用于治療癌癥的組合療法

用于治療癌癥的組合療法
【專利摘要】本發明涉及包含人類組蛋白甲基轉移酶EZH2的抑制劑和一種或多種其它治療藥劑、尤其是抗癌藥劑例如強的松的組合物，并且涉及用于向對其有需要的受試者進行給藥以治療癌癥的組合療法方法。
【專利說明】用于治療癌癥的組合療法 相關申請 本申請要求于2013年12月6日提交的美國臨時申請號61/913,063、2014年1月31日提交 的美國臨時申請號61/934,388、和2014年5月13日提交的美國臨時申請號61/922,881的優 先權權益，將其各自的內容通過引用以其全文結合在此。 技術領域 本發明涉及包括以下各項的組合物:人類組蛋白甲基轉移酶EZH2的抑制劑、催化組蛋 白H3(H3-K27)上賴氨酸27的一至三甲基化的PRC2復合體的催化亞基、以及一種或多種其他 的治療藥劑，特別是抗癌藥劑，并且涉及用于治療癌癥的組合療法方法。 【背景技術】 組合療法治療癌癥已變得更加常見，部分原因是由于通過多途徑攻擊疾病的已知優 勢。雖然在過去的幾十年中已經確定了許多有效的組合療法治療，鑒于每年由癌癥造成的 持續大量的死亡，仍然對確定用于抗癌治療的有效治療方案存在持續的需要。
【發明內容】
本發明至少部分是基于這樣的發現:EZH2抑制劑如化合物44(又名EPZ-6438、E7438)
組合各種藥劑，包括目前的標準治療，不管EZH2突變狀態，在某些癌癥的治療中是非常 有效的。在某一個實施例中，該癌癥是淋巴瘤。在某一個實施例中，該癌癥是生發中心B細胞 (GCB)起源的非霍奇金淋巴瘤(NHL)或彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。在某一個實施例中， 該淋巴瘤是EZH2突變淋巴瘤。在某一個實施例中，該淋巴瘤是EZH2非突變或EZH2野生型淋 巴瘤。本發明也是基于這樣的發現：EZH2抑制劑（如化合物44)和糖皮質激素受體激動劑 (GRags)(如強的松、潑尼松龍或地塞米松)配合使用大大地提高癌癥治療效果。化合物44和 潑尼松龍的組合延伸了對EZH2抑制敏感的細胞的范圍，從僅僅帶有突變的細胞延伸至所有 GCB NHL細胞。 在一個方面，本發明涉及一種在有需要的患者中治療癌癥的方法，該方法包括給予治 療有效量的EZH2抑制劑和治療有效量的標準治療藥劑。 在另一方面，本發明涉及一種在有需要的患者中治療癌癥的方法，該方法包括給予治 療有效量的包括EZH2抑制劑和標準治療藥劑的組合。 本發明的另一方面涉及一種在有需要的患者中治療癌癥的方法，該方法包括給予治療 有效量的包括EZH2抑制劑和標準治療藥劑的組合物。 在一些實施例中，EZH2突變淋巴瘤是Y646、A682、或A692突變。 在一些實施例中，標準治療藥劑是選自下組的一種或多種化合物，該組由以下各項組 成:R-CHOP組分、BCL抑制劑和BCR抑制劑。 在一些實施例中，R-CHOP是CHOP、潑尼松龍或地塞米松的GRag組分。 在一些實施例中，R-CH0P是糖皮質激素受體激動劑。在某些實施例中，糖皮質激素受體 激動劑是潑尼松龍或地塞米松。 在一些實施例中，阿霉素從R-CH0P中排除。 在一些實施例中，BCL抑制劑是納威托克斯(navitoclax)、奧巴克拉或ABT-19。 在一些實施例中，BCR抑制劑是利妥昔單抗、AKT抑制劑MK-2206、艾代拉里斯 (idelalisib)、曲美替尼（trametinib)、塔瑪塔尼伯（tamatanib)、依維莫司（everolimus)、 或依魯替尼（ibrutinib)。 在一些實施例中，BCR抑制劑是PI3K/Akt/mT0R信號級聯抑制劑。 在一些實施例中，BCR抑制劑是利妥昔單抗、MK-2206、艾代拉里斯、曲美替尼、塔瑪塔尼 伯、依維莫司、VELCADE、或依魯替尼。 在一些實施例中，EZH2抑制劑和標準治療藥劑同時或依次給予。在其它實施例中，EZH2 抑制劑在給予標準治療藥劑之前給予。 在一些實施例中，至少一個基因在患者中上調。在某些實施例中，被上調的基因是選自 由瑟斯崔因（Sestrin)、TNF、和GILZ組成的組。在其它實施例中，被上調的基因是糖皮質激 素靶基因。 在一些實施例中，基因的上調被用于決定或調整EZH2抑制劑和標準治療藥劑的治療有 效量。 在另一方面，本發明涉及一種篩選接受治療的患者的方法，其中該患者是基于選自由 瑟斯崔因、TNF、和GILZ組成的組的一個或多個基因的表達譜來篩選的。 在一個方面，本發明涉及一種在有需要的患者中治療癌癥的方法，該方法包括給予治 療有效量的EZH2抑制劑和治療有效量的標準治療藥劑，其中所述患者具有上調的瑟斯崔 因、TNF、和GILZ表達。 在一些實施例中，所述癌癥EZH2抑制劑抗性或難治性癌癥。 在一些實施例中，所述癌癥的特征在于在H3K27上增加的三甲基化。 本發明的一個方面涉及EZH2抑制劑和GRag的組合逆轉在EZH2抑制劑抗性或難治性突 變的細胞，包括攜帶EZH2突變的細胞的不敏感性。 在某些實施例中，EZH2抑制劑是化合物44或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物和一種或 多種其它治療藥劑。 本發明的其他特征和優點從以下詳細說明和權利要求書將是清楚的。 【附圖說明】 圖1A-1F是一系列Fa-CI曲線圖，這些曲線圖顯示了CHOP組分和化合物44(Cpd 44)在突 變體EZH2生發中心B細胞淋巴瘤細胞系中的組合益處。化合物44和阿霉素在WSU-DLCL2細胞 中協同作用（圖1A)，并且在SU-DHL-10細胞中產生累加效應（圖1D)。使用馬磷酰胺在WSU-DLCL2細胞（圖1C)和SU-DHL-10細胞中（圖1F)觀察到組合益處。使用長春新堿在兩個 EZH2Y646突變細胞系中：WSU-DLCL2細胞（圖1B)和SU-DHL-10細胞中（圖1E)也觀察到組合益 處。在WSU-DLCL2中，阿霉素的劑量范圍是0.16-20nM，長春新堿是0.04-5nM，馬磷酰胺是 0.156-10福，并且化合物44是15-1000碰。在31]-0見-10細胞中，阿霉素的劑量范圍是0.5-60nM，長春新堿是0.016-2nM，馬磷酰胺是0.156-10yM，并且化合物44是1.56-100nM。根據預 處理模型A處理細胞，并用該Calcusyn軟件進行數據分析。 圖2A-2D是一系列曲線圖，這些曲線圖顯示了糖皮質激素受體激動劑增強了 EZH2突變 體淋巴瘤系中化合物44(Cpd 44)的效力。當與糖皮質激素受體激動劑組合，化合物44的效 力顯著地增加了。根據預處理模型A添加潑尼松龍（圖2A、2C)或地塞米松（圖2B、2D)在2個 EZH2Y646F突變體DLBCL系中產生在化合物44的IC 5Q的劑量依賴性轉變。在兩種細胞系中，潑 尼松龍的劑量范圍是15nM-1 OOOnM，且地塞米松的劑量范圍是1.5nM-l OOnM。化合物44的劑 量范圍在WSU-DLCL2細胞中是15-1000nM，且在SU-DHL-10細胞中是1.5-100nM。 圖3A-3D是一系列劑量響應曲線圖，這些曲線圖顯示了化合物44(Cpd 44)與潑尼松龍 或地塞米松的組合分別在WSU-DLCL2EZH2突變體（圖3A、3B)和D0HH2EZH2野生型（圖3C、3D) GCB淋巴瘤細胞系中的益處。化合物44的劑量范圍是15.6-1000nM，潑尼松龍的劑量范圍是 7.8-1000nM，地塞米松的劑量范圍是0.8-100nM。（圖3A和3B)。在EZH2突變體WSU-DLCL2細胞 中使用潑尼松龍或地塞米松化合物44的效力增加了（圖3C和3D)。