一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及植物源農業副產品抑菌劑的制備，具體涉及高粱殼和蕎麥殼混合水提金黃色葡萄球菌抑制劑的制備。
【背景技術】
[0002]抗生素從誕生至今已成為人類與畜禽抵御及殺死病原菌的有力武器。天然抗生素及合成、半合成種類已有上千種，目前廣泛應用畜禽養殖的種類有幾十種，盡管抗生素類藥物因具有防病治病見效快，提高畜禽生產性能，降低養殖成本等優點而被廣泛應用。但是近年來，越來越多的細菌對抗生素產生了耐藥性，且耐藥性不斷增強，致使臨床感染死亡率不斷增高。
[0003]金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，在自然界中，金黃色葡萄球菌可廣泛在空氣、水、土地、塵埃以及動物機體的排泄物中存活。對動物機體而言，金黃色葡萄球菌主要分布在皮膚、口咽、鼻腔和頭發上，是一種重要的人畜共患致病菌。它通過分泌溶血素、腸毒素、殺白細胞素、血聚凝固酶、表皮剝落毒素等多種毒力因子，可以逃過宿主細胞的免疫識別，是奶牛、奶羊乳房炎的常見致病因素，更是污染人畜食物造成食物中毒的“罪魁禍首”。
[0004]甲氧西林是第一代合成青霉素，用于治療金葡菌感染取得良好效果。由于抗生素在臨床上的廣泛使用甚至濫用，臨床很快就分離到對甲氧西林耐藥的金葡菌(MRSA)。一份2007年-2014年的統計數據表明，MRSA感染發病率逐年上升，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌已經成為耐藥菌感染的主要病原菌之一。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌除了對B—內酰胺類抗生素(青霉素類和頭抱菌素及含酶抑制劑的抗生素)產生耐藥外，臨床上分離到的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌同時還對氯霉素、氨基苷類、林可霉素、四環素類和大環內酯類抗生素以及喹諾酮類藥物也具有不同程度的耐藥性，呈現對多種抗生素耐藥的特點。MRSA感染在世界范圍內面臨嚴峻局面，迫切需要開發新的抗金葡菌感染的藥物。因此，尋求安全有效抗生素替代品的抑制劑尤為重要。
[0005]植物抑菌作用是指植物的提取物在體外能抑制防止微生物生長繁殖或者具有殺滅作用，其機理主要是干擾微生物的代謝過程，影響其結構與功能，如干擾細菌細胞壁的合成，影響細胞膜的通透性，阻礙菌體蛋白質的合成和抑制核酸合成等。對于大多數植物來源藥物，它們價格低廉，資源豐富，而且毒副作用小或無，對動物來說不易產生抗藥性，無論是在理論方面還是應用方面，從植物中篩選抑菌藥物均具有非常重要的意義，已成為科學研究領域的熱點，受到國外學者的廣泛重視。
[0006]我國是自然資源大國，植物資源豐富、品種繁多、藥源廣泛，屬純天然有機物。早在建國初期，我國醫藥工作者就開始重視研究藥用植物的抑菌效果，篩選出了一些具有抑菌效果的藥材，但對非藥用植物的抑菌研究還較少。我國也是資源浪費最嚴重的國家，這嚴重不符合可持續發展的基本與要求。為了改善這一現狀，本發明充分利用農作物廢棄資源，變廢為寶，利用生長于我國北方，抗逆性強的蕎麥和高粱的農業副產品蕎麥殼和高粱殼，經過混合煎煮水提法獲得抑菌效果顯著的金黃色葡萄球菌抑制劑。
【發明內容】
[0007]本發明克服現有技術的不足，所要解決的技術問題是提供一種植物源農業副產品抑菌劑。
