促進心肌修復的可注射殼聚糖復合水凝膠及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種促進心肌修復的可注射殼聚糖復合水凝膠及其制備方法，屬于組織工程領域。
【背景技術】
[0002]水凝膠是一種聚合的網絡結構，在聚合物中有親水的基團或區域，能夠在一定條件下水合產生凝膠結構。水凝膠在組織工程領域可發揮多重作用。例如作為填塞止血材料、生物活性分子的載體以及作為三維支架負載細胞并引導組織的形態發生和重塑。但水凝膠的機械性能一般較弱，難以消毒并且很難在負載藥物和細胞后進行體外交聯而不影響其活性。
[0003]可注射且能原位成型支架的水凝膠在注射前是黏度相對較低的水溶液，注射后會在生理條件下快速轉變成水凝膠。可注射水凝膠與各種藥物、細胞、活性因子等復合后直接或通過微創手術注射入患者體內能夠避免較大創傷的外科手術，降低給病人帶來的不適和并發癥。同時，可注射水凝膠幾乎能填充任意形狀的組織缺損，可簡化組織工程中支架設計等問題。
[0004]殼聚糖水凝膠能夠明顯改善心功能。殼聚糖及其產物具有較強的抗氧化性，在心梗缺血的微環境中能夠有效地抵抗過多的活性氧自由基。但是殼聚糖的抗氧化性隨著分子量的增加而降低，而低分子量的殼聚糖在制作材料時成型困難且力學性能低。所以對高分子量殼聚糖進行化學修飾以提高其抗氧化能力是必要的。
[0005]角蛋白屬于中間絲蛋白類，除了頭發纖維、角和指甲，角蛋白已被證明存在于幾乎所有已分化細胞的細胞核和細胞質中。角蛋白能增強細胞增殖和迀移，角蛋白本身及其降解產物能誘導細胞合成TGF等因子，能夠最大化的減少纖維化的形成，減少不良心臟結構的重構，對心梗修復有著不可忽視的作用。
[0006]綜上，將殼聚糖和角蛋白綜合利用制備可注射水凝膠的研宄是該技術領域的重點研宄方向，具體廣闊的應用前景和研宄價值。
【發明內容】
[0007]發明目的:為了克服現有技術中存在的不足，本發明提供一種促進心肌修復的可注射殼聚糖復合水凝膠及其制備方法，該產品能夠通過注射的方法將材料注入心臟缺損或梗死組織并在原位迅速形成與缺損部位形狀互補的三維支架，同時能夠促進受損部位心肌細胞的生長，達到修復的目的；該產品能夠解決當前可注射水凝膠生物相容性差和力學性能差的技術問題。
[0008]技術方案:為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0009]一種促進心肌修復的可注射殼聚糖復合水凝膠，包括殼聚糖、β -甘油磷酸鈉、京尼平和角蛋白4種溶液，所述各溶液組分按體積比為10: (I?5): (I?3): (0.1?0.5)。
[0010]進一步的，在本發明中，所述殼聚糖溶液是用超純水配制成2%質量濃度的溶液，所述β -甘油磷酸鈉溶液是用超純水配置成11.5%?23%質量濃度的溶液，所述京尼平溶液是用1mM HEPES配制成0.8%?0.9%質量濃度的溶液，所述角蛋白溶液是將角蛋白粉末溶于超純水配制成6%質量濃度的溶液。
[0011]制備所述的促進心肌修復的可注射殼聚糖復合水凝膠的方法，包括以下步驟:
[0012]I)人發角蛋白的提取
[0013]利用過氧乙酸和Tris堿從人發中提取角蛋白；
[0014]2)各組分溶液的制備
