acidphosphatase,TRAP)染色
[0038] 選取標本中部可明顯顯示下頒第一磨牙遠中根根管、根尖孔的切片，按3. 3所述 進行烤片、脫蠟和下行梯度酒精入水。使用TRAP染色試劑盒（美國Sigma公司）進行TRAP 染色。
[0039] 按TRAP染色試劑盒說明書新鮮配制TRAP染液，EP管中依次加入5yL鄰氨基偶 氮甲苯和5yL亞硝酸鈉溶液，輕柔混勻30s，靜置2min。加入提前預熱至37°C的三蒸水 450yL后，分別依次加入萘酷AS-BI磷酸鹽溶液5yL、醋酸溶液20yL、酒石酸溶液10yL， 混勻避光備用（除酒石酸溶液成分外，用上述配方配制空白孵育液，作為陰性對照）。滴加 TRAP染液于標本上，37°C避光孵育lh，流水沖洗5min。蘇木素染液染色l-2min，流水沖洗 3min。玻片置PBS浸泡IOmin返藍。將玻片于通風櫥中避光晾干，二甲苯透明，中性樹膠封 片。玻片置通風櫥內過夜，光學顯微鏡下觀察，陽性細胞胞質呈深紅色/紫色，胞核呈藍色； 具有兩個或兩個以上胞核的TRAP陽性細胞為破骨細胞。
[0040] 3. 4免疫組織化學染色
[0041] 選取標本中部可明顯顯示下頒第一磨牙遠中根根管、根尖孔的切片，按3. 3所 述進行烤片、脫蠟和下行梯度酒精入水。滴加0.4%胃蛋白酶抗原修復液，37°C濕盒孵育 15-20min，PBS浸洗3次，每次3min。滴加3%H202, 37°C濕盒孵育20min以消除內源性過 氧化物酶的活性，PBS浸洗3次，每次3min。滴加2. 5%的BSA溶液37°C封閉30min。滴加 用PBS稀釋的兔來源多克隆抗體SlPl抗體（1:100 ;美國SantaCruz公司）或羊來源多克 隆抗體RANKL抗體（1:200 ;美國SantaCruz公司）或羊來源多克隆抗體OPG抗體（1:200 ; 美國SantaCruz公司），空白對照則只滴加PBS，4°C冰箱孵育過夜。取出切片37°C孵育 30min，PBS浸洗3次，每次5min。免疫組織化學染色所用抗兔/羊試劑盒及二甲基聯苯 胺（Dimethylbenzidine，DAB)試劑盒，均購置于北京中杉金橋生物技術公司。分別滴加抗 兔試劑盒試劑C(SlPl)或抗羊試劑盒試劑I(RANKL/OPG)，37°C孵育15min，PBS浸洗3次， 每次5min。分別滴加抗兔試劑盒試劑D(SlPl)或抗羊試劑盒試劑2 (RANKL/0PG)，37°C孵 育15min，PBS浸洗3次，每次5min。取850yL三蒸水，將DAB試劑盒中A、B、C試劑各取 50yL，混勻后避光置常溫作為DAB工作液備用（每次顯色前新鮮配制）。將上述DAB工作 液滴加至切片。顯微鏡下觀察反應情況，當陽性著色明顯而背景較淡時，洗去DAB溶液，終 止反應，流水沖洗5min。蘇木素染液染色l-2min，流水沖洗3min。玻片置PBS浸泡IOmin 返藍。玻片置70%、80%、90%、95%1、95%11、100%1、100%11酒精內上行梯度乙醇脫水 各30-60s。玻片置通風櫥中干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。玻片置通風櫥內過夜，光學 顯微鏡下觀察，陽性細胞染成棕色。
[0042] 4.觀察指標：
[0043] 4. 1大鼠根尖周病損區骨破壞面積的變化情況
[0044] 切片HE染色并在光鏡及熒光顯微鏡下觀察、拍照。用軟件Image-ProPlus計算 根尖周病變的區域（牙根下1/3部分周圍的組織）的面積。每個下頒骨計算三次，取其均 值作為該樣本的根尖周骨破壞面積。所有測量均以雙盲方式進行。結果見圖1和表1。
[0045] 4. 2大鼠根尖周病損區組織病理形態的變化情況
[0046] HE染色后，觀察大鼠根尖周組織的骨質破壞情況和炎癥細胞浸潤情況。TRAP染色 后，觀察大鼠根尖周組織的破骨細胞分布情況。在高倍視野下（400X)雙盲法隨機選取根 尖周牙槽骨區域內的5個視野對破骨細胞進行細胞計數，計算平均值。結果見圖2和表1。
[0047] 4. 3大鼠根尖周病損區S1P1、RANKL、OPG的表達情況
