50°C反應2小時，降溫至室溫，將交聯好的混合凝膠裝入凍干盤于_60°C 30°C條件下真空冷凍干燥48小時得到人工細胞外基質。人工細胞外基質的外觀為白色的片狀矩形，表面有晶體光澤，肉眼或放大鏡下可見材料呈無規則短纖維網絡狀結構，用手感知有一定的韌性，外表潔凈無污點。人工細胞外基質的長為4. 32 4. 56cm,寬為4. 24 4. 54cm,厚為0. 5 0. 9cm。人工細胞外基質的化學性能人工細胞外基質的熾灼殘渣0. 5%，pH值7. 1，人工細胞外基質的重金屬含量(以鉛計)小于lOug/g。人工細胞外基質的生物學性能無菌檢驗(GB/T 19973. 2-2005)人工細胞外基質符合無菌規定。細胞毒性試驗(GB/T 16886.5-200 檢測人工細胞外基質的細胞毒性為 0 1級。細菌內毒素試驗(EN455-3-2000)檢測人工細胞外基質的細菌內毒素小于0. 5EU/ ml。Ames試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。染色體畸變試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。微核試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。致敏試驗(GB/T 16886. 10-2005) 檢測無致敏反應。急性供毒試驗(ISO 10993-11 2006)檢測無急性生身毒性反應。植入后局部反應試驗(ISO 10993-6 :2007)，人工細胞外基質植入1周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細胞、嗜中性粒細胞及少量多核巨細胞，材料周圍有肉芽組織包繞。植入4周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細胞、嗜中性粒細胞。植入12周后，植入部位有極少的淋巴細胞、嗜中性粒細胞，試樣材料被降解吸收，無肉眼可辨別異物。上述結果說明本實施例中的人工細胞外基質具有良好的可控降解性能的，良好的生物相容性能和組織修復性能。實施例3、人工細胞外基質0. 3ml/100ml的乙酸溶液中加入脫乙酰度85%的經過純化的殼聚糖，攪拌30小時，配制成2mg/ml的殼聚糖膠體溶液。將2mg/ml殼聚糖膠體溶液、10mg/ml膠原蛋白水凝膠、10mg/ml透明質酸鈉水溶液和20mg/ml賴氨酸水溶液放入交聯罐中混合，2mg/ml殼聚糖膠體溶液、10mg/ml膠原蛋白水凝膠、10mg/ml透明質酸鈉水溶液和20mg/ml賴氨酸水溶液的體積比為80 20 30 30， 再加入雙環氧化合物混均，雙環氧化合物與殼聚糖膠體溶液的體積比為1 500，50°C反應 2小時，降溫至室溫，將交聯好的混合凝膠裝入凍干盤于_40°C 40°C條件下真空冷凍干燥 48小時得到人工細胞外基質。人工細胞外基質的外觀為白色的片狀矩形，表面有晶體光澤，肉眼或放大鏡下可見材料呈無規則短纖維網絡狀結構，用手感知有一定的韌性，外表潔凈無污點。人工細胞外基質的長為4. 32 4. 56cm,寬為4. 24 4. 54cm,厚為0. 5 0. 9cm。人工細胞外基質的化學性能人工細胞外基質的熾灼殘渣0. 4%，pH值7. 2，人工細胞外基質的重金屬含量(以鉛計)小于lOug/g。人工細胞外基質的生物學性能無菌檢驗(GB/T 19973. 2-2005)人工細胞外基質符合無菌規定。細胞毒性試驗(GB/T 16886.5-200 檢測人工細胞外基質的細胞毒性為 O 1級。細菌內毒素試驗(EN455-3-2000)檢測人工細胞外基質的細菌內毒素小于0. 5EU/ ml。Ames試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。染色體畸變試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。微核試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。致敏試驗(GB/T 16886. 10-2005) 檢測無致敏反應。急性供毒試驗(ISO 10993-11 2006)檢測無急性生身毒性反應。植入后局部反應試驗(ISO 10993-6 :2007)，人工細胞外基質植入1周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細胞、嗜中性粒細胞及少量多核巨細胞，材料周圍有肉芽組織包繞。植入4周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細胞、嗜中性粒細胞。植入12周后，植入部位有極少的淋巴細胞、嗜中性粒細胞，試樣材料被降解吸收，無肉眼可辨別異物。上述結果說明本實施例中的人工細胞外基質具有良好的可控降解性能的，良好的生物相容性能和組織修復性能。實施例4、人工細胞外基質0. lml/lOOml的乙酸溶液中加入脫乙酰度99%的經過純化的殼聚糖，攪拌60小時，配制成3mg/ml的殼聚糖膠體溶液。將3mg/ml殼聚糖膠體溶液、30mg/ml膠原蛋白水凝膠、30mg/ml透明質酸鈉水溶液和30mg/ml賴氨酸水溶液放入交聯罐中混合，3mg/ml殼聚糖膠體溶液、30mg/ml膠原蛋白水凝膠、30mg/ml透明質酸鈉水溶液和30mg/ml賴氨酸水溶液的體積比為50 30 10 10， 再加入甲醛混均，甲醛與殼聚糖膠體溶液的體積比為1 600，50°C反應2小時，降溫至室溫，將交聯好的混合凝膠裝入凍干盤于_80°C 30°C條件下真空冷凍干燥48小時得到人工細胞外基質。