化合物44在D0HH2EZH2野 生型細胞中作為單一藥劑顯示沒有抗增生作用，因此測定了潑尼松龍或地塞米松的效力變 化。在D0HH2細胞中加入化合物44使潑尼松龍或地塞米松的效力增加了。 圖4是一個匯總表，該表顯示化合物44(Cpd 44)/糖皮質激素受體激動劑組合克服了抵 抗EZH2抑制劑的細胞系中的EZH2抑制劑(EZH2i)不敏感性。總的來說，潑尼松和化合物44的 組合導致在所有測試的GCB細胞系中（不僅僅是EZH2i敏感細胞系）的敏感性更高。除了RL細 胞，其中藥劑加入的順序是至關重要的，因為預溫育潑尼松龍，接著加入化合物44是有無效 的。 圖5A和5B是兩個曲線圖，該圖顯示在EZH2突變體淋巴瘤細胞系中使用化合物44(Cpd 44)和其它靶向治療的組合而觀察到非常強的協同作用。當化合物44與BCL2抑制劑納威托 克斯（圖5A)以及與mTOR抑制劑依維莫司（圖5B)組合時觀察到非常強的協同作用。納威托克 斯的劑量范圍是〇. 16-1 OyM，依維莫司是0.04-5nM，且化合物44是31 -2000nM。在預處理模型 A中產生這些數據，且用Calcusyn軟件分析數據。 圖6是一個從各種藥劑和/或藥劑療法與化合物44(Cpd 44)組合的結果的匯總表。在 EZH2突變體淋巴瘤系中測試的所有藥劑與化合物44實現了組合益處。糖皮質激素受體激動 劑在EZH2WT和突變體GCB淋巴瘤系中顯示了組合益處。 圖7A-7C是一系列曲線圖，這些曲線圖顯示化合物44 (Cpd 44) -CHOP組合在幾個EZH2突 變體淋巴瘤異種移植模型中顯示出相比單一藥劑增強的抗腫瘤活性。如在這些方法中指定 的，使用化合物44、CHOP、或其組合處理WSU-DLCL2 (EZH2Y646F)異種移植物28天（圖7A)。繪 制了平均腫瘤體積+/-SEM圖。150mg/kg TID和225mg/kg BID劑量的化合物44在腫瘤生長抑 制中比單獨運載體在統計學上更有意義(*P值〈0.05)。相比單獨使用任何單一的藥劑，使用 225mg/kg BID的化合物44加上CHOP處理導致更大的腫瘤消退（相對于運載體，林葉值〈 0.001)。通過重復測量AN0VA計算統計。如在這些方法中指定的，使用化合物44、CH0P、或其 組合處理SU-DHL6(EZH2Y646N)異種移植物28天（圖7B)。在頂部圖中繪制了平均腫瘤體積 +/-SEM圖。在28天的處理期中，CHOP或單一藥劑化合物44單獨對腫瘤生長沒有效果，但是使 用225mg/kg BID化合物44加上CHOP處理導致腫瘤消退，同時服藥停止32天后還保持腫瘤生 長延遲(*P值〈0.0001)。至60天的存活曲線(底部圖）顯示使用化合物44與CHOP的組合治療 動物出現的顯著的腫瘤生長延遲(**P值〈0.05)。使用雙尾t檢驗進行統計。如在這些方法中 指定的，使用化合物44、C0P(沒有阿霉素成分的S0C)、或其組合處理SUDHL-10(EZH2Y646F) 異種移植物28天（圖7C)。在頂部圖中繪制了平均腫瘤體積+/-SEM圖。在中部圖繪制了在腫 瘤生長延遲研究中直至60天的百分比存活圖（注意：500mg/kg和250mg/kg+C0P存活曲線重 疊）。在底部圖中比較了平均腫瘤重量，顯示出組之間腫瘤重量顯著的不同（*P值<〇.〇5，**p 值〈0?01，****p值〈0?0001)。 圖8A-8C是圖，這些圖顯示了當使用化合物44、潑尼松龍、化合物44和潑尼松龍的組合、 或DMS0處理各種細胞系時，糖皮質激素靶向基因瑟斯崔因1(SESN1，圖8A)、TNF(圖8B)和 GILZ(圖8C)的表達水平的變化。如圖8A-8C中顯示，相比化合物44或潑尼松龍單獨使用，共 處理后觀察到瑟斯崔因1、TNF、和GILZ的表達水平增加了。 圖9A-9D是圖，該圖顯示整體的H3K27乙酰化和三甲基化不受潑尼松龍或組合治療的影 響。使用增加劑量的潑尼松龍、化合物44(Cpd 44)、或組合化合物44與恒定劑量的潑尼松龍 處理細胞4天。酸萃取的組蛋白通過ELISA對H3K27Me3水平進行分析（圖9A)(單獨的潑尼松 龍，左側圖；化合物44/潑尼松龍的組合，右側圖，其IC 5Q值作為每個圖的插圖）。對于潑尼松 龍的治療，因為使用該化合物沒有觀察到劑量依賴性變化，H3K27Me3數值被表示為柱狀圖。 WSU-DLCL2(圖9B)、0CI-LY19(圖9C)或RL細胞（圖9D)使用增加劑量的潑尼松龍、化合物44、 或組合化合物44與恒定劑量的潑尼松龍處理4天。酸萃取的組蛋白通過蛋白質印跡對H3K27 乙酰化水平進行分析。 圖10是蛋白質印跡，該印跡顯示使用化合物44或潑尼松龍單一藥劑治療對SMARCB1蛋 白質水平沒有影響。 圖11A和11D是Fa-CI曲線圖，該圖顯示化合物44和依維莫司的組合益處。圖11B和11E是 圖，該圖顯示使用化合物44、依維莫司、化合物44和依維莫司的組合、或DMS0處理的WSU-DLCL2和SU-DHL-5細胞的細胞凋亡。圖11C和11F是曲線圖，該圖顯示相比化合物44單獨使 用，在WSU-DLCL2和SU-DHL-5細胞中的共處理之后所觀察到的細胞周期G1期的變化。在WSU-DLCL2和SU-DHL-5細胞中觀察到化合物44和依維莫司組合的強的協同效應(圖11A、11D)。 圖12A和12D是Fa-CI曲線圖，該圖顯示化合物44和依魯替尼的組合益處。圖12B和12E是 圖，該圖顯示使用化合物44、依魯替尼、化合物44和依維莫司的組合、或DMS0處理的WSU-DLCL2和SU-DHL-5細胞的細胞凋亡。圖12C和12F是曲線圖，該圖顯示相比化合物44單獨使 用，在WSU-DLCL2和SU-DHL-5細胞中的共處理之后所觀察到的細胞周期G1期的變化。在WSU-DLCL2和SU-DHL-5細胞中觀察到化合物44和依魯替尼組合的強的協同效應(圖12A、12D)。 圖13A、13D、和13G是Fa-CI曲線圖，該圖顯示化合物44與MK-2206在WSU-DLCL2、SU-DHL-5和0CI-LY19細胞中的組合益處。圖13B、13E、和13H是圖，該圖顯示使用化合物44、MK-2206、 化合物44和MK-2206的組合、或DMSO處理的WSU-DLCL2、SU-DHL-5和0CI-LY19細胞的細胞凋 亡。圖13C、13F和131是曲線圖，該圖顯示相比化合物44單獨使用，在三種細胞系中的共處理 之后所觀察到的細胞周期G1期的變化。在WSU-DLCL2、SU-DHL-5和0CI-LY19細胞中觀察到化 合物44和MK-2206組合的強的協同效應(圖13A、13D和13G)。 圖14A-14C是柱狀圖，該圖顯示當使用化合物44、依魯替尼、MK-2206、化合物44和依魯 替尼的組合或化合物44和MK-2206的組合處理WSU-DLCL2和SU-DHL-5細胞時EGRUF0S、 TCL1、AICDA、和GJA1基因表達的變化。相比使用單一藥劑治療，使用化合物44與第二藥劑的 組合觀察到EGR1(40倍）與F0S(4倍）下調，以及AICDA(3倍）、TCL1A(5倍）與GJA1(3倍)上調 (圖 14A-14C)。 圖15是揭示彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)生物學中的信號通路以及該信號通路內各 種化學治療藥劑靶標的圖表。 圖16A和16D是曲線圖，該圖顯示使用化合物44、依維莫司、化合物44和依維莫司組合、 以及DMS0治療WSU-DLCL2和SU-DHL-5細胞后觀察到的細胞周期G1期的變化。