Tspan 33是用于治療b細胞霍奇金淋巴瘤的抗體靶向療法的候選物的制作方法
【專利說明】TSPAN 33是用于治療B細胞霍奇金淋己瘤的抗體祀向療法的 候選物
[0001] 關于聯邦政府資助的研究或開發的聲明
[0002] 本發明是在政府支持下根據美國國家衛生研究院（National Institutes of Health)的資助號R21 AI096278做出的。政府享有本發明的某些權利。
[000引背景
技術領域
[0004] 本發明設及在活化的B細胞中表達的蛋白質TSPAN33。
【背景技術】
[0005] B細胞是協調適應性免疫系統的體液反應的淋己細胞(1)。不同于在胸腺中成熟的 T細胞，B細胞在骨髓中產生，其中它們成熟而成為成熟的初始B細胞（1)。8細胞僅負責分泌 識別外來抗原的抗體或在自身免疫性疾病的情況下分泌自身抗原。抗體分為多種亞型，運 些亞型決定了它們的位置和功能運兩者，如參與保護粘膜表面的IgA。某些類型的淋己瘤具 有B細胞起源。B細胞淋己瘤在歷史上已經被分成兩種主要的類型：霍奇金淋己瘤化Odgkin lymphoma, HL)和非霍奇金淋己瘤（NHL)。W托馬斯霍奇金（Thomas Hodgkin)命名并且在 1832年被首次描述(2)的霍奇金氏淋己瘤的特征在于存在李-施二氏細胞(Reed Sternberg cell)、脾、淋己結或身體其他免疫組織的腫大，W及可W波及到淋己組織W外的異常生長。 術語'非霍奇金氏淋己瘤'已經被用于描述不伴有標志性化癥狀的所有類型的淋己瘤。現行 的淋己瘤分類已經將化或NHL分組體系替代為在4大類中含有80種類型的分組體系（2)。本 發明的一些實施方案設及使用在活化B細胞的膜或B細胞淋己瘤中表達的新穎生物標志物 來鑒定特定的病變B細胞或實現對表達也被稱為BAAM抗原的四旋蛋白33 (TSPAN33)的病變B 細胞或T細胞淋己瘤的特異性消除，運是因為已知一些T細胞淋己瘤異常地表達B細胞抗原， 如CD20(3)。因此，使用BAAM作為治療性祀標不受淋己瘤類型的限制，但是受到在淋己細胞 的表面上由TSPAN33/BAAM基因編碼的蛋白質的存在所限制。
[0006] 癌癥免疫療法已經由于治療性單克隆抗體的發展而發生轉變。運些抗體祀向在腫 瘤細胞中特異性表達的細胞表面分子。存在允許同時對數千種基因的表達進行集體篩選的 技術，如基因陣列。生物信息學的應用允許對基因陣列數據進行分析W鑒定編碼細胞表面 蛋白的基因，運些細胞表面蛋白代表了用于研發單克隆抗體的祀標。然后運些抗體可W被 用作治療劑W減緩腫瘤生長或直接殺滅腫瘤細胞。抗體祀向療法已經日益普及，運是因為 保羅?歐立希(Paul化rlich)最初在1908年將抗體設想為可W向微生物或腫瘤遞送毒素 的"魔術彈(magic bullet)" (4)。在1981年，Gaf far ,S.A.等（5)使用針對人類癌胚抗原 (CEA)的放射性標記的抗體W可能經由誘導DNA損傷來向人類結腸癌異種移植物遞送特異 性細胞毒性。在1988年，DeNardo等(6)報道了 10名患有B細胞惡性腫瘤的患者中有4名在接 受放射性標記的抗體祀向療法的施用后完全或部分緩解。不久之后，其他人已經報道了 "裸"（未標記的)抗體經由補體介導的細胞毒性(CMC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的類似 的抗腫瘤活性(7)。
[0007] 治療性抗體與祀分子結合可W觸發通常由該祀分子控制的信號轉導通路。運可W 弓植腫瘤細胞命運的改變。它可W引起細胞調亡、壞死、細胞周期停滯、增強的增殖、或分 化。運些發生改變的細胞行為中的一些在癌細胞的情況下是理想的，特別是引起細胞死亡 或增殖停滯的那些(壞死、細胞調亡）。本領域技術人員可W確定給定的抗體是否在腫瘤細 胞中誘導運些效應中的任一種(8-9)。