[0008]為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為:一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，采用高粱殼和蕎麥殼為原料，將洗凈的原料等質量混合后，按照常規的中藥煎煮方法獲得藥液，經滅菌后，即得到抑菌劑。
[0009]根據試驗檢測，本發明得到的抑菌劑的MBC(最小殺菌濃度)與MIC(最小抑菌濃度)接近，均為0.25g/mL。
[0010]在煎煮過程中，為了提高提取效率，可能需要在煎煮時添加較多的水，或者多次煎煮，因此，得到的提取液一般濃度都會比較低，為了不影響抑菌或者殺菌效果，通常還需要進行濃縮，使得藥液的濃度至少達到0.25g/mL。在不影響藥物活性的情況下，理論上可以濃縮至成固體膏。為了便于儲存以及實驗對比研究，本領域技術人員可以根據實際需要選擇濃縮至何種濃度，如本發明的優選方案為濃縮至MIC的八倍濃度，即2g/mL。
[0011]本發明抑菌劑優選的制備方法，包括以下步驟:將高粱殼和蕎麥殼按質量比1:1混合，混合物與水按質量體積比120:1000(g:mL)浸泡10-24小時，然后強火加熱至微沸后改用文火，保持20-50min ；將煮制液過濾，收集濾液;濾渣加混合物用水的一半，再次煎煮、過濾；合并兩次濾液為藥液，將藥液濃縮至濃度為0.25-2g/mL;濃縮液經滅菌兩次后，得到水提抑菌劑;滅菌條件為:121°(3，0.110^，高壓蒸汽滅菌2011^11;兩次滅菌間隔2411。
[0012]上述制備方法中，混合物與水的混合比例為優化的配比，水太少不能將有效成分充分提取，造成原材料浪費;水太多則濃縮工序費時。但是水的添加量只要能夠保證正常的藥物提取，就不會影響本發明所述的抑菌劑的效果。多次煎煮的目的也是為了充分提取出有效成分，因此是否進行二次煎煮濾渣或者多次煎煮濾渣都是本領域技術人員可以常規選擇的。滅菌的方式和具體條件也同樣不是影響本發明抑菌劑效果的主要因素。
[0013]影響本發明抑菌劑效果的主要因素是藥液的濃度。藥液的濃度高于MBC或者MIC就可以。本發明在優選方案中將藥液濃度限定為0.25-2g/mL，是為了研究和使用方便。實際將藥液濃縮至更高濃度或者直接做成活性干粉，也是可以的。
[0014]本發明的抑菌劑主要用途是用作金黃色葡萄球菌的抑菌劑或者殺菌劑。
[0015]試驗組設置:
組別I是蕎麥殼單獨水提液；
組別2是高粱殼單獨水提液；
組別3是蕎麥殼與高粱殼單獨水提液的混合物(蕎麥殼單獨水提液與高粱殼單獨水提液濃縮為各15mL，比例為1:1);
組別4是蕎麥殼與高粱殼混合水提液(本發明所述的抑菌劑)。
[0016]單獨水提液的制備方法按照如下步驟:取蕎麥殼或者高粱殼60g，裝于100ml燒杯中，加入蒸餾水100mU浸泡過夜；強火加熱至微沸后改用文火，保持30min;使用六層紗布過濾，收集濾液;殘渣加水500mL，按上法煎煮過濾，合并兩次濾液;使用旋轉蒸發器對濾液進行蒸發，濃縮至藥液為30mL，即藥液濃度為2g /11^，在121°(3，0.11?&，高壓蒸汽滅菌20min，24h后再滅菌一次，于4°C冰箱中保存，備用。
[0017]混合水提液的制備方法按照如下步驟:取蕎麥殼、高粱殼各60g，裝于1000ml燒杯中，加入蒸餾水100mL，浸泡過夜；強火加熱至微沸后改用文火，保持30min;將煮制液使用六層紗布過濾，收集濾液;濾渣加水500mL，同上法再次煎煮過濾，合并兩次濾液;使用旋轉蒸發器對合并濾液進行蒸發，濃縮至30mL，即藥液濃度為2g/mL，在121°C，0.1MPa，高壓蒸汽滅菌20min，24h后再滅菌一次，于4°C冰箱中保存，備用。
[0018]1、高粱殼和蕎麥殼混合水提液對金黃色葡萄球菌的MIC(最小抑菌濃度)的測定本發明采用平皿打孔法測定和二倍稀釋法，用無菌水依次稀釋不同組別提取液1/2、1/