圖16B和16E是 曲線圖，該圖顯示使用化合物44、依維莫司、化合物44和依維莫司組合、以及DMS0治療WSU-DLCL2和SU-DHL-5細胞后觀察到的細胞周期S期的變化。圖16C和16F是曲線圖，該圖顯示使 用化合物44、依維莫司、化合物44和依維莫司組合、以及DMS0治療WSU-DLCL2和SU-DHL-5細 胞后觀察到的細胞周期G2/M期的變化。對SU-DHL-5細胞組合治療48小時后分別觀察到細胞 周期的G1、S、G2/M期中細胞的協同減少（圖16D-16F)。當使用單一藥劑或以組合方式治療 WSU-DLCL2細胞時，沒有觀察到細胞周期G1亞期方面的變化（圖16A)。當以組合方式治療 WSU-DLCL2細胞時，分別觀察到細胞周期的S期和G2/M期中細胞的協同時間依賴性減少（圖 16B、16C)。 圖17A和17D是曲線圖，該圖顯示使用化合物44、依魯替尼、化合物44和依魯替尼組合、 以及DMS0治療WSU-DLCL2和SU-DHL-5細胞后觀察到的細胞周期G1期的變化。圖17B和17E是 曲線圖，該圖顯示使用化合物44、依魯替尼、化合物44和依魯替尼組合、以及DMS0治療WSU-DLCL2和SU-DHL-5細胞后觀察到的細胞周期S期的變化。圖17C和17F是曲線圖，該圖顯示使 用化合物44、依魯替尼、化合物44和依魯替尼組合、以及DMS0治療WSU-DLCL2和SU-DHL-5細 胞后觀察到的細胞周期G2/M期的變化。圖17A-17F顯示相對于化合物44或依魯替尼作為單 一藥劑，對WSU-DLCL2細胞和SU-DHL-5細胞組合治療24小時后分別觀察到細胞周期的G1、S、 G2/M期中細胞協同減少。 圖18A、18D和18G是曲線圖，該圖顯示使用化合物44、MK-2206、化合物44和MK-2206組 合、以及DMS0治療WSU-DLCL2、SU-DHL-5和0CI-LY19細胞后觀察到的細胞周期G1期的變化。 圖18B、18E和18H是曲線圖，該圖顯示使用化合物44、MK-2206、化合物44和MK-2206組合、以 及DMS0治療WSU-DLCL2、SU-DHL-5和0CI-LY19細胞后觀察到的細胞周期S期的變化。圖18C、 18F和181是曲線圖，該圖顯示使用化合物44、MK-2206、化合物44和MK-2206組合、以及DMS0 治療WSU-DLCL2、SU-DHL-5和0CI-LY19細胞后觀察到的細胞周期G2/M期的變化。圖18A-18I 顯示相對于化合物44或MK-2206作為單一藥劑，對WSU-DLCL2細胞和SU-DHL-5細胞組合治療 后分別觀察到細胞周期的G1、S、G2/M期中細胞的協同減少。 圖19是顯示歸一化到DMS0對照的糖皮質激素受體表達水平的變化的柱狀圖，這些表達 水平的變化是針對使用化合物44、潑尼松龍、化合物44和潑尼松龍組合、或DMS0治療的EZH2 野生型（OCI-LY19，D0HH2)、EZH2Y646敏感性(WSU-DLCL2，SUDHL10)、和EZH2Y646抗性（RL， SUDHL)細胞系。使用A ACt方法和ACTB、B2M以及GATOH作為參考基因來定量倍數變化值。如 結果顯示，糖皮質激素受體表達水平在細胞系中通常不受該組合的影響。 圖20A-20C顯示在攜帶異源移植物的小鼠中從CHOP方案中省略一個或所有化療成分的 效果。圖20A是一個曲線圖，該圖顯示使用化合物44、C0P(沒有阿霉素組分的化學治療）、或 它們的組合治療攜帶SUDHL 10 (EZH2Y646F)異源移植物的小鼠28天的腫瘤重量變化。圖20B 是一個曲線圖，該圖顯示使用兩個劑量的化合物44、強的松、或它們的組合治療攜帶 SUDHL10(EZH2Y646F)異源移植物的小鼠28天的腫瘤體積變化。圖20C是一個曲線圖，該圖顯 示使用化合物44、強的松、或它們的組合治療攜帶SUDHL 10 (EZH2Y646F)異源移植物的小鼠 的身體重量變化(參見圖20B)。小鼠服用最大耐受劑量的化合物44或化合物44/C0P的組合 在第60天顯示100%存活，組合組相對其它所有治療組(包括化合物44的最大耐受劑量組） 顯示出最小28天腫瘤重量（圖20A)。單獨服用強的松不會引起任何顯著的抗腫瘤效果（圖 20B)。在前述研究的系中，服用化合物44僅僅產生部分響應，但是同時服用化合物44與強的 松(但不是2個周期的強的松方案），誘導了單獨服用更高劑量的化合物44達到的最大可能 消退。 【具體實施方式】 本發明是至少部分基于這樣的發現:化合物44組合不同藥劑，包括目前的標準治療，不 管EZH2突變狀態，在某些癌癥的治療中是有效的。在某一個實施例中，該癌癥是淋巴瘤。在 某一個實施例中，該癌癥是生發中心B細胞(GCB)起源的非霍奇金淋巴瘤(NHL)或彌漫性大B 細胞淋巴瘤(DLBCL)。在某一個實施例中，該淋巴瘤是EZH2突變淋巴瘤。在某一個實施例中， 該淋巴瘤是EZH2非突變或EZH2野生型淋巴瘤。 在本發明的某些方面，EZH2抑制劑是具有以下化學式的化合物44 (也被稱為EPZ-6438、 E7438)：
或其醫藥上可接受的鹽。 本發明是基于這樣的發現:EZH2組蛋白甲基轉移酶抑制劑和其它抗癌藥劑可以組合用 于治療某些腫瘤，且具有比那些通過單獨使用EZH2組蛋白甲基轉移酶抑制劑和抗癌藥劑治 療腫瘤取得更優的結果。相應地，本發明提供包含EZH2組蛋白甲基轉移酶抑制劑和一種或 多種其它治療藥劑的組合物，以及它們的使用來治療疾病(例如癌癥）的方法，其中該過程 可以受調整組蛋白或其他蛋白質的甲基化狀態的影響。在某一實施例中，本發明的特征在 于一種包含化合物44和強的松的組合物。本發明也包括組合療法的方法，該方法包括EZH2 組蛋白甲基轉移酶抑制劑和一種或多種其它治療藥劑，例如化合物44和強的松，用于治療 癌癥，例如濾泡性淋巴瘤(FL)和彌漫性細胞大B細胞淋巴瘤(DCLBL)。具體而言，本發明的方 法對于治療或預防癌癥或抑制癌細胞增生是有用的。 本發明的一個方面涉及通過給予表達突變體EZH2的受試者治療上有效量的EZH2抑制 劑和一種或多種其它治療藥劑來治療或緩解受試者的癌癥癥狀或癌癥前期狀況的方法。本 發明的突變體EZH2涉及突變體EZH2多肽或編碼突變體EZH2多肽的核酸序列。在某些實施例 中突變體EZH2在它的底物口袋結構域中包括一個或多個突變。 本發明的另一個方面涉及通過給予表達突變體EZH2或野生型EZH2的受試者治療上有 效量的EZH2抑制劑和一種或多種其它治療藥劑來治療或緩解受試者的癌癥癥狀或癌癥前 期狀況的方法。本發明的突變體EZH2涉及突變體EZH2多肽或編碼突變體EZH2多肽的核酸序 列。在某些實施例中突變體EZH2在它的底物口袋結構域中包括一個或多個突變。 在另一個方面，本發明涉及通過給予表達突變體EZH2或野生型EZH2的受試者治療上有 效量的EZH2抑制劑（例如化合物44)和一種或多種糖皮質激素受體激動劑(GRags)(例如強 的松、潑尼松龍、或地塞米松)來治療或緩解受試者的癌癥癥狀或癌癥前期狀況的方法。本 發明的突變體EZH2涉及突變體EZH2多肽或編碼突變體EZH2多肽的核酸序列。在某些實施例 中突變體EZH2在它的底物口袋結構域中包括一個或多個突變。 人類EZH2核酸和多肽已經在先前描述。參見，例如，陳（Chen)等人（1996)《基因組學》 (Genomics) 38:30-7 [746氨基酸];Swiss-Prot登錄號Q15910 [746 氨基酸];GenBank 登錄號 NM_004456和NP_004447(同種型a[751 氨基酸]);以及GenBank登錄號NM_152998和NP_ 694543(同種型b[707氨基酸])，其每一個以其全文通過引用在此結合。 