span33/BAAM的腎臟表達應當不會引起對在人類中治療性使用抗 BAAM抗體的擔憂。
[0055] 由于TSPAN 33是高度保守的（21)并且在活化的B細胞中高度上調，因此它預期會 參與B細胞的活化。因此，在一個實施方案中，使用抗體來調節B細胞活化并且治療自身免疫 性或過敏性免疫性疾病。術語"表達上調"意指與對照相比表達增加。舉例來說，相對于對照 基因，TSPAN33的表達可W增加，或相對于對照細胞中的表達，表達可W增加。
[0056] B細胞活化標志物作為診斷工具是重要的，運是因為B細胞活化標志物的水平升高 已經被證實與癌癥風險相關，如非霍奇金淋己瘤(NHL) (22-23)。為此，本申請的發明人的理 由是BAAM應在人類淋己瘤中表達，運是因為其他B細胞抗原(特別是CD19和CD20)也在運些 腫瘤中高表達(24)。為了評估TSPAN33在NHL中的表達，對若干種彌漫性B細胞淋己瘤(非霍 奇金淋己瘤)進行RT-PCR并且結果表明BAAM表達與CD20表達相當。還對若干種人類伯基特 氏淋己瘤細胞系(非霍奇金淋己瘤)進行RT-PCR和蛋白質印跡并且TSPAN33在mRNA和蛋白質 水平運兩者上均容易被檢測到。此外，對來自患有侵襲性NHL、套細胞淋己瘤(NHL) W及含有 李-施二氏細胞的霍奇金淋己瘤的患者的活檢進行免疫組織化學。結果表明后者呈BAAM高 度陽性。套細胞淋己瘤呈BAAM陰性。BAAM表達可能與B細胞淋己瘤的活化狀態有關。李-施二 氏細胞被認為源自于已經獲得不利的體細胞超突變并且未能進行細胞調亡的生發中屯、B細 胞，并且因此它們是淋己瘤的活化形式(25)。另一方面，套細胞淋己瘤是含有llql3上的細 胞周期蛋白-Dl基因向14q32上的免疫球蛋白重鏈基因座的啟動子的易位的一種類型的成 熟CD5+B細胞淋己瘤(26)。所述細胞被認為源自于初始的生發中屯、前淋己細胞，因此是未活 化的B淋己細胞的一種形式(26)。因此，在TSPAN33作為針對淋己瘤的治療性抗體的祀標的 有用性方面的差異可能與它們的活化狀態有關。
[0057] B細胞活化的標志物還與某些自身免疫性疾病相關。舉例來說，血清免疫球蛋白， 即IL-6和IL-21水平在被新診斷患有類風濕性關節炎(RA)的患者中均顯著升高(27-28)。為 了進一步探究活化B細胞在RA中的作用W及作為RA的潛在生物標志物的BAAM的表達水平， 使用來自對9名正常人和5名分別接受膝關節重建或置換手術的RA患者的滑膜進行的全基 因表達分析的微陣列數據(29)dBAAM(p = 0.0019)和CD20(p = 0.0008)運兩者的mRNA的水平 在從類風濕性關節炎患者獲得的樣品中均升高。此外，在RA樣品中升高的前25個探針組代 表B細胞活化的標志物，包括免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因，運與活化的B細胞在RA中的作用 一致(29)。得出的結論是，BAAM是人類的RA病變中存在的活化B細胞的生物標志物。運些數 據表明抗BAAM抗體將從運些病變中消除活化的B細胞并且因此將改善RA患者的病況。運些 觀測結果被擴展到其中設及活化B細胞的其他自身免疫性疾病，包括(但不限于)銀屑病、特 應性皮炎、舍格倫綜合征、自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏 病、硬皮病、過敏性肺炎、自身免疫性甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯氏病、強直性脊 柱炎、乳糜瀉、特發性血小板減少性紫齋、混合型結締組織病、多發性硬化、多發性骨髓瘤、 尋常天瘤瘡、顛動脈炎、白斑病W及全身性紅斑狼瘡。
