益生菌雙層微膠囊及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬生物技術領域，具體涉及益生菌雙層微膠囊及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 目前，各種益生菌的保健作用得到普遍認可。在治療腹瀉等胃腸道疾病中，益生菌 制劑廣泛使用，起到了重要的輔助治療作用。據實際應用顯示，該種制劑對儲存環境有嚴格 要求，尤其是需密封冷藏，使用者一旦忽視所述的儲存條件，容易使藥品失效。研究顯示，益 生菌對氧氣極為敏感，對上消化道內的低PH(如胃酸等）的抵抗力較差，因此長時間不良方 式貯存，再經過口服后，能以活性狀態定植腸道的菌數量不多，其產品也存在著保存性差、 隨保存時間延長活菌數急劇下降等缺點，使益生菌的有效應用受到了極大的限制。
[0003] 微膠囊是利用天然或合成的高分子材料（統稱囊材），將囊心物包埋成微小致密 的囊。常用的微膠囊壁材主要有海藻酸鹽等碳水化合物類物質。微膠囊包埋技術可顯著提 高益生菌耐氧和抗胃酸能力，使其以活性狀態到達腸道，進而發揮相應的功效。研究顯示， 即使是以傳統海藻酸鈉單層膠囊包埋益生菌，因其微觀的eggbox結構儲有大量水，卻無法 防止水分蒸發，因此，仍存在易過度失水導致長時間貯藏后變形干硬、隨保存時間延長活菌 數下降的缺點，等等。
[0004] 本申請的發明人擬提供益生菌雙層微膠囊及其制備方法，使產生較好的耐酸性與 腸溶性，且比傳統單層囊具有更好的貯存穩定性。
【發明內容】
[0005] 本發明的目地是提供一種益生菌雙層微膠囊。
[0006] 本發明的進一步目地是提供益生菌雙層微膠囊的制備方法。
[0007] 本發明針對現有技術存在的缺陷進行了改進，鑒于大多數益生菌對O2及上消化道 內低PH較為敏感，為提高益生菌對外界不良環境的耐受程度，并改善傳統單層囊易失水導 致菌體死亡的問題，本發明對傳統單層膠囊包埋益生菌增加第二層膜防止失水，制得益生 菌雙層微膠囊。
[0008] 本發明采用高壓均質乳化法，以雙歧桿菌為實驗對象，先用海藻酸鈉與氯化鈣交 聯包裹形成耐酸的保護層，再用殼聚糖與氯化鈣交聯形成防失水的雙層微膠囊；結果表明， 制得的雙層微膠囊具有較好的耐酸性與腸溶性，比傳統單層囊具有更好的貯存穩定性。
[0009] 本發明的益生菌雙層微膠囊，益生菌雙層微膠囊，包括活性成分和膠囊壁，其特征 在于，所述的膠囊壁包括保護層和防失水層，所述的保護層是采用海藻酸鈉與氯化鈣交聯 包裹形成耐酸的保護層，所述的防失水層是采用殼聚糖與氯化鈣交聯形成防失水層。
[0010] 本發明采用高壓均質乳化法，以海藻酸鈉、殼聚糖為囊材與氯化鈣交聯成雙層膜， 以雙歧桿菌為實驗對象，設計L9(34)正交實驗，制得最佳雙層型微膠囊。
[0011] 更具體的，本發明提供了制備益生菌雙層微膠囊的方法，其特征在于，其包括步 驟：
[0012] 1，通過單因素實驗確定各因素的水平范圍，
[0013] 2,再通過L9 (34)正交實驗，篩選最佳雙層型微膠囊；
[0014] 3,得到最佳配方后進行性質綜合實驗，包括模擬耐胃酸、腸溶、貯藏實驗，并進行 對照，證實其性質。
[0015] 本發明中，采用菌粉與壁材原料混合，加去離子水，以200Bar高壓均質乳化 lOmin。所得乳液快速滴入CaCl2溶液（固化液）靜置固化20min。收集洗滌膠囊后植入殼 聚糖與CaCl2溶液成膜20min，再次收集洗滌即得雙層型微膠囊微膠囊；
[0016] 其中，微膠囊包埋產率的測定：包埋產率=微膠囊菌數/加入菌數X100% ;
[0017] 微膠囊菌數測定：將微膠囊溶于2.OMol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7. 0)的破壁液中，待 完全溶解后計數。
[0018] 本發明中，進行了微膠囊制備的單因素實驗：