出于本申請的目的，人類EZH2的氨基酸殘基Y641應被理解為指的是在Swiss-Prot登錄 號Q15910中是或對應于Y641的酪氨酸殘基。 還出于本申請的目的，人類EZH2的Y641突變體，和相等地，EZH2的Y641突變體應被理解 為是指人類EZH2中對應于野生型人類EZH2的Y641的氨基酸殘基被除酪氨酸外的氨基酸殘 基取代。 在某些實施例中，R-CH0P是CHOP、潑尼松龍或地塞米松的GRag組分。在某些實施例中，B 細胞受體(BCR)信號通路抑制劑是利妥昔單抗、AKT抑制劑MK-2206、艾代拉里斯、曲美替尼、 塔瑪塔尼伯、依維莫司、或依魯替尼。 本發明是部分基于這樣的發現:PI3K-AKT-mT0R BCR信號通路的抑制劑，例如艾代拉里 斯、MK-2206、和依維莫司當與化合物44組合時在WSU-DLCL2和SU-DHL-10細胞系中誘導非常 強的協同作用。本發明還部分基于這樣的發現:化合物44和B細胞受體通路的抑制劑(例如 依魯替尼和塔瑪塔尼伯）的組合在兩個突變體細胞系中展現出非常強的協同作用。在某些 實施例中，BCL受體抑制劑是納沃提克斯(navoticlax)或ABT-199。 在一些實施例中，該癌癥是非霍奇金淋巴瘤、或彌漫性大B細胞淋巴瘤、或非霍奇金淋 巴瘤生發中心B細胞。 在一些實施例中，標準治療藥劑是選自由R-CH0P、BCL抑制劑和BCR抑制劑組成的一種 或多種化合物。 在一些實施例中，R-CHOP是CHOP、潑尼松龍或地塞米松的GRag組分。 在一些實施例中，BCR抑制劑是利妥昔單抗、AKT抑制劑MK-2206、艾代拉里斯、曲美替尼 (trametinib)、塔瑪塔尼伯、依維莫司（everolimus)、或依魯替尼（ibrutinib)。 在一些實施例中，該癌癥是EZH2突變體癌癥。 在一些實施例中，所述癌癥EZH2抑制劑抗性或難治性癌癥。 在一個實施例中，EZH2的Y641突變體的氨基酸序列不同于野生型人類EZH2的氨基酸序 列，不同之處僅僅是相應于野生型人類EZH2的Y641的單個氨基酸殘基被除酪氨酸外的氨基 酸殘基取代。 在一個實施例中，EZH2的Y641突變體的氨基酸序列不同于野生型人類EZH2的氨基酸序 列，不同之處僅僅是相應于野生型人類EZH2的Y641的單個氨基酸殘基被苯基丙氨酸(F)取 代。對應于這個實施例的EZH2的Y641突變體此處被稱為Y641F突變體，或等同地，Y641F。 在一個實施例中，EZH2的Y641突變體的氨基酸序列不同于野生型人類EZH2的氨基酸序 列，不同之處僅僅是相應于野生型人類EZH2的Y641的單個氨基酸殘基被組氨酸(H)取代。對 應于這個實施例的EZH2的Y641突變體此處被稱為Y641H突變體，或等同地，Y641H。 在一個實施例中，EZH2的Y641突變體的氨基酸序列不同于野生型人類EZH2的氨基酸序 列，不同之處僅僅是相應于野生型人類EZH2的Y641的單個氨基酸殘基被天冬酰胺(N)取代。 對應于這個實施例的EZH2的Y641突變體此處被稱為Y641N突變體，或等同地，Y641N。 在一個實施例中，EZH2的Y641突變體的氨基酸序列不同于野生型人類EZH2的氨基酸序 列，不同之處僅僅是相應于野生型人類EZH2的Y641的單個氨基酸殘基被絲氨酸(S)取代。對 應于這個實施例的EZH2的Y641突變體此處被稱為Y641S突變體，或等同地，Y641S。 在一個實施例中，EZH2的Y641突變體的氨基酸序列不同于野生型人類EZH2的氨基酸序 列，不同之處僅僅是相應于野生型人類EZH2的Y641的單個氨基酸殘基被半胱氨酸(C)取代。 對應于這個實施例的EZH2的Y641突變體此處被稱為Y641C突變體，或等同地，Y641C。 在一個實施例中，EZH2的A677突變體的氨基酸序列不同于野生型人類EZH2的氨基酸序 列，不同之處僅僅是相應于野生型人類EZH2的A677的單個氨基酸殘基被非丙氨酸的氨基 酸，優選是甘氨酸(G)取代。對應于這個實施例的EZH2的A677突變體此處被稱為A677突變 體，且優選是A677G突變體，或等同地，A677G。A677也被稱為A682。 在一個實施例中，EZH2的A687突變體的氨基酸序列不同于野生型人類EZH2的氨基酸序 列，不同之處僅僅是相應于野生型人類EZH2的A687的單個氨基酸殘基被非丙氨酸的氨基 酸，優選是纈氨酸(V)取代。對應于這個實施例的EZH2的A687突變體此處被稱為A687突變 體，且優選是A687V突變體，或等同地，A687V。A687也被稱為A692。 在一個實施例中，EZH2的突變體的氨基酸序列在它的底物口袋結構域中的一個或多個 氨基酸殘基不同于野生型人類EZH2的氨基酸序列。對應于這個實施例的EZH2的突變體此處 被稱為EZH2突變體。 其它示例性的取代氨基酸突變包括在氨基酸位置677、687或641的取代，例如（但不限 于)在氨基酸位置677的野生型殘基丙氨酸(A)由甘氨酸(G)取代(A677G);在氨基酸位置687 的野生型殘基丙氨酸(A)由纈氨酸(V)取代(A687V);在氨基酸位置641的野生型殘基酪氨酸 (Y)由苯基丙氨酸(F)取代(Y641F);在氨基酸位置641的野生型殘基酪氨酸(Y)由組氨酸(H) 取代(Y641H);在氨基酸位置641的野生型殘基酪氨酸(Y)由天冬酰胺(N)取代(Y641N);在氨 基酸位置641的野生型殘基酪氨酸(Y)由絲氨酸（S)取代(Y641S);在氨基酸位置641的野生 型殘基酪氨酸(Y)由半胱氨酸(C)取代(Y641C) J641也被稱為Y646。 對EZH2雜合的細胞預期會顯示一個惡性表型，這是因為通過野生型酶有效的形成H3-K27mel，且隨后通過突變體酶的形式有效的將這個源種類轉換成H3-K27me2，以及特別是， H3-K27me3。 本發明的另一個方面涉及在受試者中抑制H3-K27轉換成三甲基化的H3-K27的方法。該 抑制可能涉及在受試者中抑制非甲基化的H3-K27轉換成一甲基化H3-K27、一甲基化H3-K27 轉換成二甲基化H3-K27、二甲基化H3-K27轉換成三甲基化H3-K27、或其任何組合，包括，例 如一甲基化H3-K27轉換成二甲基化H3-K27和二甲基化H3-K27轉換成三甲基化H3-K27。如本 文所用，非甲基化H3-K27是指組蛋白H3沒有甲基基團共價連接到賴氨酸27的氨基基團。如 本文所用，一甲基化H3-K27是指組蛋白H3有一個甲基基團共價連接到賴氨酸27的氨基基 團。一甲基化H3-K27此處也被稱為H3-K27mel。如本文所用，二甲基化H3-K27是指組蛋白H3 有兩個甲基基團共價連接到賴氨酸27的氨基基團。二甲基化H3-K27此處也被稱為H3-K27me2。如本文所用，三甲基化H3-K27是指組蛋白H3有三個甲基基團共價連接到賴氨酸27 的氨基基團。三甲基化H3-K27此處也被稱為H3-K27me3。 本發明的一種組合物包括化合物44和一種或多種治療藥劑。本發明的化合物和組合適 合于與一種或多種其它治療藥劑或治療方法作為組合療法的一部分給予，適合于一起、順 序或交替給予。其它適用于本發明的方法的化合物被描述在美國出版物20120264734,其內 容以其整體通過引用在此結合。 在本發明的某些方面，當EZH2的抑制劑抑制突變體EZH2的組蛋白甲基轉移酶活性比它 抑制野生型EZH2的組蛋白甲基轉移酶活性更有效時，EZH2的抑制劑"選擇性地抑制"突變體 EZH2的組蛋白甲基轉移酶活性。