[0008] 由小鼠細胞產生的單克隆抗體需要'人源化' W降低它們的免疫原性W用于人類 中。存在多種實現運樣的方式。一種是通過產生人源化抗體，其中抗體的小鼠區域(可結晶 片段或化)被人類化序列置換(9)。運可W使用多種分子生物學技術來完成(8-9)。或者，可 通過對轉基因小鼠進行免疫接種來產生抗體，所述轉基因小鼠的免疫系統已經通過使用分 子生物學技術用人類免疫球蛋白基因置換小鼠免疫球蛋白基因而被改變。已經產生了多種 運樣的小鼠（7)。
[0009] 鑒于上述可能性，治療性單克隆抗體已經變成治療各種癌癥的優選方法（10)。基 于FDA批準的抗體的療法，如利妥昔單抗(rituximabK-種抗CD20抗體)已經被用于治療非 霍奇金氏淋己瘤(NHL) W及自身免疫性病癥，如類風濕性關節炎(RA)(Il)D因此，針對在疾 病細胞/組織上表達的獨特的生物標志物的抗體祀向療法已經被證實有效治療人類癌癥或 自身免疫性病癥。其他實例包括赫賽汀化erceptin)，即一種祀向乳腺癌細胞中的化r-2抗 原的人源化單克隆抗體（12);或阿瓦斯汀(Avastin),即一種祀向結腸直腸癌的血管內皮生 長因子的人源化抗體(13)。運些實例代表了在某些人類癌癥中具有顯著的（積極的）治療作 用的非常成功的抗體。
[0010] 祀向B細胞的抗體已經被證實在治療上是重要的，運是因為許多淋己瘤和白血病 表達B細胞抗原（11)。一個實例是利妥昔單抗（14)，即一種祀向CD20的治療性抗體，所述 CD20是在某些人類淋己瘤中表達的蛋白質。然而，正常的B細胞也表達CD20,因此盡管祀向 CD20的抗體療法消除了大部分的腫瘤細胞，但是運種治療也除去了它們也表達CD20的正常 B細胞（15)。運是在人類中施用利妥昔單抗的嚴重副作用。盡管如此，消除腫瘤細胞的益處 仍證明在患有CD20陽性淋己瘤的患者中使用利妥昔單抗是合理的（11)。
【發明內容】
[0011] 在一個方面，提供了一種治療其中TSPAN33上調的淋己瘤或白血病的方法。所述方 法包括向需要運種治療的患者施用有效治療淋己瘤或白血病的量的抗TSPAN33抗體。
[001引在所述方法中：
[0013] a)所述淋己瘤可為霍奇金淋己瘤、非霍奇金淋己瘤、前體T細胞白血病/淋己瘤、濾 泡性淋己瘤、彌漫性大B細胞淋己瘤、套細胞淋己瘤、B細胞慢性淋己細胞性白血病/淋己瘤、 MALT淋己瘤、伯基特氏淋己瘤(Burkitt'S lymphoma)、伯基特氏淋己瘤、非特指性外周T細 胞淋己瘤（peripheral T-cell Iymphoma-Not-Otherwise-Specifie d)、霍奇金淋己瘤的 結節硬化形式、或霍奇金淋己瘤的混合細胞亞型；
[0014] b)所述淋己瘤可為霍奇金淋己瘤或非霍奇金淋己瘤；
[0015] C)所述施用可W引起患者的TSPAN33+B細胞的數目減少；
[0016] d)所述抗TSPAN33抗體可為單克隆抗體、中和抗體、或人源化抗體、或其組合;或
[0017] e)a-d 的組合。
[0018] 在另一個方面，提供了 一種治療其中TSPAN33上調的免疫性疾病的方法。所述方法 包括向需要運種治療的患者施用有效治療免疫性疾病的量的抗TSPAN33抗體。
[0019] 在所述方法中：
[0020] a)所述免疫性疾病可為過敏或自身免疫性疾病；
