用納米線的分子遞送的制作方法
【專利說明】用納米線的分子遞送
[0001]【相關申請】
[0002]本申請是申請號為201180051218.4的專利申請的分案申請。
[0003]本申請要求2010年9月29日提交的美國臨時申請61/387，604和2011年3月14日提交的美國臨時申請61/452，283的優先權。這些現有申請通過引用以其整體并入本文。
[0004]【聯邦資助的研究聲明】
[0005]本發明在國家健康學會合同號1DP10D003893-01資助下政府支持下完成。政府在本發明中具有特定權利。
【【背景技術】】
[0006]外源遺傳物質遞送進細胞可以病毒(例如，使用腺伴隨或慢病毒載體)方式，化學(例如，使用磷酸鈣，脂質體或聚陽離子)方式，機械(例如，微注射)方式，及或物理學(例如，電穿孔)方式達到。
[0007]在這些輸送遞送方法中，通過在2個并行電極之間形成的均一的電場中放置細胞來實現AAA電穿孔。當跨膜電勢超過閾值水平約0.25?IV時，細胞膜的脂質雙層重排列而形成親水孔隙(一般直徑在20?120nm之間)。小于孔徑的任何分子，可由電泳或擴散流入細胞。一般而言，為電穿孔溶液中懸浮的細胞，需要延續幾ys?ms的約1000V(隨細胞尺寸改變)的脈沖。
[0008]雖然此方法對于特定細胞工作有效，小免疫細胞和神經元的電穿孔是欠成功的。當將均一的電場應用于電穿孔用小細胞或神經元時，細胞膜的大級分上的電勢在破斷電勢以上，導致低細胞活力。需要開發用于這些細胞的改善的電穿孔方法。
[0009]【發明概述】
[0010]本發明基于如下預料不到的發現，使用一組導電納米線共同作為細胞內電極，幅度小于10V的電壓波形可有效電穿孔細胞。
[0011]—方面，本發明涉及分子遞送裝置，其包括(i)基體及(ii)附接于表面的多個納米線。基體導電，且納米線用導電層包被。
[0012]上述裝置中使用的導電基體可為由具有用導電材料包被的表面的非-導電或半導電材料制造的基體和表面與納米線通電。或者，其可由導電材料制造。用于基體的材料的例包括半導體(例如，Si和Ge)，化合物半導體(例如，InP和GaA)，金屬氧化物(例如，ΖηΟ, ΙΤ0和Ir氧化物)，及金屬(例如，Au, Pt, Ag, Ir和Cr)。
[0013]術語“納米線”(或在本文稱為“NW”)指稱具有lnm?Ιμπι范圍的直徑的線，桿或錐的形狀的物質。在本文中，錐具有0?90度(例如，0-15度)范圍的半角。NW優選沿著與表面基本上垂直方向(即，60-90度)附接于表面。它們可具有20?10，OOOnm (例如，100-5，OOOnm 和 800-1，200nm)的高度，10 ?500nm(例如，50 ?250nm 和 70 ?180nm)的直徑，及0.05-10線μ m 2 (例如，0.1-5線μ m 2和0.2-2線μπι 2)的密度。它們可由半導體(例如，Si和Ge)，化合物半導體(例如，GaA和InP)，金屬氧化物(例如，ΖηΟ)，金屬(例如，Au, Ag, Ir, Pt)，碳，氮化硼，或其組合形成。
[0014]包被在NW和基體的導電層可由金屬(例如，Au, Ag, Pt, Pd, Cr, Ni, Ir, Al, ff, Ti和Fe)，金屬氧化物(例如，Ir氧化物，ITO和ΖηΟ)，半導體(例如，Si和Ge)，化合物半導體(例如，GaA, GaP, InP, InA, InGaA和GaN)，金屬氮化物(例如，TiN, ZrN和TaN)，或其組合形成。
[0015]化合物半導體可由2個或更多元件形成，諸如IV-1V半導體(例如，SiC和SiGe)，II1-V 半導體(例如，AIN, A1P, AlGaA, GaN, GaA, InP 和 InGaA)，I1-V 半導體(例如，Zn3Sb2和 Cd3As2)，I1-VI 半導體(例如，CdS, CdSe 和 CdTe)，IV-VI 半導體(例如，SnS 和 PbSnTe)，