例如，在一個實施例中，選擇性的抑制劑具有一個IC50，該 IC50對于突變體EZH2比對于野生型EZH2的IC50至少低40%。在一個實施例中，選擇性的抑 制劑具有一個IC50,該IC50對于突變體EZH2比對于野生型EZH2的IC50至少低50%。在一個 實施例中，選擇性的抑制劑具有一個IC50,該IC50對于突變體EZH2比對于野生型EZH2的 IC50至少低60%。在一個實施例中，選擇性的抑制劑具有一個IC50,該IC50對于突變體EZH2 比對于野生型EZH2的IC50至少低70%。在一個實施例中，選擇性的抑制劑具有一個IC50,該 IC50對于突變體EZH2比對于野生型EZH2的IC50至少低80%。在一個實施例中，選擇性的抑 制劑具有一個扣50，該扣50對于突變體￡2112比對于野生型￡2112的1050至少低90%。 在本發明的某些方面，該抑制劑抑制從H3-K27me2至H3-K27me3的轉換。在一個實施例 中，該抑制劑據說是抑制H3-K27的三甲基化。因為從H3-K27mel至H3-K27me2的轉換先于從 H3-K27me2至H3-K27me3的轉換，從H3-K27mel至H3-K27me2的轉換天然地也抑制從H3-K27me2至H3-K27me3的轉換，即，它抑制H3-K27的三甲基化。也有可能抑制從H3-K27me2至 H3-K27me3的轉換而不會抑制從H3-K27mel至H3-K27me2的轉換。這種類型的抑制盡管不會 抑制H3-K27的二甲基化，但也將導致H3-K27的三甲基化的抑制。 在一個實施例中，該抑制劑抑制從H3-K27mel至H3-K27me2的轉換和從H3-K27me2至H3-K27me3的轉換。這樣的抑制劑可以直接單獨抑制從H3-K27mel至H3-K27me2的轉換。可替換 地，這樣的抑制劑可以直接抑制從H3-K27mel至H3-K27me2的轉換和從H3-K27me2至H3-K27me3的轉換。 在本發明的某些方面，該抑制劑化合物抑制組蛋白甲基轉移酶活性。組蛋白甲基轉移 酶活性的抑制可以使用任何適合的方法來檢測。該抑制可以被測量，例如，依據組蛋白甲基 轉移酶的活性比率或者依照組蛋白甲基轉移酶活性的產物來測量。 相比合適的對照該抑制是一種可測量的抑制。在一個實施例中，相比合適的對照，抑制 是至少10%的抑制。即，使用抑制劑時酶活性的比率或產物的量是少于或等于不使用抑制 劑時產生的相應的比率和的量的90%。在各種其它實施例中，相比合適的對照，抑制是至少 20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%或95%抑制。在一個實施例中，相 比合適的對照，抑制是至少99%抑制。即，使用抑制劑時酶活性的比率或產物的量是少于或 等于不使用抑制劑時產生的相應的比率和量的1 %。 本發明的組合物包括EZH2抑制劑或化合物44或其藥學上可接受的鹽，以及一種或多種 其它治療藥劑或其藥學上可接受的鹽。本發明提供了一種EZH2抑制劑或化合物44或其藥學 上可接受的鹽以及一種或多種治療藥劑或其藥學上可接受的鹽(作為共同配制品或單獨的 配制品）的給藥，其中配制品的給予是同時的、順序的或交替的。在某些實施例中，其它治療 藥劑可以是被本技術領域認為是對治療正在經本發明的組合物治療的疾病或病癥有用的 藥劑。在某些實施例中，其它治療藥劑可以是未被本技術領域認為是對治療正在經本發明 的組合物治療的疾病或病癥有用的藥劑。在一個方面，其它治療藥劑可以是賦予本發明的 組合物有益屬性的藥劑(例如，影響組合物粘性的藥劑）。對本發明的組合物有益的屬性包 括(但不限于）從EZH2抑制劑或化合物44與一種或多種其它治療藥劑的組合產生的藥劑代 謝動力學或藥效學共同作用。例如，該一種或多種其它治療藥劑可以是抗癌藥劑或化學治 療藥劑。例如，該一種或多種其它治療藥劑可以是糖皮質激素。例如，該一種或多種其它治 療藥劑可以是選自強的松、潑尼松龍、環磷酰胺、長春新堿、阿霉素、馬磷酰胺、順鉑、阿糖胞 苷、依維莫司、地西他濱、地塞米松、或其功能類似物、衍生物、前藥和代謝物。在另一方面， 其它治療藥劑可以是強的松或它的活性代謝物、潑尼松龍。 以下闡述的治療藥劑是為了說明的目的，而不是意在限制。本發明包括從以下列表中 選出的至少一種其它治療藥劑。本發明可以包括多于一種其它治療藥劑，例如，兩種、三種、 四種、或五種其它治療藥劑以至于本發明的組合物可以執行其預期功能。 在另一實施例中，其它治療藥劑是選自包括烷基化藥劑的組的化學治療藥劑(也被稱 為抗瘤藥劑或抗增生藥劑）；抗生素;抗代謝物;解毒劑;干擾素;多克隆或單克隆抗體;EGFR 抑制劑;J1ER2抑制劑;組蛋白脫乙酰酶抑制劑;激素;有絲分裂抑制劑;mTOR抑制劑;多激酶 抑制劑;絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑;酪氨酸激酶抑制劑;VEGF/VEGFR抑制劑;紫杉烷或紫杉 烷衍生物、芳香酶抑制劑、蒽環類抗生素、微管靶向藥劑、拓撲異構酶毒物藥劑、分子靶標或 酶的抑制劑(例如，激酶或蛋白甲基轉移酶）、胞苷類似物的藥劑或任何化學治療、抗腫瘤或 抗增生藥劑，這些藥劑在 www ? cancer ? org/docroot/cdg/cdg_0 ? asp列出。 本發明提供用于組合療法的方法，其中包括EZH2抑制劑或化合物44或其藥學上可接受 的鹽以及一種或多種其它治療藥劑的組合物被給予需要治療疾病或癌癥的受試者。組合療 法也可以是被給予癌癥細胞以抑制增生或誘導細胞死亡。在一個方面，在給予了包括化合 物44或其藥學上可接受的鹽和一種或多種其它治療藥劑的本發明的組合物之后，給予化合 物44或其藥學上可接受的鹽。在一個方面，在給予包括化合物44或其藥學上可接受的鹽和 一種或多種其它治療藥劑的本發明的組合物之前，給予化合物44或其藥學上可接受的鹽。 在一個方面，在給予了一種或多種其它治療藥劑之后給予化合物44或其藥學上可接受的 鹽，以至于這些其它治療藥劑是在單一的組合物中或在兩種或更多種組合物中被給予，例 如，同時地、順序地、或交替地被給予。在一個方面，在給予一種或多種其它治療藥劑之前給 予化合物44或其藥學上可接受的鹽，以至于這些其它治療藥劑是在單一的組合物中或在兩 種或更多種組合物中被給予，例如，同時地、順序地、或交替地被給予。 在一個實施例中，本發明的組合物包括包括化合物44或其藥學上可接受的鹽和一種或 多種抗癌藥劑，例如，CHOP(環磷酰胺、羥基柔紅霉素、長春新堿、以及強的松或潑尼松龍)或 R-CH0P(利妥昔單抗從、環磷酰胺、羥基柔紅霉素、長春新堿、強的松或潑尼松龍）。在一個實 施例中，本發明的組合物包括化合物44或其藥學上可接受的鹽和強的松或潑尼松龍。本發 明的方法包括給予化合物44的化合物或其藥學上可接受的鹽和抗癌藥劑(其中抗癌藥劑是 CHOP、R-CH0P、強的松或潑尼松龍)的組合療法。 在某些實施例中，"組合包括EZH2抑制劑和標準治療藥劑"旨在包含不是共同配制的治 療藥劑的給予。 在某些實施例中，"組合療法"旨在包括以順序方式給予這些治療劑，其中在不同時間 給予每種治療劑，以及同時或以基本上同時的方式給予這些治療劑或這些治療劑中的至少 兩種。可以例如通過向受試者給予具有固定比率的每種治療劑的單一膠囊或以針對這些治 療劑中的每種的多個單一膠囊來完成基本上同時給予。依次或基本上同時給予每一治療 劑，可通過任何適當的途徑來實現，包括(但不限于）口服途徑、靜脈途徑、肌內途徑、并通過 粘膜組織直接吸收。