[0021 ] b)所述疾病可為類風濕性關節炎、銀屑病、特應性皮炎、舍格倫綜合征(Sjogren'S syndrome)、自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病（Crohn's disease)、硬皮病、過敏性肺炎、自身免疫性甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎化ashimoto thyroiditis)、格雷夫斯氏病(Graves' disease)、強直性脊柱炎、乳糜瀉、特發性血小板減 少性紫齋、混合型結締組織病、多發性硬化、多發性骨髓瘤、尋常天瘤瘡、顛動脈炎、白斑病、 或全身性紅斑狼瘡；
[0022] C)所述疾病可為類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡；
[0023] d)所述施用可W引起患者的TSPAN33+B細胞的數目減少；
[0024] e)所述抗TSPAN33抗體可為單克隆抗體、中和抗體、或人源化抗體、或其組合;或 [00巧]f)a-e的任何組合。
[0026] 在另一個方面，提供了一種將活化的B淋己細胞純化的方法。所述方法包括將抗 TSPAN33抗體與含有淋己細胞的細胞制備物混合，W及分離由所述抗體結合的淋己細胞。在 所述方法中，所述抗TSPAN33抗體可為單克隆抗體、中和抗體、或人源化抗體、或其組合;和/ 或所述分離可通過巧光活化細胞分選來進行。
[0027] 在另一個方面，提供了一種鑒定活化和/或病變的B淋己細胞的方法。所述方法包 括檢測淋己細胞中TSPAN33的表達上調。
[002引在所述方法中：
[0029] a)所述檢測可W包括:將抗TSPAN33抗體添加到包含所述淋己細胞的蛋白質的樣 品中；當在所述樣品中存在TSPAN33時所述抗體與TSPAN33之間形成免疫復合物；W及檢測 所述免疫復合物；
[0030] b)所述檢測可W包括：由所述淋己細胞的RNA制備CDNA;使用對TSPAN33基因中的 核巧酸序列具有特異性的引物擴增所述CDNA，或使所述CDNA與TSPAN33基因的核巧酸序列 雜交；W及檢測所述擴增反應的擴增產物或檢測所述CDNA與TSPAN33核巧酸序列之間的雜 交體；
[0031] C)所述淋己細胞可W來自于患者，并且所述方法還可W包括當檢測到TSPAN33的 表達上調時向所述患者施用抗TSPAN33抗體;或
[0032] d)a)和C)、或b)和C)的任何組合。
[0033] 在另一個方面，提供了一種對設及活化和/或病變的B淋己細胞的淋己瘤或免疫性 疾病進行診斷的方法。所述方法包括針對活化和/或病變的B淋己細胞的存在分析患者的樣 品，運是通過檢測所述樣品的淋己細胞中TSPAN33的表達上調來進行，當檢測到活化和/或 病變的B淋己細胞時，將所述患者診斷為患有所述淋己瘤或免疫性疾病。
[0034] 在所述方法中：
[0035] a)所述疾病可為霍奇金淋己瘤、非霍奇金淋己瘤、前體T細胞白血病/淋己瘤、濾泡 性淋己瘤、彌漫性大B細胞淋己瘤、套細胞淋己瘤、B細胞慢性淋己細胞性白血病/淋己瘤、 MALT淋己瘤、伯基特氏淋己瘤、伯基特氏淋己瘤、非特指性外周T細胞淋己瘤、霍奇金淋己瘤 的結節硬化形式、或霍奇金淋己瘤的混合細胞亞型；
[0036] b)所述疾病可為類風濕性關節炎、銀屑病、特應性皮炎、舍格倫綜合征、自身免疫 性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、硬皮病、過敏性肺炎、自身免疫 性甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯氏病、強直性脊柱炎、乳糜瀉、特發性血小板減少性 紫齋、混合型結締組織病、多發性硬化、多發性骨髓瘤、尋常天瘤瘡、顛動脈炎、白斑病、或全 身性紅斑狼瘡；
