54] 由上述直觀分析結果可知，各因素的作用主次為C(加水量）>A(提取次數）> B(提取時間），方差分析結果顯示，因素A和C有顯著性差異。取各因素較高水平組合得最 佳提取工藝為：共提取3次，提取時間2.化，加水量20倍。 陽化5] 2. 2提取工藝驗證試驗：取同一批處方藥材3份，每份72倍處方量，按優選的工藝 條件進行提取，分別取部分提取液按"2. 1"及"2. 2"項下方法操作，測定總多糖提取量和醇 浸出物量，結果見表3。
[0056] 表3提取工藝驗證試驗結果
[0057]
[0058] 由表3可知，按綜合加權評分法所得工藝提取時，總多糖提取量和醇浸出物量均 高于正交試驗結果中的數據，且重復性良好，表明該提取工藝穩定可靠。
[0059] 3超濾工藝試驗
[0060] 3. 1正交優化試驗：影響超濾效果的工藝參數主要有分子截留量（膜孔徑）、操作 壓強、濾過溫度、濃縮程度等，鑒于現有工業用陶瓷超濾膜濾過效率較高，本文在超濾前對 提取液不再濃縮。將"2. 2"項下每批剩余水提液平均分為3份，采用L9 (34)正交表安排試 驗，W膜孔徑（A)、操作壓強度）和濾過溫度rc)為考察因素，W總多糖、醇浸出物保留率 為指標，用綜合加權評分法對其進行評價。考慮到當大分子多糖保留較好時，小分子的醇浸 出物亦能達到較高的保留率，故將總多糖、醇浸出物保留率的權重系數分別定為0.9、0.1， 試驗設計與結果見表4,方差分析見表5。
[0061] 表4超濾工藝正交試驗設計與結果
[0062]
[0063] 表5超濾工藝方差分析
[0064]
陽0化]由直觀分析結果可知，各因素對超濾效果的作用主次為B(操作壓強）>A(膜孔 徑）>C(濾過溫度），方差分析結果顯示，因素B有顯著性差異。取各因素較高水平組合得 最佳超濾工藝為：膜孔徑100皿，操作壓強0.lOMPa，濾過溫度45°C。
[0066] 3. 2超濾工藝驗證試驗：取180倍處方量藥材，按最優提取工藝進行提取，將水提 液平均分為3份，分別按最優超濾工藝進行超濾，測定超濾前后總多糖提取量和醇浸出物 量，進一步計算得到對應保留率，結果見表6。
[0067] 表6超濾工藝驗證試驗結果
[0068]
[0069] 由表6可知，按綜合加權評分法所得最佳工藝超濾時，總多糖和醇浸出物的保留 率均高于優化試驗中的任何一組，且重復性較好，表明得到的超濾工藝切實可行。 陽070] 二、本發明的中藥組合物對高原低氧小鼠肺、腦、腸損傷及免疫功能的影響研究
[0071] 1實驗材料 陽07引 1. 1動物 陽07引選擇SPF級昆明小鼠63只，雌雄各半，6~8周齡，體質量20 +2g，由甘肅中醫藥 大學科研實驗動物中屯、提供，動物合格證號：SCXK(甘）2011-0001。
[0074] 按照臨床用量換算，分別將本實施例中按照最優提取工藝制備的中藥組合物W蒸 饋水配制為混懸液：低劑量化35mg/mL)、中劑量化70mg/mL)、高劑量（0. 14mg/mL)，4°C保 存。 陽〇7引 2實驗方法
[0076] 2.1分組、給藥及造模
[0077] 小鼠適應性飼養3天，常規飲食，自由飲水。采用隨機數字表法將小鼠分為空白對 照組、模型組、中藥組合物低、中、高劑量組。每組12只。各組按相應劑量每日灌胃給藥1 次。空白組及模型組給予等體積蒸饋水。連續給藥14d。第15日開始，每日灌胃SOmin后， 除空白組外，各組小鼠置低壓低氧動物實驗艙內進行減壓低氧暴露：WlOm/s速度上升至 3000m停留5min;同樣速度上升至4500m停留3min;再WlOm/s速度上升至6000m，低氧暴 露連續72h，空白組小鼠在常氧環境中飼養。低氧暴露后連同空白組小鼠一起測定相關指 標。 陽〇7引 2. 2指標測定 陽079] 2. 2. 1對小鼠進艙前后一般情況的觀察
[0080] 觀察動物在進艙前后飲食、飲水情況，動物活動狀態，毛發顏色等改變。
[0081] 2. 2. 2體質量測定
[0082] 進艙前和處死前用電子天平分別檢測每組每只小鼠體質量。
[0083] 2. 2. 3腸道細菌檢測