可以通過相同途徑或通過不同途徑給予這些治療劑。例如，可以通過靜 脈注射給予選定組合的第一治療藥劑，同時可以口服地給予該組合的其他治療藥劑。可替 代地，例如，可以口服地給予所有治療藥劑或可以通過靜脈注射給予所有治療藥劑。也可以 交替地給予治療藥劑。 在本發明的某些方面，本發明的組合療法可以在疾病或癌癥治療中產生協同效應。"協 同效應"被定義為治療藥劑的組合的效力比任何給定的藥劑單獨的效果的總和要大。協同 效應也可以是任何化合物或其它治療藥劑作為單一藥劑給予時所不能達到的效果。協同效 應可以包括(但不限于)通過減小腫瘤大小、抑制腫瘤生長或增加受試者存活來治療癌癥的 效果。協同效應還可以包括降低癌癥細胞活力、誘發癌癥細胞死亡、和抑制或延遲癌癥細胞 生長。 在本發明的某些方面，"組合療法"也包括進一步組合其他生物活性成分和非藥物治療 (例如，手術或放射治療)來給予如上文描述的治療藥劑。其中組合療法進一步包括非藥物 治療，該非藥物治療可以在任何合適的時間進行，只要能達到來自所述治療藥劑與非藥物 治療共同作用的有益效果。例如，在適當的情況下，當非藥物治療暫時從治療藥劑的給藥中 移除時(也許是幾天甚至幾個星期），仍然能獲得有益的效果。 在另一方面，本發明的組合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物可以與放射治療組合 給予。放射治療也能與本發明的組合物和本文描述的作為多藥劑治療的一部分的其它化學 治療藥劑組合給予。 組合療法可以通過給予兩種或多種藥劑來達到，這些藥劑是例如化合物44和一種或多 種其它治療藥劑，其中每一種單獨配制和給予或通過單一配制品給予兩種或更多種藥劑。 組合療法也包括其它的組合。例如，兩種藥劑可以一起配制和與包含第三藥劑的單獨配制 品一起給予。然而組合療法中的兩種或更多種藥劑可以同時給予，它們不需要如此。例如， 給予第一藥劑(或藥劑的組合)可以先于給予第二藥劑(或藥劑的組合)幾分鐘、幾小時、幾 天、或幾個星期。因此，兩種或更多種藥劑可以在間隔幾分鐘內給予，或間隔1、2、3、6、9、12、 15、18、或24小時內給予，或間隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14天給予，或間隔2、3、4、5、6、 7、8、9、或10星期給予。在一些情況下可能是甚至更長的間隔。然而在許多情況下，最好是在 組合療法中使用的兩種或更多種藥劑可以同時存在于病人的體內，這不必如此。 本發明還提供了藥物組合物，該藥物組合物包含化合物44或其藥學上可接受的鹽以及 本文披露的一種或多種其它治療劑，并混合藥學上合適劑量的載體或賦形劑來治療或預防 的如本文所述的疾病或病癥。本發明的藥物組合物也可以與其他治療劑或治療方法同時 地、依次地、或交替地組合給予。 本發明的組合物混合物也可以作為簡單的混合物或合適的配制的藥物組合物給予患 者。例如，本發明的一個方面涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包括治療有效劑量的EZH2 抑制劑或化合物44、或其藥學上可接受的鹽、水合物、對映體或立體異構體;一種或多種其 它治療劑，和藥學上可接受的稀釋劑或載體。 "藥物組合物"是一種配制品，該配制品包含以適合給予至患者的形式存在的化合物。 本文描述的化合物44和一種或多種其它治療藥劑每一個可以單獨配制或配制成由任何活 性成分組合的藥物組合物。相應地，可以基于每種藥物組合物的劑型選擇合適的一種或多 種給藥途徑。可替代地，本文描述的化合物44和一種或多種其它治療劑可以配制成一種藥 物組合物。 在一個實施例中，所述藥物組合物是以整批或以單位劑型存在。所述單位劑型是任何 各種形式，包括例如膠囊、IV包、片劑、上氣溶膠吸入器的單個栗、或小瓶。組合物單位劑量 中活性成分(如披露的化合物、鹽、水化物、溶劑化物或其同分異構物的配制品）的量是有效 的量且根據涉及的特定的治療有所不同。本領域的技術人員應當了解有時候有必要根據患 者的年齡和病癥對劑量進行常規變化。劑量也取決于給藥的途徑。各種途徑被考慮，包括口 腔、肺、直腸、腸胃外、經皮膚、皮下、靜脈注射、肌內、腹腔內、吸入、頰、舌下、胸膜腔內、鞘 內、鼻內等。用于局部或經皮給予本發明的化合物的劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳 膏、洗劑、凝膠、溶液、貼劑以及吸入劑。在一個實施例中，活性成分在無菌條件下與藥學上 可接受的載體，以及與任何需要的防腐劑、緩沖劑或推進劑混合。 本文使用的短語"藥學上可接受的"是指在合理醫學判斷范圍內的那些化合物、陰離 子、陽離子、材料、組合物、載體、和/或劑型，這些是適合用于與人類和動物組織接觸使用而 沒有過多的毒性、刺激、過敏反應或其他問題或并發癥，與合理的益處/風險比相稱。 "藥學上可接受的賦形劑"意指用于制備藥物組合物的賦形劑，它們通常是安全的、無 毒性的和沒有生物學上或其它方面不期望的，并且包括獸醫使用或人類藥物使用可接受的 賦形劑。本說明書和權利要求使用的"藥學上可接受的賦形劑"包括一種和多于一種這樣的 賦形劑。 本發明的藥物組合物被配制成與其預期的給予途徑相容。給藥途徑的實例包括包括 (例如)腸胃外、靜脈內、皮內、皮下、□腔(例如，吸入）、經皮膚(局部）、和經粘膜給藥。用于 腸胃外、皮內或皮下應用的溶液或懸浮液可包括以下組分:無菌稀釋劑如注射用水，鹽水溶 液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶劑;抗菌劑如芐醇或苯基甲酸甲酯;抗氧 化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螯合劑如乙二胺四乙酸;緩沖劑如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸 鹽，和調節張力的藥劑如氯化鈉或右旋糖。可以用酸或堿如鹽酸或氫氧化鈉調節pH。腸胃外 制劑可以被封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。 本發明的組合物可以許多目前用于化學治療的熟知的方法給予受試者。例如，對于治 療癌癥，本發明的化合物可以直接被注射進腫瘤，注射進血流或體腔或口服或使用貼劑應 用于皮膚。選擇的劑量應該足以構成有效治療，但不會高到引起不可接受的副作用。疾病病 癥狀況(例如，癌癥、癌前病變等)和患者的健康狀況在治療期間和治療后的合理期限內應 優選地被密切監測。 本文使用的術語"治療有效量"是指對治療、改善或預防目標疾病或病癥所需的治療劑 的量或表現出可檢測的治療或抑制作用所需的治療劑的量。該作用可以通過本技術領域已 知的任何測定方法來檢測。對于受試者精確的有效量將取決于受試者的體重、大小和健康 狀況;病癥的性質和程度;和選擇用于給藥的治療劑或治療劑的組合。治療有效量對于給定 的情況下可通過臨床醫師的技術和判斷范圍內的常規實驗來確定。在一個優選的方面，待 治療的疾病或病癥是癌癥。在另一個的方面，待治療的疾病或病癥是細胞增生性障礙。 在某些實施例中，相比單獨使用各個藥劑的單藥治療，當組合使用各個藥劑時各個藥 劑的治療有效量會更低。這種更低的治療有效量能負擔的治療方案的毒性更低。 對于任何化合物，最初治療有效量可以在細胞培養分析(如腫瘤細胞的細胞培養分析） 中或者在動物模型(通常大鼠、小鼠、兔、狗、或豬）中估算。動物模型還可以用于確定給藥的 適當濃度范圍和途徑。