人工細胞外基質的外觀為白色的片狀矩形，表面有晶體光澤，肉眼或放大鏡下可見材料呈無規則短纖維網絡狀結構，用手感知有一定的韌性，外表潔凈無污點。人工細胞外基質的長為4. 32 4. 56cm,寬為4. 24 4. 54cm,厚為0. 5 0. 9cm。人工細胞外基質的化學性能人工細胞外基質的熾灼殘渣0. 4%，pH值7. 1，人工細胞外基質的重金屬含量(以鉛計)小于lOug/g。人工細胞外基質的生物學性能無菌檢驗(GB/T 19973. 2-200 人工細胞外基質符合無菌規定。細胞毒性試驗(GB/T 16886.5-200 檢測人工細胞外基質的細胞毒性為 0 1級。細菌內毒素試驗(EN455-3-2000)檢測人工細胞外基質的細菌內毒素小于0. 5EU/ ml。Ames試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。染色體畸變試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。微核試驗(GB/T 16886. 3-2008)檢測為陰性。致敏試驗(GB/T 16886. 10-2005) 檢測無致敏反應。急性供毒試驗(ISO 10993-11 2006)檢測無急性生身毒性反應。植入后局部反應試驗(ISO 10993-6 :2007)，人工細胞外基質植入1周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細胞、嗜中性粒細胞及少量多核巨細胞，材料周圍有肉芽組織包繞。植入4周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細胞、嗜中性粒細胞。植入12周后，植入部位有極少的淋巴細胞、嗜中性粒細胞，試樣材料被降解吸收，無肉眼可辨別異物。上述結果說明本實施例中的人工細胞外基質具有良好的可控降解性能的，良好的生物相容性能和組織修復性能。以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。
權利要求
1.一種人工細胞外基質，主要由殼聚糖、膠原蛋白、透明質酸鈉和賴氨酸制備而成。
2.根據權利要求1所述的人工細胞外基質，其特征在于所述殼聚糖、所述膠原蛋白、 所述透明質酸鈉和所述賴氨酸通過交聯劑交聯。
3.根據權利要求1或2所述的人工細胞外基質，其特征在于所述殼聚糖、所述膠原蛋白、所述透明質酸鈉和所述賴氨酸的質量比為(0.1 400) (1 400) (0.1 5000) (0. 1 5000)。
4.根據權利要求3所述的人工細胞外基質，其特征在于所述交聯劑選自如下任一種或任幾種；甲醛、戊二醛、碳化二亞胺、雙環氧化合物、京尼平和原花青素。
5.人工細胞外基質的制備方法，包括如下步驟將殼聚糖膠體溶液、膠原蛋白水凝膠、透明質酸鈉水溶液和賴氨酸水溶液混合，再加入交聯劑反應；交聯好的混合凝膠冷凍干燥，獲得所述的人工細胞外基質。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述殼聚糖、所述膠原蛋白、所述透明質酸鈉和所述賴氨酸的質量比為(0. 1 400) (1 400) (0.1 5000) (0. 1 5000)。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述交聯劑選自如下任一種或任幾種；甲醛、戊二醛、碳化二亞胺、雙環氧化合物、京尼平和原花青素。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述冷凍干燥的溫度為_80°C 40°C。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述殼聚糖膠體溶液為0.1 5mg/ml殼聚糖的乙酸溶液，所述乙酸溶液中乙酸的濃度為0. lml/lOOml 0. 5ml/100ml ；所述膠原蛋白水凝膠中膠原蛋白的濃度為1 50mg/ml ；所述透明質酸鈉水溶液中透明質酸鈉的濃度為0. 1 100mg/ml ；所述賴氨酸水溶液中賴氨酸的濃度為0. 1 100mg/ml。
10.權利要求1至4中任一所述的人工細胞外基質在制備人工硬腦膜材料中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人工細胞外基質及其制備方法。本發明的人工細胞外基質主要由殼聚糖、膠原蛋白、透明質酸鈉和賴氨酸制備而成。所述殼聚糖、所述膠原蛋白、所述透明質酸鈉和所述賴氨酸的質量比為(0.1～400)∶(1～400)∶(0.1～5000)∶(0.1～5000)。本發明的人工細胞外基質的制備方法是將殼聚糖膠體溶液、膠原蛋白水凝膠、透明質酸鈉水溶液和賴氨酸水溶液混合，再加入交聯劑反應；交聯好的混合凝膠冷凍干燥，獲得所述的人工細胞外基質。本發明的人工細胞外基質具有良好的可控降解性能的，良好的生物相容性能和組織修復性能，可作為臨床適用的新型人工硬腦膜。
文檔編號A61L27/24GK102188746SQ20101012227
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月11日 優先權日2010年3月11日
發明者宋文領, 張艷花, 石凌鋒, 趙春卉 申請人:北京益而康生物工程開發中心