[0058] 本發明的一些實施方案是基于W下發現:BAAM是活化的B細胞和某些類型的淋己 瘤的標志物。在一個方面，本發明提供了治療性抗體治療諸如BAAM陽性淋己瘤和白血病類 型W及自身免疫性疾病之類的設及活化B細胞的疾病的新型和特異性用途。在另一個方面， 本發明提供了 BAAM作為B細胞活化的生物標志物用于診斷設及運種蛋白質的存在的過敏、 自身免疫性疾病或淋己瘤的用途。因此，本發明的一些實施方案提供了由本領域技術人員 制備的針對作為祀標的TSPAN33的治療性抗體治療設及活化B細胞的TSPAN33陽性淋己瘤或 自身免疫性疾病的新型和特異性用途。并且，本發明的一些實施方案提供了 TSPAN33作為活 化B細胞的生物標志物用于診斷設及活化B細胞的疾病，如TSPAN33陽性淋己瘤、自身免疫性 疾病、或過敏的用途。
[0059] 一些實施方案是基于對TSPAN33/BAAM的鑒定和表征W及W下發現：它在活化的B 淋己細胞和某些淋己瘤中上調。運些實施方案提供了治療性單克隆"負載型"或"裸"抗體治 療包括淋己瘤或自身免疫性病癥的呈TSPAN33/BAAM陽性的任何疾病的新型和特異性用途。 詞語"負載型"和"裸"指的是抗體是否與細胞毒性劑，如放射劑、自由基、或毒素綴合，其中 所述抗體將被稱為負載型。詞語"裸"指的是治療性抗體沒有與細胞毒性劑綴合。在本領域 中很容易理解的是，綴合細胞毒性劑可W經由使用抗體作為尋的導彈化oming missile)向 特異性祀標遞送細胞毒性劑來提高抗體的"效力"而潛在地增進單克隆抗體的治療用途。
[0060] 抗TSPAN33抗體可W祀向表達TSPAN33的活化的和/或病變的B淋己細胞并且經由 補體介導的細胞毒性(CMC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或更直接通過改變細胞行為來使 得它們耗竭。此外，抗TSPAN33抗體可W抗體-藥物綴合物的形式使用W提高抗體針對表達 TSPAN33的細胞的殺滅能力。使用抗體使B細胞耗竭已經被證實是一種有效的療法，例如正 如抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗那樣。
[0061] 由小鼠細胞產生的單克隆抗體需要人源化W在人類中使用。存在多種實現運樣的 方式。一種是通過產生人源化抗體，其中抗體的小鼠區域(可結晶片段或Fe)被人類Fc序列 置換。運可W由本領域技術人員使用分子生物學技術W多種方式來完成(7-8)。或者，可通 過對小鼠進行免疫接種來產生抗體，所述小鼠的免疫系統已經通過使用分子生物學技術從 小鼠的免疫系統變成人類的免疫系統。已經產生了多種運樣的小鼠（7)。在某些實施方案 中，人源化或完全人類單克隆抗體的新型和特異性用途是經由針對作為治療性抗體(負載 型或裸）的祀標的TSPAN33/BAAMW治療設及TSPAN33/BAAM陽性的病變B細胞的任何疾病的 運些已知的方法產生的。
[0062] 對設及TSPAN33/BAAM陽性的病變B細胞的任何疾病的治療是基于W下發現： TSPAN33/BAAM被確定是活化B細胞和某些類型的淋己瘤的生物標志物。病變的B細胞被考慮 延展到設及TSPAN33/BAAM陽性的病變B細胞(如在分別針對過敏原和類風濕性關節炎產生 抗體中）的過敏性免疫相關疾病和自身免疫性疾病。