[0019] 實驗通過單因素實驗測定不同海藻酸鈉濃度（I. 5%、2. 5%、3. 5%)XaCl2:濃度（1%、 2%、3%)、乳糖濃度（4%、5%、6%)、殼聚糖濃度（0.1%、0.2%、0.3%)對微膠囊包埋產率的影響， 以確定正交實驗水平范圍。
[0020] 本發明中，進行了微膠囊制備的正交實驗：
[0021] 在單因素實驗結果的基礎上，根據上述單因素實驗結果對部分因素的水平進行調 整，采用L9(34)正交試驗，以微膠囊的包埋產率為評價指標，選擇最佳配比。因素水平如表 1所示。
[0022] 表1:因素水平表
[0023]
[0024] 本發明中，進行了雙層微膠囊性質的綜合實驗：
[0025] 在正交實驗結束后，篩選出的最佳配比微膠囊進行性質研究，為保證實驗數據準 確，實驗均在無菌環境下操作進行；
[0026] (1)雙層囊的鏡下觀察：取微膠囊置于載玻片，鏡下觀察并拍照。
[0027] (2)雙層囊的耐酸性能：取微膠囊置于盛有模擬胃液中pHl. 2,37°C條件下180r/ min振蕩lh，每20min取樣稱量溶解質量計算解囊率，并計算菌體存活率；Ih后人工解囊活 菌計數，并以普通菌液作空白對照；
[0028] 解囊率=現有質量/原有質量X100% ;
[0029] 活菌率=解囊后活菌數/包埋前活菌數X100%。
[0030] (3.)雙層囊的腸溶性能：取微膠囊置于模擬腸液中pH8. 0,在搖床上37°C、180r/ min進行崩解，每20min取樣稱量溶解質量計算解囊率，人工解囊后活菌計數，計算活菌率。
[0031] (4)單雙層囊貯藏對照實驗：取微膠囊置入玻璃瓶中，敞開式置于超凈工作臺48h 后人工解囊后活菌計數，計算活菌率。并以單層海藻酸鈉微膠囊以及普通菌液作空白對照。
[0032] 結果顯示，本發明針對傳統的單層囊易失水導致膠囊變形、菌體死亡的問題，在單 層囊基礎之上增加殼聚糖膜防止失水制成雙層囊能提高益生菌的穩定性。采用高壓均質 乳化法，在海藻酸鈉濃度為3%，氯化鈣濃度為4%，乳糖濃度為3%時，殼聚糖濃度為0. 2%的 條件下，包埋產率最高，達到91. 2%，活菌率達89. 7%，所得雙層囊具有良好的耐酸性及腸溶 性，在模擬37°C胃酸中處理Ih后活菌率仍達78. 3%，在腸液中20min內釋放完畢，保證了益 生菌以活性狀態定植腸道。
[0033] 本發明制得的雙層囊與單層囊貯存對照實驗結果顯示，具有良好的貯藏性能，雙 層囊在48h及15d的活菌率分別達到84. 6%和79. 6%，而單層囊僅有76. 2%和59. 7%，無包 埋組幾乎為0。相對于傳統的單層海藻酸鈉微膠囊，本發明的雙層囊有著顯著的防失水能 力，能克服因保存時間延長菌體存活率下降的缺點，突破了這個應用限制。本方法制得的微 膠囊采用的原料是食品行業普遍使用的原料，無生物毒性。本實驗方法操作簡單，原料成本 低，能明顯提高了菌體存活率，性價比較高。
[0034] 說明書附圖
[0035] 圖1 :海藻酸鈉濃度對包埋率的影響。
[0036] 圖2 :殼聚糖濃度對包埋率的影響。
[0037] 圖3 :CaCl2濃度對包埋率的影響。
[0038] 圖4 :乳糖濃度對包埋率的影響。
[0039] 圖5 :雙層微膠囊外觀。
[0040] 圖6 :在胃液中的耐酸情況。
[0041] 圖7:菌體耐酸對照。
[0042] 圖8:48h后的單層囊。
[0043] 圖9 :48h后的雙層囊。
【具體實施方式】
[0044] 本實施例中，采用的主要試劑：海藻酸鈉（化學純）、無水氯化鈣（分析純）、市售 光明牌脫脂奶粉、乳糖（分析純）、殼聚糖（化學純）、胰酶、胃酶。以上試劑均為國產；
[0045] 主要儀器：PanDalOOO+高壓均質機、T0MYSX-700高壓蒸汽滅菌鍋、上凈CA920超凈 工作臺、培英THZ-C恒溫振蕩器、0LYMPUSBX61、SZX12顯微鏡；
[0046] 主要溶液：
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