[0037] C)所述疾病可為霍奇金淋己瘤、非霍奇金淋己瘤、類風濕性關節炎或全身性紅斑 狼瘡；
[0038] d)檢測所述樣品的淋己細胞中TSPAN33的表達上調可通過本文所述的檢測 TSPAN33表達上調的任何方法來進行。
【附圖說明】
[0039] 為了更完全了解本發明，現在結合附圖參考W下說明，在附圖中：
[0040] 圖1是人類TSPAN33的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)。
[0041 ]圖2是人類TSPAN33(SEQIDN0:1)和小鼠 TSPAN33(SEQIDN0:2)的氨基酸序列 比較。還示出了共有序列（SEQ ID N0:3)。
[0042] 圖3是示出了在正常人類組織中TSPAN33表達限于活化的B細胞的圖表。由基因表 達的人體指數化uman body index)數據庫匯編的Affymetrix基因陣列化133 plus 2.0)數 據觀測到TSPAN33在正常的人類組織(n = 8)和免疫細胞中的表達。X軸由器官系統構成:CNS (中樞神經系統）、Gut(胃腸系統）、Struct(結構系統）、Vasc(脈管系統）、Resp(呼吸系統）、 Endo(內分泌系統）、Ur(泌尿系統）、Rep(生殖系統）、Imm_T(免疫組織）、Imm_C(免疫細胞）、 W及Dev(發育系統）。
[0043] 圖4是示出了在小鼠和人類中TSPAN33表達限于活化的B細胞的圖。4A)與人類骨髓 相比，由人類血液純化的休止的和活化的（抗CD40+化-4)人類B淋己細胞中TSPAN33表達的 qRT-PCR(n = 3)D4B)使用肌動蛋白作為上樣對照，在休止狀態和活化狀態(使用CpG+美洲商 陸有絲分裂原(PWM)+pansorbin)下PBMC的TSPAN33表達的蛋白質印跡。還示出了光密度分 析。4C)在人類沈2 B細胞（黑色條柱）中在抗CD40 mAb+IL-4刺激下W及在人類化rkat T細 胞（白色條柱）中在未刺激、抗CD3+抗CD28 mAb、或PMA+離子霉素（ionomyCin)刺激下在12小 時內隨時間推移TSPAN33表達的9削斗〔3，11 = 3。40)休止的人類262 6細胞相比于使用抗 CD40mAb+IL-4活化的人類沈2 B細胞中TSPAN33表達的蛋白質印跡。還示出了光密度分析。 4E)在休止狀態W及使用0.1、1或10 ng/mL的LPS+比-4的活化狀態下Tspan33 A20-2J B細 胞的qRT-PCRd4F)由C57BL/6脾臟富集的休止的B細胞或被刺激(使用10 ng/mL的LPS+a-4) 12小時的B細胞的qRT-PCR，n = 3，*p<0.05，林p<0.01 W及***p<0.001表示根據斯氏t檢 驗（Student's t test)具有統計顯著性。數據代表S次獨立實驗。誤差棒表示標準偏差 (SD)。
[0044] 圖5是示出了 TSPAN33在人類霍奇金氏淋己瘤和非霍奇金氏淋己瘤中表達的圖。 5A)對多種人類NHL細胞系進行qRT-PCR并且測量TSPAN33(黑色條柱)相比于MS4A1/CD20(白 色條柱)表達。針對GAPD聞尋樣品歸一化。5B)與GAPDH相比，在人類伯基特氏淋己瘤細胞系 尺曰扣、3曰111〇3^及化11山中相對于在8曰。3(-種小鼠祖8細胞系）中對應于15口4肥3的大細胞外 環區33 (LEL)的RT-PCR表達分析。5C)使用兔抗TSPAN33多克隆抗體對Ra j i、Ramo S、Daud i、W 及BaF3細胞的TSPAN33表達進行的蛋白質印跡分析。數據代表S次獨立實驗。
