一種組織工程化的人工下咽瓣膜的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學工程中的組織工程學領域，尤其涉及一種組織工程化的人工下咽瓣膜的制備方法。
【背景技術】
[0002]下咽癌是上消化道和上呼吸道最致命的腫瘤之一，臨床統計5年生存率在25%?40%，目前臨床上采用以手術為主結合放、化療的綜合治療方法。對于早期患者切除病灶后可以直接關閉咽腔，而對于中晚期患者因切除面積大，常需要依靠組織移植重建來改善咽喉部功能。傳統的可移植組織為來自患者自體的游離空腸、結腸、胸大肌皮瓣、前臂皮瓣等，此類移植不僅來源有限、對血管吻合要求高，而且造成了醫源性損傷，容易引起術后并發咽漏、感染等問題。
[0003]隨著組織工程學的興起，使用人工下咽瓣膜應用于咽喉部功能重建成為可能。人工下咽瓣膜由于可經體外培養、瓣膜大小不受限制等優點，可用于彌補傳統修補手術的不足。醫用聚氨酯因其良好的力學強度和彈性，以及良好的生物相容性，被認為是一種較好的生物材料，曾被研究用于體內軟組織瓣膜的替代物。但是這類人工瓣膜在使用后發現其降解速度太慢，或者幾乎不降解，移植到患者的咽喉部后，隨著新生組織的再生此人工瓣膜不能同步降解，反而成為異物存在于下咽部，阻礙新生瓣膜生長的同時，還會產生免疫排斥、炎癥等不良反應。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種力學性能好、降解速度適中、符合人體機能需求的組織工程化的人工下咽瓣膜的制備方法。
[0005]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種組織工程化的人工下咽瓣膜的制備方法，包括以下具體步驟:
(1)、將己二胺溶于正丙醇中得到濃度為0.01?0.10g/ml的己二胺/正丙醇溶液，將絲素蛋白溶于水中得到濃度為I?I Og/L的絲素蛋白水溶液，備用；
(2)、取5?1g聚乙二醇、4.5?1gε-己內酯，以及占兩者總質量0.1?1.0%的乙酰丙酮鐵，置于干燥的三口燒瓶中，在干燥的氮氣保護下，在120?140°C的溫度下反應18?40h，得到聚己內酯一聚乙二醇一聚己內酯三嵌段共聚物，即預聚物；
(3 )、在反應瓶中將4?1g上述預聚物溶于43?105g的I，4-二氧六環中，在干燥氮氣的保護下，在上述反應瓶中加入0.9?2.Sg的六亞甲基二異氰酸酯形成溶液體系，向此溶液體系中加入占預聚物質量0.1?1.0%的乙酰丙酮鐵，升溫至70°C，反應I?3h后停止加熱，待體系的溫度降至室溫，再往此體系中加入含0.13?0.34g三羥甲基丙烷的5毫升I，4_二氧六環溶液，反應5?10h，移出反應瓶，在室溫下成膜，得到可生物降解的交聯型聚己內酯一聚乙二醇一聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜；
(4)、取上述平面膜，用體積分數為75%的醫用酒精浸洗15?30min，室溫晾干，然后將此平面膜浸入步驟(I)準備好的己二胺/正丙醇溶液中，在35°C的溫度下浸泡I?2min，取出后用去離子水浸洗3次，每次5?lOmin，再將平面膜在質量濃度為0.5?2%的戊二醛水溶液中浸泡3?6h，取出后用去離子水浸洗3次，每次5?lOmin，最后將平面膜浸入步驟(I)準備好的絲素蛋白水溶液中，在4°C的溫度下反應12?24h，取出后用去離子水浸洗3次，每次5?10min，37°C下真空烘干，得到表面接枝絲素蛋白的交聯型聚己內酯一聚乙二醇一聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜；