[0048] 免疫組織化學染色后，觀察大鼠根尖周組織的S1P1、RANKL、0PG表達情況。在高倍 視野下（400X)雙盲法隨機選取根尖周牙槽骨區域內的5個視野對S1P1、RANKL、OPG陽性 細胞進行細胞計數，計算平均值。結果見圖3-5和表2。
[0049] 5?結果：
[0050] 5. 1大鼠根尖周骨破壞面積的變化情況
[0051] 如圖1和表1所不，在7天、21天、35天，Fingolimod給藥組（3mg/kg)與模型對 照組相比，根尖周骨破壞面積都明顯減少。
[0052] 5. 2大鼠根尖周病損區組織病理形態的變化情況
[0053] 如圖2和表1所示，開髓7天模型對照組有破骨細胞出現；Fingolimod給藥組與 模型對照組相比，炎癥細胞浸潤及破骨細胞數目明顯減少。開髓21天，模型對照組有較多 的破骨細胞，骨吸收加重，屬于急性炎癥階段；開髓21天Fingolimod給藥組與模型對照組 相比，炎癥細胞浸潤及破骨細胞數目明顯減少。開髓35天，模型對照組炎癥趨于穩定進入 慢性期；開髓35天Fingolimod給藥組與模型對照組相比，炎癥細胞浸潤及破骨細胞數目顯 著降低。
[0054] 表l.Fingolimod(3mg/kg)對開髓導致大鼠下頒第一磨牙遠中根根尖區破骨細胞 及骨破壞面積的影響（土s，n= 8)
[0055]
[0057] T，與7天模型對照組比較P〈0. 05 ;A，與21天模型對照組比較P〈0. 05 ;_，與35天 模型對照組比較P〈〇. 05。
[0058] 5. 3大鼠根尖周病損區S1P1、RANKL、OPG的表達情況
[0059] 免疫組化結果見圖3-5和表2,如圖3和表2所示，開髓7天、21天和35天 Fingolimod給藥組分別與模型對照組相比，SlPl表達明顯降低。如圖4和表2所示，開髓 7天、21天和35天Fingolimod給藥組分別與模型對照組相比，RANKL表達明顯降低。如圖 5和表2所示，開髓7天、21天和35天Fingolimod給藥組分別與模型對照組相比，OPG表 達無顯著差異。
[0060] 表2.Fingolimod(3mg/kg)對開髓導致大鼠下頒第一磨牙遠中根根尖區S1P1、 RANKL、OPG表達的影響（土s，n= 8)
[0061]
[0062] T，與7天模型對照組比較P〈0. 05 ;A，與21天模型對照組比較P〈0. 05 ;_，與35天 模型對照組比較P〈〇. 05。
[0063] 6?結論
[0064] Fingolimod可抑制開髓所導致的根尖周炎病損區炎癥細胞浸潤和骨質破壞；并 通過降低SlPl和RANKL水平，動態調節根尖周病灶局部RANKL/0PG比值，達到治療根尖周 病的作用。表明Fingolimod在根尖周炎的治療方面有良好的應用前景，可用于制備治療根 尖周炎的藥物。
【主權項】
1. 芬戈莫德在制備用于治療根尖周炎的藥物中的應用。2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于：芬戈莫德在制備用于改善根尖周炎病損區 骨質破壞的藥物中的應用。3. 如權利要求1所述的應用，其特征在于：芬戈莫德在制備用于減緩根尖周炎病損區 炎癥細胞浸潤的藥物中的應用。4. 如權利要求1所述的應用，其特征在于：芬戈莫德在制備用于降低根尖周炎病損區 鞘氨醇-1-磷酸I型受體表達水平的藥物中的應用。5. 如權利要求1所述的應用，其特征在于：芬戈莫德在制備用于降低根尖周炎病損區 核因子kappaB受體激活劑配體表達水平的藥物中的應用。
【專利摘要】本發明公開了芬戈莫德（Fingolimod）在治療根尖周炎中的用途。本發明通過體內實驗發現Fingolimod可顯著抑制開髓所導致的根尖周炎病灶局部炎癥細胞的浸潤和骨質破壞；并通過降低S1P1和RANKL表達水平，動態調節根尖周炎灶局部RANKL/OPG比值，達到治療根尖周炎的作用。上述結果表明Fingolimod是一種有效治療根尖周炎的藥物，Fingolimod可用于制備治療根尖周炎的藥物。
【IPC分類】A61P1/02, A61K31/137
【公開號】CN104887654
【申請號】CN201510294127
【發明人】朱玲新, 肖嵐, 張潔, 彭彬
【申請人】武漢大學
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年6月1日