[0063] 在一個實施方案中，提供了一種通過使用所述生物標志物作為治療性單克隆抗體 的祀標來治療呈TSPAN33/BAAM陽性的任何淋己瘤或白血病的方法。運包括表達運種分子的 任何淋己瘤類型，如霍奇金淋己瘤或多種非霍奇金淋己瘤，包括可能表達TSPAN33/BAAM的 某些T細胞淋己瘤。用于治療的其他淋己瘤包括:前體T細胞白血病/淋己瘤;濾泡性淋己瘤； 彌漫性大B細胞淋己瘤;套細胞淋己瘤;B細胞慢性淋己細胞性白血病/淋己瘤;MLT淋己瘤； 伯基特氏淋己瘤；伯基特氏淋己瘤；非特指性外周T細胞淋己瘤;霍奇金淋己瘤的結節硬化 形式;霍奇金淋己瘤的混合細胞亞型。在另一個實施方案中，提供了一種用于治療含有表達 所述生物標志物的病變B淋己細胞的任何免疫性疾病，包括過敏和自身免疫性疾病的方法。 可W使用TSPAN33作為治療性抗體的祀標W使具有針對過敏原的抗體的超敏感的過敏性B 淋己細胞耗竭。同樣，可W使用之前提到的任何方法W類似方式使具有針對自身抗原的自 身抗體的自身反應性B淋己細胞耗竭。
[0064] 在另一個實施方案中，提供了一種通過使用中和抗體阻斷TSPAN33/BAAM來調節B 細胞活化或向T細胞的呈遞的手段。運是基于W下發現:TSAN33/BAAM在人類和小鼠中是超 過97%保守的，因此可W在B細胞功能、活化、增殖或運輸中起作用。因此，由本領域技術人 員研發的中和抗體可W用于阻斷B細胞的功能。運還可W用于調節體液免疫的免疫反應W 通過抑制B細胞的活化或呈遞(如果TSPAN33/BAAM確實實際上在運種功能中起作用的話)來 治療多種疾病，如過敏或自身免疫。可W使用測定來對中和抗體進行篩選，其中抗體與 TSPAN33分子的大細胞外環化化）區結合。舉例來說，可通過將對應于TSPAN33的L化部分的 核巧酸序列克隆到表達載體中，然后將所述表達載體轉染到適當的宿主細胞中來使可溶性 L化表達。抗TSPAN33抗體結合L化的能力可通過蛋白質印跡來測定。
[0065] 抗體是免疫結合劑，如IgG、IgM、IgA、I曲W及IgE。用于制備和使用各種基于抗體 的構建體和片段的技術是本領域公知的。用于制備和表征抗體的手段也是本領域公知的 (參見例女日Harlow和Lane ,''Antibodies : A Laboratory Manual''，Cold Spring Harbor Laborato巧，1988,其W引用的方式并入本文）。單克隆抗體(mAb)被認為具有某些優勢，例 如再現性和大規模生產。因此，人類、鼠類、猴、大鼠、倉鼠、兔W及甚至雞來源的單克隆抗體 被考慮供使用。在一些實施方案中，具有抗原結合區的抗體樣分子可為適當的。運些抗體樣 分子的實例包括但不限于抗體片段，如hb'、Fab、F(ab'）2、單域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈 Fv)等。
[0066] 可W在廣泛的動物物種中制備多克隆抗體。通常，用于產生抗血清的動物是兔、小 鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠或山羊。為了增加免疫原性，使用佐劑W及與諸如但不限于匙孔血藍蛋 白或牛血清白蛋白的載體蛋白綴合是公知的程序。
[0067] 單克隆抗體可W容易地經由使用公知的技術來制備，所述技術如美國專利號4， 196,265中所舉例說明的那些，該美國專利W引用的方式并入本文。通常，運種技術設及使 用所選擇的免疫原組合物，例如純化或部分純化的多膚、膚或結構域對合適的動物進行免 疫接種。W有效刺激抗體產生細胞的方式施用免疫接種組合物(31-33)。
[0068] 舉例來說，在數次免疫接種之后，可通過酶聯免疫吸附測定巧LISA)對血清進行測 試來測定小鼠的血清中抗TSPAN33抗體的存在。在給定的小鼠的血清中確認抗TSPAN33抗體 的存在之后，可W使用如PEG驅動的融合或電融合技術等多種技術將它的脾臟與適用于產 生單克隆抗體的骨髓瘤細胞融合。可W將所得的雜交瘤在HAT培養基中進行選擇并且通過 ELISA針對抗TSPAN33抗體的產生進行篩選。
[0069] 如果需要的話，可W將多克隆抗體或單克隆抗體使用過濾、離屯、W及各種色譜法 (如HPLC或親和色譜)進一步純化。