[0084] 小鼠處死前收集新鮮體外糞便，稱取lOOmg，加入ImL雙蒸水制備成菌液，接種于 液體培養基無氧培養2地。之后接種環取一環接種于載玻片進行菌液涂片，革蘭氏染色，油 鏡下觀察記錄。選取視野，計數200個細菌，計錄球菌、桿菌百分比。
[0085] 2. 2. 4各臟器指數測定
[0086] 小鼠處死后，摘取腦、肺、屯、、腎、脾臟、胸腺剝離干凈，分別用電子天平準確稱重， 分別計算臟器指數。臟器指數=各臟器重量（mg)/體質量（g)。
[0087] 2. 2. 5肺、腦抗氧化功能的測定
[00蝴稱量組織lOOg，用生理鹽水按1 :9的比例稀釋，用研磨器制備10%勻漿，采用普通 離屯、法（轉速為3000;r/min)離屯、lOmin，用微量加樣槍吸取上清液到提前標記好的5mL塑 料試管中待用。
[0089] 肺、腦組織SOD活性的測定按照試劑盒說明進行，在560nm處測定各管的吸光度 值，計算SOD的活性。組織蛋白含量測定采用化O壯ord蛋白濃度測定試劑盒進行測定，按 照試劑盒說明操作。肺、腦組織MDA含量檢測按照試劑盒操作說明進行，在532nm處測定各 管的吸光度值。計算MDA含量。肺、腦組織T-AOC活性檢測按照試劑盒操作說明進行，在 520nm處測定各管的吸光度值。計算T-AOC活性。
[0090] 其中，1、抗氧化能力燈-AOC)測定試劑盒，貨號：A015,規格：100T/50樣，生產批 號：20150602,4°C-8°C保存，常溫運輸，生產公司：南京建成生物工程研究所；
[0091] 2、超氧化物歧化酶（SOD)測定試劑盒，貨號A015,規格：100T/50樣，生產批號： 20150602,4°C-8°C保存，常溫運輸，生產公司：南京建成生物工程研究所；
[0092] 3、丙二醒（MDA)測定試劑盒，貨號：A003-1，規格：100T/96樣，生產批號： 20150617,4°C-8°C保存，常溫運輸，生產公司：南京建成生物工程研究所；
[009引 4、組織蛋白含量度CA)測定試劑盒，試劑盒名稱：B;ro壯ord蛋白濃度測定試劑盒， 生產批號：20150505,生產公司：北京索萊寶科技有限公司。
[0094] 2. 2. 6脾臟T淋己細胞轉化實驗 陽095] 小鼠處死后用75%酒精浸泡5min，用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹腔，分離脾臟。無 菌取出脾臟，吸取5mL無菌PBS液沖洗2次，置于盛有ImLPBS(抑=7. 2)液的無菌培養皿 中，用剪刀剪碎，用無菌注射器針忍輕輕將脾磨碎。經200目篩網過濾，過濾于無菌培養皿 中，用微量移液器移入無菌離屯、管中，靜置IOmin后離屯、（4°C，10(K)r/min)lOmin，棄上清。 用PBS液洗涂2次，最后加入1血含有10%小牛血清的RPMI1640培養液懸浮脾淋己細胞， 用臺吩藍染色計數，調節細胞懸液濃度為5Xl〇6mL。
[0096] 將制備好的脾淋己細胞懸液置于96孔培養板中，分別設ConA刺激組和對照組。 ConA刺激組：100yL脾細胞懸液與10yLConA(終濃度為5yg/mL);對照組：100yL脾 細胞懸液與10yL含血清RPMI1640培養液。37°C、5%C〇2的培養箱中培養6化后每孔加 入20yLMTT(終濃度為5mg/mL)，繼續培養地，每孔加入100yL二甲基亞諷值MSO)溶解， 用搖床振蕩混勻。于酶標儀波長570nm處讀取各孔OD值。
[0097] 計算淋己細胞轉化OD值=實驗組OD值-對照組OD值 陽〇9引刺激指數（SI, % )=實驗組OD值今空白組OD值。
[0099] 2. 2. 7血清IL-6和比-10檢測
[0100] 眼球取血，室溫靜置比后，30(K)r/min離屯、5min，用微量加樣槍吸取血清，按照 ELISA試劑盒說明書操作。于酶標儀波長450nm處測定各孔OD值。W標準品濃度為橫坐 標，繪制標準曲線，求出線性方程。比-10方程為Y=O. 002X+0.151。將各測定樣品的OD 值分別代入方程求出相對應的IL-IO濃度。IL-6方程為Y= 0. 006X+0. 197。將各測定樣 品的OD值分別代入方程求出相對應的IL-6濃度。 陽101] 2. 2. 8肺、腦、小腸、結腸組織病理改變觀察<