(5)、取離體的下咽組織，用含有青霉素和鏈霉素的無菌PBS混合液沖洗，其中青霉素在PBS混合液中的濃度為1000U/mL，鏈霉素在PBS混合液中的濃度為lmg/mL，然后將下咽組織在體積分數為75%的醫用酒精中浸洗5?10s，取出后用上述PBS混合液沖洗，再將下咽組織浸在100ppm的次氯酸鈉中I?2min，取出后用上述PBS混合液沖洗，然后將下咽組織切成I?3mm3的組織小塊貼附于培養皿中，放置30min后，往培養皿中加入含有胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養基并淹沒下咽組織小塊，其中:胎牛血清在DMEM培養基中的體積分數為10%、青霉素的濃度為100U/mL、鏈霉素的濃度為100mg/L，l天后更換上述DMEM培養基，之后每隔2天更換DMEM培養基，約一周后在下咽組織小塊的周圍長出下咽成纖維細胞，待下咽成纖維細胞長至40?60%時棄去下咽組織塊，繼續培養下咽成纖維細胞至80%，傳代，取傳至3?5代的原代下咽成纖維細胞種植于步驟(4)所制得的絲素蛋白接枝的交聯型聚己內酯一聚乙二醇一聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜上，懸液濃度為5 X 14/毫升，得到組織工程化的人工下咽瓣膜。
[0006]所述的步驟(5)中，離體的下咽組織為人的下咽組織或動物下咽組織。
[0007]所述的動物下咽組織取自豬、狗、羊、兔等哺乳動物。
[0008]與現有技術相比，本發明的優點是本方法所制得的交聯型聚己內酯一聚乙二醇一聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜其力學強度好、彈性好，適合作為軟組織的人工下咽瓣膜的基材，在移植到患者的咽喉部后，由于在平面膜的組成成份中含有親水的聚乙二醇和易發生降解的己內酯而使其降解性能優于醫用聚氨酯，隨著新生瓣膜組織的再生，交聯型聚己內酯一聚乙二醇一聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜逐漸降解；另一方面，在此平面膜表面上接枝絲素蛋白后，此人工下咽瓣膜生物相容性更優，與周圍組織相親性更好，更易融合于體內環境，符合人體的下咽組織機能的需求。
【具體實施方式】
[0009]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0010]實施例一:一種組織工程化的人工下咽瓣膜的制備方法，包括以下具體步驟:
(1)、將己二胺溶于正丙醇中得到濃度為0.03g/ml的己二胺/正丙醇溶液，將絲素蛋白溶于水中得到濃度為2g/L的絲素蛋白水溶液，備用；
(2)、取1g聚乙二醇、5g己內酯，以及占兩者總質量1.0%的乙酰丙酮鐵，置于干燥的三口燒瓶中，在干燥的氮氣保護下，在120°C的溫度下反應20h，得到聚己內酯一聚乙二醇一聚己內酯三嵌段共聚物，即預聚物；
(3)、在反應瓶中將4g上述預聚物溶于45g的I，4_二氧六環中，在干燥氮氣的保護下，在上述反應瓶中加入1.0g的六亞甲基二異氰酸酯形成溶液體系，向此溶液體系中加入占預聚物質量0.2%的乙酰丙酮鐵，升溫至70°C，反應Ih后停止加熱，待體系的溫度降至室溫，再往此體系中加入含0.15g三羥甲基丙烷的5毫升I，4_二氧六環溶液，反應5h，移出反應瓶，在室溫下成膜，得到可生物降解的交聯型聚己內酯一聚乙二醇一聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜；
(4)、取上述平面膜，用體積分數為75%的醫用酒精浸洗30min，室溫晾干，然后將此平面膜浸入步驟(I)準備好的己二胺/正丙醇溶液中，在35°C的溫度下浸泡2min，取出后用去離子水浸洗3次，每次5min，再將平面膜在質量濃度為0.8%的戊二醛水溶液中浸泡6h，取出后用去離子水浸洗3次，每次5min，最后將平面膜浸入步驟(I)準備好的絲素蛋白水溶液中，在4°C的溫度下反應15h，取出后用去離子水浸洗3次，每次5min，37°C下真空烘干，得到表面接枝絲素蛋白的交聯型聚己內酯一聚乙二醇一聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜；