[0070] 人源化單克隆抗體是動物來源的抗體，所述抗體已經使用遺傳工程技術加 W修飾 W使恒定區和/或可變區框架序列被人類序列置換，同時仍保持原始的抗原特異性。運些抗 體通常源自于對人類抗原具有特異性的曬齒動物抗體。運些抗體一般可用于體內治療應 用。運種策略減少了宿主對外來抗體的反應并且允許選擇人類效應功能。因此，在一些實施 方案中，包括針對TSPAN33的人源化抗體，所述人源化抗體是帶有人類恒定區和/或可變區 結構域的來自小鼠、大鼠或其他物種的嵌合抗體、雙特異性抗體、重組和工程抗體W及其片 段。用于產生人源化免疫球蛋白的技術是本領域技術人員公知的（34-39)。舉例來說，美國 專利號5,693,762公開了用于產生具有一個或多個互補決定區（CDR)的人源化免疫球蛋白 的方法W及所述人源化免疫球蛋白的組合物。當被組合成完整抗體時，所述人源化免疫球 蛋白在人類中基本上無免疫原性，并且對抗原保持與供體免疫球蛋白基本上相同的親和 力，所述抗原諸如含有表位的蛋白質或其他化合物。在運一領域中其他教導的實例包括美 國專利號6，054，297; 5，861，155; W及6，020，192，它們均W引用的方式明確地并入本文。用 于研發為患者的疾病"量身定制"的抗體的方法同樣是已知的并且運些量身定制的抗體也 被涵蓋在內。
[0071] 可W使用抗體的不同制劑或藥物組合物(無菌、緩沖、緩慢釋放、受控釋放、穩定 劑、軟膏劑等)進行治療性處理，運取決于最佳的施用途徑。參見例如Niazi S.K.化n化ook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations Informa Healthcare 2012。此夕K可 W將一種或多種化合物與其他治療劑組合用于單一制劑策略中。可W使用藥理學變體來獲 得所需的藥物代謝動力學結果(分泌、半衰期、溶解度或優化排泄途徑）。
[0072] 抗體的確切劑量將取決于治療的目的，并且將可由本領域技術人員使用已知的技 術來確定。參見例如Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery; Liebe;rman(1992)Pha;rmaceutical Dosage F'orms(第1-3卷），DekkerJSBN 0824770846, 082476918X,0824712692,0824716981；Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of 曲armaceutical Compounding; W及Pickar(1999)。如本領域已知的那樣，針對蛋白質降 解、全身遞送相比于局部遞送、和新蛋白酶合成的速率W及年齡、體重、一般健康情況、性 另IJ、飲食、施用時間、藥物相互作用和病況的嚴重程度進行調整可能是必要的，并且將可由 本領域技術人員使用一定的實驗來確定。
[0073] 各種藥學上可接受的賦形劑是本領域公知的并且可W被包括在制劑或藥物組合 物中。如本文所用的"藥學上可接受的賦形劑"包括在與組合物的活性成分組合時允許所述 成分保持生物活性并且不會引起與受試者的免疫系統的破壞性反應的物質。運可W包括穩 定劑、防腐劑、鹽或糖復合體或晶體等。參見例如Niazi S.K.化n化ook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations Informa Healthcare 2012。