[0015]按照相應質量濃度分別配置殼聚糖、β -甘油磷酸鈉、京尼平和角蛋白4種溶液；
[0016]3)殼聚糖/角蛋白復合水凝膠的制備
[0017]將所述殼聚糖、β-甘油磷酸鈉、京尼平和角蛋白4種溶液按照相應比例混合，注入模具，制備殼聚糖/角蛋白復合水凝膠。
[0018]進一步的，在本發明中，所述步驟I)中，人發角蛋白的提取的具體方法為:
[0019]稱取人發，剪碎，用質量濃度2%的過氧乙酸處理24h，再用10mM的Tris溶液處理2h，過濾保留濾液；離心除去不溶物，透析并濃縮提取液，冷凍干燥后研磨制成角蛋白粉末。
[0020]進一步的，在本發明中，所述步驟I)中，人發角蛋白的提取的具體方法為:
[0021]稱取人發，剪碎，用質量濃度2%的過氧乙酸處理24h，再用10mM的Tris溶液處理2h，過濾保留濾液；離心除去不溶物，提取液進行超濾，冷凍干燥后研磨制成角蛋白粉末。
[0022]進一步的，在本發明中，所述步驟3)中，殼聚糖/角蛋白復合水凝膠的制備的具體方法為:
[0023]3-1)將所述殼聚糖溶液和β -甘油磷酸鈉溶液按體積比10: (I?5)的比例混合均勻，得一次混合溶液；
[0024]3-2)在所述一次混合溶液中加入角蛋白溶液，混合均勻，得到殼聚糖溶液、甘油磷酸鈉溶液和角蛋白溶液的體積比為10: (I?5): (0.1?0.5)的二次混合溶液；
[0025]3-3)在所述二次混合液中加入京尼平溶液，混合均勻，得到最終體積比為殼聚糖溶液、β -甘油磷酸鈉溶液、京尼平溶液及角蛋白溶液的體積比為10: (I?5): (I?3):(0.1?0.5)的三次混合溶液。
[0026]進一步的，在本發明中，所述步驟3)中，殼聚糖/角蛋白復合水凝膠的制備的具體方法為:
[0027]3-1-1)將所述β -甘油磷酸鈉溶液和角蛋白溶液按相應體積比例混合均勻；
[0028]3-1-2)在經步驟3-1-1)所得的混合溶液中加入殼聚糖溶液，混合均勻；
[0029]3-1-3)在經步驟3-1-2)所得的混合溶液中加入京尼平溶液，混合均勻，得到最終的混合溶液。
[0030]溶液添加順序有兩種:一種可以先混合甘油磷酸鈉溶液和角蛋白溶液，再加入殼聚糖溶液中混合均勻，最后加入京尼平溶液；或者先將殼聚糖溶液與甘油磷酸鈉溶液混合均勻后，加入角蛋白溶液再混合均勻，最后加入京尼平溶液。
[0031]如果將角蛋白直接加入殼聚糖溶液中會導致沉淀，因為殼聚糖溶液偏酸，黏度大，所以需要添加甘油磷酸鈉調節水溶性殼聚糖溶液的PH值；而京尼平要最后加入，否則會導致交聯反應提前。
[0032]本發明先采用β -甘油磷酸鈉調節水溶性殼聚糖溶液的pH值至6?7，β -甘油磷酸鈉為弱堿性化合物，存在羥基和磷酸根負離子，可以奪取殼聚糖NH3+上的質子，使其接近人體內微環境；再引入交聯劑京尼平，在酸性和中性條件下，殼聚糖上的氨基基團親和攻擊京尼平C-3位的烯碳原子，二氫吡哺環打開，形成雜環胺，這樣可以形成由短鏈京尼平為交聯橋的網狀結構聚合物。通過改變京尼平的用量控制水凝膠溶液的成膠時間，達到混合溶液注射機體后能夠在原位迅速成膠的目的。
[0033]進一步的，在本發明中，所述步驟2)制備的各組分溶液均經0.22 μπι濾器過濾。
[0034]進一步的，在本發明中，成膠時間為2?1min。