[004引圖6是示出了 TSPAN33在人類淋己瘤中表達的一組圖像。將淋己瘤活檢切片并且使 用蘇木精/伊紅和抗TSPAN33抗體染色，繼而使用同種型或抗兔IgG-HRP染色。白色箭頭指示 李-施二氏細胞并且黑色箭頭指示TSPAN33染色呈陽性的細胞。取自被診斷患有化(n = 6)、 DLB化(n = 6) W及套細胞淋己瘤(n = 2)的患者的活檢的代表性圖像。
[0046] 圖7是示出了 TSPAN33在B細胞相關的自身免疫中上調的圖。7A)針對CD19表達歸一 化的取自MRL/hslpVlpr小鼠的總脾細胞的Tspan33表達的qRT-PCR。比較9周大(無可檢測 出的病變）、24周大(伴有或不伴有輕度耳部病變的淋己結病）W及36周大(伴有耳部和面部 病變的淋己結病）的小鼠的139曰1133表達，11 = 5。78)來自11.5周大的雌性(淋己結病)和12.5 周大的雄性（無病變)MRL/faslpr/lpr小鼠的CD19+CD138-和CD19-CD138+脾細胞中Tspan33 表達的qRT-PCR，n = 2。7C)對來自人類化E患者或健康對照的PBMC進行的TSPAN33表達分析 的qRT-PCR，n = 9D7D)對來自健康人和RA患者的滑膜中TSPAN33表達相比于MS4A1/CD20表達 的微陣列分析。如所述化.Soto ,P.胎vezi ,R. B.Roth ,A. Pahuja,D. Alleva,H.M. Acosta, C.Martinez ,A.Ortega,A.Lopez,R.Araiza-Casillas,A.Zlotnik,Gene array analysis comparison between rat collagen-induced arthritis and human rheumatoid arthritis，Scand J Immunol ,68(2008)43-57)，從對照或RA患者分離滑膜。將RNA從膜中分 離并且使用Affymetrix基因陣列U133 plus 2.0分析MS4A1/CD20和TSPAN33表達，健康人的 n = 9并且RA患者的n = 5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(斯氏t檢驗）。數據代表至少S 次獨立實驗(A-C)。誤差棒表示標準偏差(SD)。
[0047] 圖8是示出了 TSPAN33在近曲小管、遠曲小管W及集合管中表達，但不在腎臟腎小 球中表達的一組圖像。對腎臟活檢進行染色W在組織陣列中進行IHC。將樣品用蘇木精/伊 紅和抗TSPAN33或兔IgG同種型對照染色，繼而用抗兔IgG-HRP染色。8A)示出了淋己細胞(黑 色箭頭）和神經（白色箭頭）的40倍放大圖。8B)示出了近曲小管（黑色箭頭）和腎臟腎小球 (白色箭頭）的40倍放大圖。8C)示出了遠曲小管（黑色箭頭)和集合管（白色箭頭）的40倍放 大圖。8D)示出了頂面(黑色箭頭)和顆粒（白色箭頭)的近曲小管的100倍放大圖。
【具體實施方式】
[0048] 要求2012年12月21日提交的美國臨時申請號61/740，946的優先權，該臨時申請于 W引用的方式并入本文。
[0049] 四旋蛋白33是膜蛋白的四旋蛋白家族的成員（16)并且被定位到人類染色體7 (7q31.2-q32) (17)，即為骨髓發育異常綜合征和急性骨髓性白血病中缺失的熱點的區域 (17)。四旋蛋白33最初被表征為設及紅細胞生成的新四旋蛋白（17-18)。