1-VI半導體(例如，Cu2S)，1-VII半導體(例如，CuCl)，及氧化物半導體(例如，Sn02, CuO和Cu20)。除非另外陳述，用于本發明的電裝置的半導體包括其固有形式(即，純形式)及摻雜的形式(即，含有一種或更多摻雜物)。術語“組合”指稱2種或更多組分的混合物，合金，或適合的反應產物。例如，“硅和金屬的組合”可為硅和金屬的混合物或金屬硅化物。
[0016]在另一方面，本發明涉及將外源分子遞送進細胞的方法。方法包括提供(i)具有表面的基體和多個附接于表面的NW，基體和各NW導電；(ii)使NW與細胞接觸以使NW穿透進細胞；及(iii)在浴溶液中基體和電極之間施加電流或電壓波形。結果，分子通過細胞膜中瞬時形成的孔隙進入細胞。導電NW可⑴由具有用導電材料包被的表面的非-導電或半導電材料制造和NW附接的表面與基體表面通電；或⑵由導電材料制造。
[0017]此方法中使用的裝置與上述的相同，除了在此方法中使用的NW可用導電層包被或不包被之外。
[0018]待遞送的分子可為核酸(例如，DNA和RNA包括siRNA和微RNA)，蛋白，多糖，或小分子。術語“小分子”指稱具有lOOODa以下的分子量的任何分子，包括各種藥物分子，焚光染料，寡糖，寡核苷酸和肽。
[0019]細胞可為原核生物細胞(例如，大腸埃希氏菌(E.coli))或真核生物細胞(例如，酵母細胞和人細胞)。人細胞可為原代細胞，轉化的細胞(例如，HEK細胞)，或癌細胞(例如，HeLa細胞)。原代細胞可為卵母細胞，神經元，成神經細胞，β細胞，肌細胞，成骨細胞，成纖維細胞，角質形成細胞，單核細胞，免疫細胞，或干細胞。免疫細胞可為巨噬細胞，自然殺傷細胞，Τ細胞，及Β細胞，及樹突細胞。干細胞可為胚胎干細胞或成年干細胞(例如，造血干細胞和間葉干細胞)。優選地，各生物學細胞由2種或更多NW穿透。
[0020]電信號可為電流或電壓信號。電壓波形幅度是0.1?10V(例如，3?7V和4?6V)。術語“波形”是作為時間的函數的電壓(或電流)幅度的標繪圖。這是矩形，三角形，鋸齒或竇狀形狀的脈沖的一般術語。
[0021]本發明的再一方面涉及將外源分子遞送進細胞的方法。方法包括(i)提供具有表面的基體，其用絕緣的層，及多個導電納米線包被，具有第1端和第2端的各導電納米線除了第1和第2端之外用電絕緣層包被，第1端附接于表面和第2端用導電層包被；(ii)使納米線與含有分子的浴溶液中浸漬的細胞接觸以使一個或更多納米線穿透進細胞；及(iii)在2個電極之間施加電流或電壓波形，一個連接到各納米線的第1端和其他放進浴溶液。結果，分子通過細胞膜上瞬時形成的孔隙進入細胞。
[0022]此方法中使用的基體可由半導體(例如，Si)，化合物半導體(例如，GaA, InP, GaN和GaP)，或金剛石形成。其用電絕緣的層包被。在此方法中使用的NW與上述那些相同，除了各NW的2端之間的區用電絕緣的層包被之外。此外，各NW可由電壓波形個別達至IJ。電絕緣層由下列物質形成:氧化物(例如，氧化硅，礬土和氧化鉿)，氮化物(例如，氮化娃)或其組合。或者，電絕緣層由下列物質形成:有機物質，諸如Parylene(例如，Parylene C, N, AF-4，SF, HT, A, AM, VT-4或CF)，聚二甲基硅氧烷，甲基丙烯酸甲酯，光刻膠(例如，SU-8)，及電子光刻膠(例如，聚甲基甲基丙烯酸酯，ZEP-520和氫硅倍半氧烷)。
[0023]細胞可為上述原核生物細胞和真核生物細胞。待遞送的分子也可為核酸，蛋白，多糖，或小分子。電信號可為電流或電壓信號。電壓波形幅度是0.1?10V。
[0024]2種上述基于NW的電穿孔方法的一個優勢是達到分子遞送需要的低電壓波形，SP，在10V幅度下。其是約100倍少于由商業電穿孔系統使用的那些。降低需要的電壓不僅使儀表更能承受，其也降低可導致細胞死亡的彎曲的似然性。而且，這些方法可用于通過改變它們的幾何(例如，尺寸)或