[0035]有益效果:本發明提供的促進心肌修復的可注射殼聚糖復合水凝膠及其制備方法，用簡便易行的方法獲得了可降解的三維水凝膠支架；同時，經過實驗證實，該復合水凝膠生物相容性良好，能顯著促進心肌細胞的生長；該方法操作方便、可重復性好；材料表現出良好的生物相容性，在動物實驗中無免疫排斥反應；材料可直接注射到組織缺損部位并快速形成凝膠，水凝膠軟硬度可控，可模擬組織微環境，能促進血管生成和缺損組織的修復。
【具體實施方式】
[0036]為了加深對本發明的理解，下面結合實施例對本發明作進一步詳述。
[0037]以下實施例所用主要原材料:
[0038]殼聚糖(脫乙酰度87.5%，分子量15萬)，購自山東奧康生物科技有限公司；
[0039]β -甘油磷酸鈉，購自阿拉丁公司；
[0040]京尼平，購自之信生物科技有限公司；
[0041]角蛋白，自制。
[0042]實施例1
[0043](I)人發角蛋白的提取
[0044]a)稱取2g人頭發試驗樣品(理發店購得)，剪成2cm左右的片段，置于400mL錐形瓶中；
[0045]b)加入10mL質量濃度2%的過氧乙酸，在37°C搖床上150rpm轉速震蕩24h ；
[0046]c)用350 μπι孔徑的篩網過濾，超純水沖洗頭發試驗樣品，除去多余氧化劑；
[0047]d)用200mL 10mM Tris溶液在37°C轉速150rpm搖床上處理2h，350 μ m篩網過濾，保留濾液，200mL超純水繼續處理1.5h，350 μ m篩網過濾，保留濾液；
[0048]e)兩次濾液合并，6000rpm轉速離心1min去除不溶物，接著用濾紙過濾；
[0049]f)用透析袋(截留分子量3K)透析24h，濃縮溶液，冷凍干燥；凍干物用研缽研磨成粉，得到角蛋白粉末，_80°C保存。
[0050]在本發明中，采用過氧乙酸代替巰基乙醇，極大的降低了毒性，降低安全風險。
[0051](2)殼聚糖/角蛋白復合水凝膠的制備
[0052]a)稱取0.2g水溶性殼聚糖粉末，溶于1mL超純水中，37°C水浴直至完全溶解，高壓蒸汽滅菌，制得質量濃度2%的殼聚糖溶液；
[0053]b)稱取1.15g|3 -甘油磷酸鈉粉末，溶于1mL超純水中，攪拌至完全溶解，0.22 μ m濾器過濾，制得質量濃度11.5%的β -甘油磷酸鈉溶液；
[0054]c)稱取90mg京尼平粉末，溶于1mL濃度為1mM的pH = 7.4的HEPES緩沖液中，37°C水浴溶解12h，0.22 μ m濾器過濾，制得質量濃度0.9%的京尼平溶液；
[0055]d)稱取0.6g上述步驟(I)制得的角蛋白粉末，溶于1mL超純水，攪拌至完全溶解，0.22 μ m濾器過濾，制得質量濃度6 %的角蛋白溶液；
[0056]e)取0.1mL^-甘油磷酸鈉溶液，加入10 μ L角蛋白溶液，混合均勻后加入到ImL殼聚糖溶液中，攪拌均勻至溶液清亮無渾濁；再加入0.1mL京尼平溶液，攪拌均勻，靜置注入準備好的模具中，即得到殼聚糖/角蛋白復合水凝膠。
[0057]本實施例凝膠時間為6min。
[0058]本實施例將制得的混合溶液用注射器注射入大鼠心肌梗死區域，殼聚糖會與京尼平發生化學交聯形成不溶于水的水凝膠，填補了心肌缺損部位，同時能促進缺損部位的心肌細胞增殖，是用于心梗修復的可注射水凝膠材料。
[0059]實施例2
[0060]