然后這類信息可以用于確定對于在人中給藥的適用劑量和途徑。治 療/預防效果和毒性可以通過標準藥劑程序在細胞培養物或實驗性動物中來確定，例如， ED 5q(在50%群體中治療有效的劑量)和LD5Q(對50%的群體具殺傷性的劑量）。毒性和治療 效果之間的劑量比率是治療指數，且可以表達為比率LD 5Q/ED5Q。呈現大的治療指數的藥物 組合物是優選的。該劑量可以根據所采用的劑型、患者的敏感性、和給藥途徑在此范圍內變 化。 調整劑量和給藥以提供一種或多種活性藥劑的足夠水平或維持期望的效果。可考慮的 因素包括疾病狀況的嚴重性、受試者的一般健康狀況、受試者的年齡、體重以及性別、飲食、 給藥時間和頻率、一種或多種藥劑組合、響應靈敏度、以及對療法的耐受/響應。長效藥物組 合物根據特定配制品的半衰期和清除率可以每3至4天、每周、或每兩周一次給藥。 包括本發明的活性化合物的藥物組合物可以通過本領域公知的方法制備，例如通過常 規混合、溶解、制粒、制糖衣、磨粉、乳化、膠囊化、包埋、或凍干工藝的方式。藥物組合物能以 一種常規的方式使用一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑來配制，它們 協助將活性化合物制成制劑的工藝，這些制劑是可以藥用的。當然，合適的配制品取決于所 選擇的給藥途徑。 適合于可注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(在水溶性的情況下）或分散體以及 用于臨時制備無菌可注射溶液或分散液液的無菌粉末。對于靜脈內給藥，適合的載體包括 生理鹽水、抑菌水、克列莫佛（〇6111(^1101')￡1^ 1￥(1^5?，新澤西州派西派尼市（？3^1。。3117， NJ))或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物必須是無菌的并且必須具有達到容 易注射的程度的流動性。它在制備和存儲的條件下必須是穩定的并且必須抗微生物(如細 菌和真菌)的污染作用而保存。該載體可以是包含以下物質的溶劑或分散介質:例如，水、乙 醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等），以及其適合的混合物。恰當的流動性可 (例如）通過應用衣料如卵磷脂來維持，在分散體的情況下通過維持所需的顆粒大小來維 持，以及通過應用表面活性劑來維持。防止微生物的作用可以通過不同的抗細菌以及抗真 菌劑，例如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等來實現。在許多情況下，優 選在組合物中包括等滲劑(例如糖）、多元醇(例如甘露醇和山梨糖醇）、和氯化鈉。可通過在 組合物中包括延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現可注射組合物的延長吸收。 按照需要，可以通過將活性化合物以需要的量加入具有以上列舉的組分中的一種或多 種組合的適當溶劑中，隨后進行無菌過濾來制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物加入 無菌載體中來制備分散體，該無菌載體包含基礎分散介質以及來自以上列舉的那些所需的 其他成分。就用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末而言，制備方法為真空干燥和冷凍-干燥 技術，這些方法產生活性成分的粉末以及來自其先前的無菌-過濾溶液的任何另外的所需 成分。 口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用的藥學上可接受的載體。它們可以被封裝在 明膠膠囊中或被壓成片劑。出于口服治療性給藥的目的，可以將活性化合物隨賦形劑一起 加入并且以片劑、錠劑或膠囊劑的形式使用。可以使用用以口腔清洗的流體載體來制備口 服組合物，其中流體載體中的化合物經口服、漱、咳出或咽下。可以包括藥學上相容的粘合 劑和/或佐劑材料作為組合物的一部分。所述片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有任何以下成分 或類似性質的化合物:粘合劑如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠;賦形劑如淀粉或乳糖；崩解 劑如藻酸、凝膠(Primogel)或玉米淀粉;潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes;助流劑如膠體二氧 化硅;甜味劑如蔗糖或糖精;或調味劑如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調味劑。 對于通過吸入給藥，化合物從加壓容器或分配器(其中包含合適的推進劑，例如氣體 (如二氧化碳)）、或噴霧器以氣溶膠噴霧形式遞送。 系統給藥也可以通過經粘膜或經皮膚的方式。對于經粘膜或經皮膚給藥，在該配制品 中使用適合有待滲透的障礙的滲透劑。這樣的滲透劑通常是本技術領域所熟知的，并且對 于經粘膜給藥包括，例如洗滌劑、膽汁鹽和夫西地酸衍生物。經粘膜給藥可以通過使用鼻噴 霧劑或栓劑來實現。對于經皮膚給藥，如本領域中公知的，將活性化合物配制成軟膏劑、油 膏劑、凝膠劑、或乳膏。 將這些活性化合物與保護這些化合物免于從體內快速消除的藥學上可接受的載體一 起制備，如控制釋放配制品，包括植入物和微囊化的遞送系統。可以使用可生物降解、生物 相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯類、以及聚乳酸。用于 制備此類配制品的方法對本領域的普通技術人員而言應是顯而易見的。材料也可以從Alza 公司和Nova制藥公司購買得到從，脂質體懸浮液(包括靶向受感染細胞的具有針對病毒抗 原的單克隆抗體的脂質體)也可以用作藥學上可接受的載體。這些可以根據本領域的普通 技術人員已知的方法制備，如(例如)描述在美國專利號4,522,811)中的。 特別有利的是以劑量單位形式配制口服或腸胃外組合物以便給藥和劑量統一。本文使 用的劑量單位形式是指適合作為單一劑量用于待治療受試者的物理上離散的單位;每個單 位含有經計算以產生與所需的藥物載體組合產生期望的治療效果的活性化合物的預定量。 對于本發明的劑量單位形式的規格被支配于和直接取決于活性化合物的獨特特征和將要 實現的特定治療效果。 在治療應用中，本文所述的EZH2抑制劑化合物、本文描述的其它治療劑、包括化合物44 和一種或多種其它治療劑的組合物、或在按照本發明使用的藥物組合物的劑量變化，在影 響所選劑量的其他因素中，取決于藥劑、接受的患者的年齡、體重和臨床狀況，以及給予治 療的臨床醫師或執業醫師的經驗和判斷。通常，劑量應足以導致腫瘤生長的減慢、和優選是 消退、并且還優選是使腫瘤完全消退。劑量的范圍可以是從每天大約〇.〇lmg/kg至每天大約 5000mg/kg。在優選的方面，劑量的范圍可以是從每天大約lmg/kg至每天大約1000mg/kg。在 一個方面，劑量的范圍將以單一的、分割的、或連續的劑量為約0.1毫克/天至約50克/天;約 〇. 1毫克/天至約25克/天;約0.1毫克/天至約10克/天;約0.1毫克至約3克/天;或約0.1毫克 至約1克/天(劑量可調整為患者的體重(千克）、體表面積(平方米）、年齡(年））。藥劑的有效 量是它提供了由臨床醫生或其他合格的觀察者注意到的一個客觀可識別的改進。