[0074] 可W被包括在制劑或藥物組合物中的示例性藥學上可接受的載體包括無菌的水 性或非水性溶液、懸浮液W及乳液。實例包括但不限于標準藥物賦形劑，如憐酸鹽緩沖鹽水 溶液、水、乳液(如油/水乳液）、W及各種類型的濕潤劑。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙 二醇、植物油如橄攬油，W及可注射有機醋如油酸乙醋。水性載體包括水、醇性/水性溶液、 乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質。腸胃外媒介物包括氯化鋼溶液、林格氏右旋糖 (Ringer's dextrose)、右旋糖W及氯化鋼、乳酸林格氏液Qactated Ringer's)或不揮發 性油。靜脈內媒介物包括體液和營養補充劑、電解質補充劑(如基于林格氏右旋糖的那些） 等。在其他實施方案中，所述組合物將被并入固體基質中，所述固體基質包括緩慢釋放顆 粒、玻璃珠、細帶、眼睛上的插入物、W及局部形式。施用途徑可W包括W下：局部、全身性、 靜脈內、腹膜內、呼吸道、口服、眼睛、植入、經陰道、肛口、栓劑、使用控制釋放的裝置等。
[0075] 用于在本申請中別處所述的適應癥的現有治療劑可W與抗TSPANN33抗體組合使 用或相繼使用W優化治療結果。
[0076] 另一個實施方案提供了一種使用檢測運種生物標志物的存在的測定來篩選病變 的B淋己細胞的手段。實例包括但不限于ELISA、聚合酶鏈反應(PCR)、或巧光活化細胞分選 (FACS)測定，可W使用運些測定針對作為活化的B淋己細胞或病變的B淋己細胞的生物標志 物的TSPAN33/BAAM的表達進行篩選。TSPAN33/BAAM的表達高于"正常"水平可W指示淋己瘤 或如在過敏中所見到的過度活躍的免疫反應。
[OOW]用于檢測TSPAN33的免疫檢測方法可W包括化ISA、放射免疫測定(RiA)、巧光免疫 測定、化學發光測定、生物發光測定、蛋白質印跡、W及免疫組織化學。在運些方法中，使樣 品與對祀蛋白具有親和力的一抗接觸W形成免疫復合物，然后例如通過附接至一抗的標記 (如放射性標記、巧光標記或酶標記)或借助于對一抗具有親和力的二級結合分子(如二抗） 來檢測所述免疫復合物。二級分子可W與標記連接W進行檢測。
[0078]核酸檢測方法包括基于PCR和基于雜交的方法。基于PCR的方法包括但不限于逆轉 錄PCR (RT-PCR )、逆轉錄定量PCR (RT-qPCR)或標準PCR。在基于PCR的方法中，使來自細胞或 組織樣品的RNA逆轉錄成cDNA，然后使用引物擴增。基于雜交的方法的實例包括但不限于 DNA微陣列、Nodhern印跡法W及原位雜交。在基于雜交的方法中，使來自細胞或組織樣品 的RNA逆轉錄成標記的cDNA(例如巧光標記），然后將所述標記的CDNA用于探測例如DNA微陣 列、Nodhern、或被制備用于原位雜交的組織切片。
[0079]在另一個實施方案中，本發明提供了一種利用細胞分離、純化柱或FACS分選，使用 生物標志物TSPAN33/BAAM作為活化B淋己細胞的標志物將活化的B淋己細胞分選或純化的 手段。
[0080] 針對TSPAN33/BAAM的抗體祀向療法治療疾病的用途
[0081 ] 在一些實施方案中，針對TSPAN33/BAAM的抗體祀向療法可W用作用于TSPAN33/ BAAM陽性淋己瘤的治療。舉例來說，從患有套細胞淋己瘤(NHL)、侵襲性非霍奇金淋己瘤W 及含有李-施二氏細胞的霍奇金淋己瘤的患者獲取活檢。將組織切片并且使用與HRP綴合的 抗小鼠 IgGW蘇木精/伊紅染色化&E stain)為背景對TSPAN33進行染色。霍奇金淋己瘤和侵 襲性非霍奇金淋己瘤被認為源自于活化的B淋己細胞(25)，而套細胞淋己瘤被認為源自于 初始的生發中屯、前B淋己細胞（26)，因此代表未活化的B淋己瘤的一種形式。只有霍奇金淋 己瘤和侵襲性非霍奇金淋己瘤的切片是TSPAN33陽性的。因此，TSPAN33/BAAM預期是治療性 單克隆抗體在TSPAN33/BAAM陽性淋己瘤中有效的祀標。