4、I /8、I /16倍，即最終藥液濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.125g/mL。
[0019]在無菌條件下，用移液槍吸取供試金黃色葡萄球菌液80yL于營養瓊脂培養基上，并用涂布器均勻涂布，待菌液吸收5分鐘，加入50yL不同稀釋濃度的提取物，靜置2h后于37°C恒溫箱中倒置培養24h，觀察結果并測定抑菌圈直徑，結果顯示高粱殼和蕎麥殼混合水提液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC是0.25g/mL，抑菌圈的直徑為2.65cm。
[0020]2、高粱殼和蕎麥殼混合水提液對金黃色葡萄球菌的MBC(最小殺菌濃度)的測定分別取2、1、0.5、0.25、0.1258/1^濃度的高粱殼和蕎麥殼混合水提液10(^1^并加入100
yL過夜培養至對數增長期的金黃色葡萄球菌菌液，菌液用酶標儀測0D600值=0.4 (相當于5X 108CFU/mL)，吹打、混合均勻菌液和混合提取物后靜置于37°C溫箱培養24h后，將每孔的細菌吹打均勻后導入營養瓊脂平板，無菌株生長的最低濃度為菌株的MBC值，試驗需要重復3次，取其平均值，以不加藥物的菌懸液作為陽性對照，本發明中高粱殼和蕎麥殼混合水提液對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度測定為0.25g/mL0[0021 ] 3、高粱殼和蕎麥殼混合水提液對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響
取0.125g/mL濃度的高粱殼和蕎麥殼混合水提液100yL，并加入900yL營養瓊脂液體培養基，以無菌水代替混合水提液加入900yL營養瓊脂液體培養基作為空白對照。培養5h后，每隔0.5h測菌液吸光度0D600ο以時間為橫坐標，菌液吸光度為縱坐標，描繪細菌的生長曲線。與空白對照相比，在高粱殼和蕎麥殼混合水提液作用下，金黃色葡萄球菌進入對數生長期的時間點和對數生長期延續時間未有明顯改變，但生長受到明顯抑制，無法達到生長高峰。
[0022]現有技術中對高粱醇提物的抑菌活性、假高粱揮發油的抑菌活性和蕎麥殼水提物的抑菌活性進行了研究。但未有將二者共同研究的報道。根據本發明的技術，將高粱殼和蕎麥殼混合后進行水提，得到的藥液的抑菌活性明顯優于二者的單獨水提液或者單獨水提后的混合液。高粱殼和蕎麥殼混合后進行水提具有協同作用，能夠顯著提高水提液的抑菌或殺菌活性，對金黃色葡萄球菌的抑菌或殺菌效果遠好于二者的單獨水提液或者單獨水提后的混合液。
[0023]對本發明所涉及的藥液的濃度進行解釋如下:由于中藥煎劑的藥物濃度不容易計量，在有效成份不能完全確認的情況下，中藥煎劑的藥液濃度一般以每毫升藥液相當于含有原生藥的重量計量。例如，本發明的抑菌劑制備，高粱殼60g、蕎麥殼60g，加水100mL煎煮、過濾后的藥液濃縮至30mL，則每毫升藥液相當于含有原生藥量高粱殼2g、蕎麥殼2g。若為單獨水提液，同樣的制備條件，每毫升藥液相當于含有原生藥量高粱殼2g或者蕎麥殼2g。該濃度計量方式是本領域的常規方式，簡記為g/mL的濃度單位形式，由于本發明所述的兩種原料質量比為1:1，為了表述方便，將藥液的濃度記為**g/mL的形式，其實際指的是每毫升的藥液中含有相當于兩種原料的生藥量為各**g。
【附圖說明】
[0024]下面結合附圖對本實用新型作進一步說明。
[0025]圖1為高粱殼和蕎麥殼混合水提液對金黃色葡萄球菌的MIC的測定(中央對照為水)。