LSECtin作為黑色素瘤免疫治療的靶點的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及LSECtin作為黑色素瘤免疫治療的祀點。
【背景技術】
[0002] 黑色素瘤是由異常黑素細胞過度增生引發的常見的皮膚腫瘤，惡性程度極高，占 皮膚腫瘤死亡病例的極大部分。多發生于皮膚或接近皮膚的黏膜，也見于軟腦膜和脈絡膜。 其發病率隨人種、地域，種族的不同而存有所差異，白種人的發病率遠較黑種人高，居住在 澳大利亞昆±蘭州的白種人其發病率高達17/10萬，我國雖屬黑色素瘤的低發區，但近年 來發病率卻呈不斷上升趨勢。
[0003] 目前對于黑色素瘤的治療手段主要包括；原發病灶的手術切除、放療、化療W及免 疫治療。其中免疫治療手段是近年來逐步發展起來的治療黑色素瘤的有效手段。腫瘤免疫 學治療的目的是激發或調動機體的免疫系統，增強腫瘤微環境抗腫瘤免疫力，從而控制和 殺傷腫瘤細胞。腫瘤免疫學治療的方法種類繁多，已與現代生物高科技技術結合，發展成為 繼手術、化療和放療之后的第四種腫瘤治療模式一腫瘤生物學治療方法。腫瘤免疫治療手 段也包括多種策略；（1)主動免疫；給機體輸入具有抗原性的腫瘤疫苗，刺激機體產生特異 性抗腫瘤免疫，W達到治療腫瘤、預防腫瘤轉移和復發的目的；（2)免疫導向療法；將具有 細胞毒作用的殺傷因子與單克隆抗體偶聯制成"生物導彈"，并利用單抗能特異性結合腫瘤 抗原的特性使殺傷因子"導向"集中到腫瘤病灶，殺傷腫瘤細胞；（3)腫瘤過繼免疫療法；將 自身或異體的抗腫瘤效應細胞的前體細胞，在體外采用IL-2、抗CD3單抗，特異性多膚等激 活劑進行誘導、激活和擴增，然后轉輸給腫瘤患者，提高患者抗腫瘤免疫力，W達到治療和 預防復發的目的；（4)細胞因子療法：該療法是近期隨著高純化或重組細胞因子的生產得 W實現。細胞因子療法的原理是某些細胞因子注射體內后可調節、增強一種或多種免疫細 胞的功能，發揮更強的抗腫瘤免疫功能。目前臨床常用的細胞因子有IL-2、TNF-a、IFN-g及 CSF等；（5)腫瘤的基因療法；其原理是克隆某些可用于腫瘤治療的目的基因，將目的基因 在體外轉染受體細胞，然后回輸體內，或直接將目的基因體內注射，使目的基因在體內有效 表達，增強體內抗腫瘤作用或改善腫瘤微環境增強抗腫瘤免疫力。
[0004] 近年來，腫瘤的主動免疫策略應用較為廣泛，美國食品和藥品監督管理局（抑A) 2011年批準了CTLA4的抗體（Ipilimumab)用于治療黑色素瘤患者。CTLA4是T細胞表面 的具有抑制T細胞免疫反應功能的跨膜分子，針對該一祀點的單克隆抗體，能夠激活病人 的抗腫瘤免疫反應，從而減緩黑色素瘤的疾病進程。因為CTLA4具有非常重要的生理功能， 導致該一藥物在治療過程中有比較大的毒副作用。
[0005]LSECtin化iverSinusoidalElndothelialCellslectin)是II型跨膜糖蛋白，位 于人類19pl3. 3,是C型凝集素家族的新成員。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供抑制LSECtin活性的物質的應用。
[0007] 本發明提供了抑制LSECtin活性的物質在制備具有如下（a)、（b)、（c)中的至少一 種功能的產品中的應用：
[0008]a)治療腫瘤或者抑制腫瘤生長；
[0009]b)促進腫瘤患者的抗腫瘤免疫反應；
[0010] C)促進腫瘤特異性T細胞產生干擾素-Y;
[0011] 所述LSECtin為如下（1)或（2);
[0012] (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0013] (2)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。
[0014] 上述應用中，所述抑制LSECtin活性的物質為抗LSECtin抗體或小分子抑制劑。