[008引在一些實施方案中，針對TSPAN33/BAAM的抗體祀向療法可W用于治療設及 TSPAN33/BAAM陽性的并且分泌自身抗體的B淋己細胞的自身免疫性疾病。因此，提供了對包 括TSPAN33/BAAM陽性的并且產生自身抗體的自身免疫性疾病的自身免疫性疾病的治療，所 述自身免疫性疾病包括但不限于類風濕性關節炎、銀屑病、舍格倫綜合征W及紅斑狼瘡。
[0083] 在一些實施方案中，針對TSPAN33/BAAM的中和抗體可W用于治療設及病變B淋己 細胞的免疫性疾病。運些實施方案是基于W下發現:TSPAN33/BAAM在小鼠和人類中是超過 97%保守的。四旋蛋白家族在腦、免疫系統中、在腫瘤上W及別處具有多種功能，包括調節 細胞形態、運動、侵襲、融合W及信號轉導（30)。因此，TSPAN33/BAAM可W設及B細胞的信號 轉導、活化、增殖、或呈遞或它們向T細胞的信號轉導。因此，使用中和抗體阻斷TSPAN33/ BAAM信號轉導被考慮用于W有利的方式調節免疫反應W治療設及B細胞失調的免疫性疾 病。
[0084] TSPAN33/BAAM作為篩選工具的用途
[008引在一些實施方案中，TSPAN33/BAAM作為活化的和病變的B淋己細胞的生物標志物 用作診斷測試。運些實施方案是基于W下發現:TSPAN33/BAAM在休止的B細胞中是陰性的， 但在使用抗CD40+比-4活化后在12小時之后轉錄增加到超過40倍。舉例來說，使用0.化g/mL 的抗CD40(G28.5 mAb)和4 ng/mL的IL-4刺激IO6個細胞/毫升的純化的人類B細胞和2E2人 類B細胞系。將細胞溶解并且使用Qiagen RNeasy試劑盒收集RNA。使用50化gW使用QIAGEN-QuantiTect逆轉錄試劑盒來制備具有隨機六聚體的cDNA。使用Roche Lighlxycler 480系 統對細胞溶解產物進行RT-qPCR。使用Iightcycler引物設計程序用正向引物5'- caacatgctcttctgggtga-3'（沈QIDN0:4)和反向引物5'-attagccgagcgtagacacc-3'（SEQ ID N O : 5 )使用U P L引物冉9研制T S P a n n 3 3引物。使用正向引物5'-aacaaaatctctactttgatggaactt-3'（SEQ IDN0:6)和反向弓|物5'一gcaaggcctactgctgagtt-3'（沈Q ID N0:7)^WL引物#60擴增CD20。使用18S和GAPDH表達的平均值將表達歸一化。因 此，由本領域技術人員制備的結合TSPAN33/BAAM的抗體或蛋白質被考慮用作使用測定針對 活化的B細胞或病變的B細胞的篩選工具，所述測定包括但不限于ELISA、流式細胞術或 化ISPOTd-些實施方案還擴展到使用基于PCR的方法，如RT-PCR、RT-qPCR或PCR來檢測作為 篩選工具的TSPAN33W檢測活化的B細胞或病變的B細胞。
[0086] TSPAN33/BAAM作為分選工具W分離或鑒定病變的B淋己細胞的用途
[0087] 在一些實施方案中，TSPAN33/BAAM在細胞分選中用作活化的和病變的B淋己細胞 的生物標志物。這些實施方案是基于本申請中活化的B細胞表達TSPAN33/BAAM的實施例。因 此，結合TSPAN33/BAAM的抗體或蛋白質被考慮用于細胞分選、分離或FACS分析中W純化或 標記細胞。
[0088] W下參考文獻是上文所提到的，并且W引用的方式并入本文：
[0089] (l)Kaminski，D.A.，Wei，C.，Qian，Y.，民osenberg，A.F.and Sanz，I.,Advances in human B cell phenotypic