[0050] 四旋蛋白33還被命名為Penumbra,即Pen(17)(對于原成紅細胞 (町〇斟Tthrob 1 ast)些(新)膜(membrane ))，運是因為帶有化n基因祀向缺失的小鼠（Perf/-) /%^半有貧血和脾品去的異常^夫品嗜堿性1?(：(18)。在小鼠的骨髓中，在包括所有的成紅 細胞的TER119+部分當中發現最高的化numbra表達，而在中性粒細胞、休止的T細胞、休止的 B細胞、單核細胞、或自然殺傷細胞中，Penumbra表達是低的或不可檢出的（18)。盡管該后一 項的研究發現TER119+B細胞是骨髓中最高表達Tspan33的細胞，但本文所包括的我們自己 的數據表明活化B細胞中四旋蛋白33的表達是總骨髓中表達的40倍。后者的觀測結果引導 我們得出結論，即活化的B細胞代表了在人體內具有最高的Tspan33/BAAM表達的細胞。運使 得Tspan33/BAAM成為一種作為治療性抗體研發的祀標的獨特的候選物W治療淋己瘤或某 些人類自身免疫性疾病，其中B細胞設及它們的發病。
[0051] 人類四旋蛋白33(由TSPAN33編碼）已經使用超過90種不同的組織和器官的基因表 達譜的綜合數據庫(基因表達的身體指數)被鑒定為一種存在于B細胞淋己瘤上的生物標志 物（19)。人類四旋蛋白33是與鼠類四旋蛋白33具有97%同源性的四跨膜蛋白超家族的成員 并且設及造血作用（18)。小鼠 BAAM基因與人類BAAM基因之間的高度保守性使得小鼠模型適 用于設及抗體祀向療法的臨床前研究。
[0052] 人類四旋蛋白33蛋白質序列提供于圖1中。人類TSPAN33蛋白質相比于小鼠 TSPAN33蛋白質的比對示于圖2中。人類TSPAN33核巧酸序列的登錄號是NM_178562(W引用 的方式并入本文），而人類TSPAN33蛋白質序列的登錄號是NP_848657(W引用的方式并入本 文)。
[0053] 已經使用基因表達的綜合數據庫（基因表達的身體指數:BIGE(19))在人體的105 種組織和細胞中對Tspan33的表達進行定位。BIGE數據庫表明Tspan 33的表達具有高度特 異性并且最高水平的表達在活化的B細胞中（圖3)。本申請的發明人因此決定將運種分子重 親if命名為BAAM或B細胞活化相關分子(B cell心tivation Associated心Iecule)，運個名 稱更好地反映了-它在人類中的表達接式。具W顯著水平的^AAM表達的^一個部位是腎臟 (圖3)。使用人類RNA的qRT-PCR確認了BAAM表達的運種模式（圖4)，在腎臟中檢測到高水平 的BAAM mRNA。包括一級淋己器官（骨髓和胸腺)和二級淋己器官(脾臟)在內的所有其他組 織W及休止的B細胞的BAAM表達呈陰性。
[0054] 在BAAM表達的淋己外部位當中，在腎臟中的表達引起了對在體內可能治療性使用 抗BAAM抗體的擅化。為了評估針對BAAM的治療性單克隆抗體在腎臟中脫祀部位祀向的可能 性，使用抗BAAM多克隆抗體進行免疫組織化學（圖8)。運些結果掲示BAAM在腎臟的近曲小管 和遠曲小管中表達，而淋己細胞、神經、腎臟集合管W及腎小球不表達BAAM。近曲小管和遠 曲小管襯有上皮刷狀緣細胞，運些細胞設及在尿液濾過期間分泌和吸收蛋白質、離子W及 有機溶質。BAAM在腎臟中的表達因此與B細胞活化無關并且可能設及運些細胞中的囊泡運 輸或信號轉導，運是因為四旋蛋白作為一個家族已經與運些功能相關聯（16)。重要的是，只 有低分子量的蛋白質可W從血流的輸入血管穿過腎小球囊腔并且進入曲小管中，其中尿液 將被集合W轉移至膀脫中。因此，祀向BAAM的治療性單克隆抗體應當不會觸及到它們的祀 標并且影響腎臟功能，運是因為抗體不會進入運個囊腔中。此外，已經報道，腎臟上皮細胞 對于基于生物的細胞毒性劑是無感受性的并且還據報道，腎細胞癌對ADCC具有抗性(20)。 綜上所述，運些數據表明T