[0015] 上述應用中，所述抗LSECtin抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；所述抗LSECtin抗 體具體為多克隆抗體，所述多克隆抗體具體為兔抗鼠LSECtin多克隆抗體。
[0016] 上述應用中，所述廣品為藥品；
[0017] 所述腫瘤為黑色素瘤。
[0018]LSECtin或其編碼基因或含有LSECtin編碼基因的重組載體在制備促進腫瘤生長 產品中的應用也是本發明保護的范圍；
[0019]所述LSECtin為如下（1)或（2);
[0020] (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0021] (2)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。
[0022] 上述應用中，所述LSECtin編碼基因的核巧酸序列為序列表中的序列2。
[0023] 上述應用中，所述促進腫瘤生長通過如下1) -3)中至少一種實現：
[0024] 1)抑巧IJ腫瘤特異性T細胞的增殖；
[00巧]2)增長腫瘤特異性T細胞的細胞周期；
[0026] 3)抑制腫瘤特異性T細胞產生干擾素-Y。
[0027] 上述應用中，所述增長腫瘤特異性T細胞的細胞周期為使腫瘤特異性T細胞細胞 周期的G1期到S期的時間增長；
[0028] 所述使腫瘤特異性T細胞細胞周期的G1期到S期的時間增長體現在抑制CDK2、 CDK4和/或CDK6的表達和/或促進P21的表達。
[0029] 上述應用中，所述產品為藥物；
[0030] 所述腫瘤為黑色素瘤。
[0031]LSECtin作為腫瘤免疫治療的祀點也是本發明保護的范圍；
[0032] 或LSECtin作為祀點在篩選、開發和/或設計預防和/或治療腫瘤產品中的應用； 所述LSECtin的氨基酸序列為序列表中的序列1;
[0033] 上述應用中，所述腫瘤具體為黑色素瘤。
[0034] 本發明通過實驗證明；（1)黑色素瘤病人的腫瘤組織表達LSECtin;(2)小鼠黑色 素瘤細胞系B16細胞表達LSECtin;(3)B16細胞表達的LSECtin促進小鼠黑色素瘤的生 長，該一功能依賴于T細胞的存在；（4)B16細胞表達的LSECtin抑制腫瘤特異性T細胞的 增殖和效應功能。因此，本發明證明抑制LSECtin的活性的物質可W用于制備預防和/或 治療黑色素瘤的藥品，而作為腫瘤免疫治療的祀點；LSECtin在篩選、開發和/或設計預防 和/或治療黑色素瘤產品。本發明具有較大的社會意義和經濟價值。
【附圖說明】
[00巧]圖1為檢測黑色素瘤病人腫瘤組織LSECtin的表達。
[0036] 圖2為檢測小鼠黑色素瘤細胞系B16細胞LSECtin的表達。
[0037] 圖3為判定B16-mock和B16-LSECtin穩定株體外生長結果圖。
[0038] 圖4為野生型小鼠免疫B16-mock和B16-LSECtin細胞之后的腫瘤生長情況。
[0039] 圖5為野生型小鼠免疫B16細胞后注射anti-LSECtin之后的腫瘤生長情況。
[0040] 圖6為抗體清除小鼠體內CD4+和CD8+T細胞的結果。
[00川圖7為清除小鼠CD4+和CD8+T細胞之后，野生型小鼠免疫B16-mock和B16-LSECtin細胞之后的腫瘤生長情況。
[0042] 圖8為LSECtin在體外抑制腫瘤特異性T細胞的增殖。
[0043] 圖9為LSECtin在體外劫持腫瘤特異性T細胞的細胞周期。
[0044] 圖10為LSECtin在體外抑制腫瘤特異性T細胞的效應功能。
[0045] 圖11為LSECtin在體內抑巧IJ腫瘤特異性T細胞的效應功能。
[0046] 圖12為LSECtin促進腫瘤特異性CD8+T細胞干擾素-Y的分泌情況。
【具體實施方式】
[0047] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0048] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0049]C57化/6小鼠；體重20 + 2克，6-8周，購自華