(5)、取離體的人的下咽組織，用含有青霉素和鏈霉素的無菌PBS混合液沖洗，其中青霉素在PBS混合液中的濃度為1000U/mL，鏈霉素在I3BS混合液中的濃度為lmg/mL，然后將下咽組織在體積分數為75%的醫用酒精中浸洗10s，取出后用上述PBS混合液沖洗，再將下咽組織浸在100ppm的次氯酸鈉中2min，取出后用上述PBS混合液沖洗，然后將下咽組織切成Imm3的組織小塊貼附于培養皿中，放置30min后，往培養皿中加入含有胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養基并淹沒下咽組織小塊，其中:胎牛血清在DMEM培養基中的體積分數為10%、青霉素的濃度為100U/mL、鏈霉素的濃度為100mg/L，l天后更換上述DMEM培養基，之后每隔2天更換DMEM培養基，約一周后在下咽組織小塊的周圍長出下咽成纖維細胞，待下咽成纖維細胞長至60%時棄去下咽組織塊，繼續培養下咽成纖維細胞至80%，傳代，取傳至3代的原代下咽成纖維細胞種植于步驟(4)所制得的絲素蛋白接枝的交聯型聚己內酯一聚乙二醇一聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜上，懸液濃度為5 X 14/毫升，得到組織工程化的人工下咽瓣膜。
[0011]實施例二: 一種組織工程化的人工下咽瓣膜的制備方法，包括以下具體步驟:
(1)、將己二胺溶于正丙醇中得到濃度為0.1g/ml的己二胺/正丙醇溶液，將絲素蛋白溶于水中得到濃度為8g/L的絲素蛋白水溶液，備用；
(2)、取5g聚乙二醇、9g己內酯，以及占兩者總質量0.5%的乙酰丙酮鐵，置于干燥的三口燒瓶中，在干燥的氮氣保護下，在130°C的溫度下反應24h，得到聚己內酯一聚乙二醇一聚己內酯三嵌段共聚物，即預聚物；
(3)、在反應瓶中將6g上述預聚物溶于70g的I，4_二氧六環中，在干燥氮氣的保護下，在上述反應瓶中加入2g的六亞甲基二異氰酸酯形成溶液體系，向此溶液體系中加入占預聚物質量0.6%的乙酰丙酮鐵，升溫至70°C，反應2h后停止加熱，待體系的溫度降至室溫，再往此體系中加入含0.22g三羥甲基丙烷的5毫升I，4_二氧六環溶液，反應8h，移出反應瓶，在室溫下成膜，得到可生物降解的交聯型聚己內酯一聚乙二醇一聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜；
(4)、取上述平面膜，用體積分數為75%的醫用酒精浸洗15min，室溫晾干，然后將此平面膜浸入步驟(I)準備好的己二胺/正丙醇溶液中，在35°C的溫度下浸泡lmin，取出后用去離子水浸洗3次，每次7min，再將平面膜在質量濃度為2%的戊二醛水溶液中浸泡4h，取出后用去離子水浸洗3次，每次8min，最后將平面膜浸入步驟(I)準備好的絲素蛋白水溶液中，在4°C的溫度下反應24h，取出后用去離子水浸洗3次，每次10min，37°C下真空烘干，得到表面接枝絲素蛋白的交聯型聚己內酯一聚乙二醇一聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜；
(5)、取離體的人的下咽組織，用含有青霉素和鏈霉素的無菌PBS混合液沖洗，其中青霉素在PBS混合液中的濃度為1000U/mL，鏈霉素在I3BS混合液中的濃度為lmg/mL，然后將下咽組織在體積分數為75%的醫用酒精中浸洗7s，取出后用上述PBS混合液沖洗，再將下咽組織浸在100ppm的次氯酸鈉中Imin，取出后用上述I3BS混合液沖洗，然后將下咽組織切成3mm3的組織小塊貼附于培養皿中，放置30min后，往培養皿中加入含有胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養基并淹沒下咽組織小塊，其中:胎牛血清在DMEM培養基中的體積分數為10%、青霉