例如，患 者腫瘤的消退可以參考腫瘤的直徑來測量。腫瘤直徑的減少表示消退。治療停止后腫瘤復 發失敗也表示消退。本文使用的術語"劑量有效的方式"是指活性化合物在受試者或細胞中 產生期望的生物效應的量。 藥物組合物可以與給藥的說明書一起包括在容器、包裝、或分配器中。 本發明的組合物能夠進一步形成鹽。本發明的組合物每個分子能夠形成多于一個(例 如單-、二-、三-)鹽。所有這些形式也包括在本發明要求的范圍內。 本文所用的"藥學上可接受的鹽"是指本發明的化合物的衍生物，其中母體化合物通過 制備其酸或堿的鹽來修飾。藥學上可接受的鹽的實例包括(但不限于)堿性殘基的礦物鹽或 有機酸鹽，如胺，酸性殘基(如羧酸等）的堿鹽或有機鹽。藥學上可接受的鹽包括例如從無毒 的無機酸或有機酸形成的母體化合物的常規的無毒鹽或季銨鹽。例如，這樣的常規無毒鹽 包括(但不限于)來自于無機酸和有機酸的那些，所述無機酸和有機酸選自以下物質：2_乙 酰氧基苯甲酸、2-羥基乙磺酸、乙酸、抗壞血酸、苯磺酸、苯甲酸、重碳酸、碳酸、檸檬酸、依 地、乙烷二磺酸、1，2-乙烷磺酸、富馬酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、乙二醇阿散酸、 間苯二酚酸、水巴米克酸(hydrabamic)、氫溴酸、鹽酸、氫碘酸、羥基馬來酸、羥萘甲酸、羥乙 磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂基磺酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、萘磺酸、硝酸、草酸、撲 酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、聚半乳糖醛酸、丙酸、水楊酸、硬脂酸、亞醋酸、琥珀酸、氨基磺酸、對 氨基苯磺酸、硫酸、鞣酸、酒石酸、甲苯磺酸，和通常出現的氨基酸，例如，甘氨酸、丙氨酸、苯 丙氨酸、精氨酸等。 藥學上可接受的鹽的其它實例包括己酸、環戊烷丙酸、丙酮酸、丙二酸、3_(4_羥基苯甲 酰)苯甲酸、肉桂酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基二環-[2，2，2 ]-辛-2-烯-1-羧酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、粘康酸等。本發明還包括當存在于 母體化合物中的酸性質子被金屬離子(例如堿金屬離子、堿土離子或鋁離子)替換或與有機 堿(如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等)配合所形成的鹽。 應當理解的是，所有引用的藥學上可接受的鹽包括相同鹽的溶劑加成形式（溶劑化 物)。 組合物或藥學上可接受的鹽或其溶劑化物的給藥方式有口服、經鼻、經皮、經肺、吸入、 經頰、舌下、腹腔內、皮下、肌內、靜脈內、直腸、胸膜內、鞘內和腸胃外。在一個實施例中，該 化合物是口服給藥。本領域技術人員將認識到某些給藥途徑的優點。 利用這些化合物的給藥方案的選擇是根據各種因素，包括患者的類型、物種、年齡、體 重、性別和醫療病癥;該被處理病癥的嚴重程度;給藥途徑;患者的腎和肝功能；以及應用的 具體化合物或其鹽。一個普通技術的醫師或獸醫可以容易地確定并開出所需藥物的有效量 以預防、對抗、或阻止病癥的進展。 本發明披露的化合物的配制品和給藥的技術見于文獻雷明頓，藥學科學與實踐，第19 版，賓夕法尼亞州伊斯頓的Mack出版公司（1995)(Remington:the Science and Practice of Pharmacy，19th edition，Mack Publishing Co ?，Easton，PA( 1995))。在一個實施例中， 本文所述的化合物，和其藥學上可接受的鹽，在藥物配制中與藥學可接受的載體或稀釋劑 組合使用。合適的藥學上可接受的載體包括惰性固體填充劑或稀釋劑和無菌水或有機溶 液。這些化合物將存在于足以提供在本文所述范圍內的所需劑量的這樣的藥物組合物中。 除非另行說明，本文所用的所有百分比和比率均以重量計。本發明的其它特征和優點 從不同的實例顯而易見。所提供的實例說明在實施本發明中有用的不同組分和方法。所述 實例不限制要求保護的發明。基于本披露，本領域技術人員可以識別和使用對實施本發明 有用的其他組分和方法。 本發明提供了用于治療病癥和疾病的組合物和方法，其治療的過程可以通過調節組蛋 白或其它蛋白質的甲基化狀態被影響，其中所述甲基化狀態是至少部分地由EZH2的活性介 導的。組蛋白的甲基化狀態的調節可以反過來影響由甲基化激活的靶基因和/或由甲基化 抑制的靶基因的表達水平。該方法包括給予需要這種治療的受試者治療有效量的本發明的 組合物或藥學上可接受的鹽或其溶劑化物。 至少基于異常組蛋白甲基化已被發現與某些癌癥和癌前狀態有關聯的事實，在受試者 中使用突變體EZH2用于治療癌癥或癌前狀態的方法包括給予需要的受試者治療有效量的 抑制甲基化的化合物。在一個實施例中，用于在受試者中治療癌癥或癌前狀態的方法包括 向對其有需要的受試者給予抑制非甲基化H3-K27向一甲基化H3-K27(H3-K27mel)轉換的治 療有效量的化合物。在一個實施例中，用于在受試者中治療癌癥或癌前狀態的方法包括向 對其有需要的受試者給予抑制一甲基化H3-K27向二甲基化H3-K27(H3-K27me2)轉換的治療 有效量的化合物。在一個實施例中，用于在受試者中治療癌癥或癌前狀態的方法包括向對 其有需要的受試者給予抑制H3-K27me2向三甲基化H3-K27(H3-K27me3)轉換的治療有效量 的化合物。在一個實施例中，用于在受試者中治療癌癥或癌前狀態的方法包括向對其有需 要的受試者給予抑制H3-K27mel向H3-K27me2轉換和H3-K27me2向H3-K27me3轉換的治療有 效量的化合物。值得注意的是，在沒有組蛋白或蛋白質甲基化細胞水平的整體增加時，在關 鍵基因位點的染色質上可以發生疾病特異的甲基化的增加。例如，針對整體組蛋白或蛋白 質低甲基化的背景，在關鍵疾病相關基因上可能發生異常的高甲基化。 通常，甲基化的調節劑可用于調節細胞增生。例如，在一些情況下，使用減少甲基化的 藥劑可以減少過度增生，反之使用增加甲基化的藥劑可以刺激不足的增生。相應地，待治療 的疾病包括過度增生性疾病，例如良性細胞生長和惡性細胞生長(癌癥）。 EZH2介導的蛋白質甲基化起作用的疾病可以是癌癥、細胞增生性疾病、或前癌狀態。本 發明進一步提供本發明組合物、或藥學上可接受的鹽或其溶劑化物對需要這樣的治療的受 試者的用途，制備用于治療癌癥的藥劑的用途。待治療的示例性的癌癥包括淋巴瘤，包括非 霍奇金淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)和彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)(包括GCB淋巴瘤）。 通常，作為甲基化調節劑的化合物可用于調節細胞增生。例如，在一些情況下，使用減 少甲基化的藥劑可以減少過度增生，反之使用增加甲基化的藥劑可以刺激不足的增生。相 應地，可以通過本發明的化合物治療的疾病包括過度增生性疾病，例如良性細胞生長和惡 性細胞生長。 本文使用的"對其有需要的受試者"是具有EZH2介導的蛋白質甲基化起作用的疾病的 受試者，或者具有相對于大群體發展這樣的疾病的風險增加的受試者。對其有需要的受試 者可以具有前癌狀態。優選地，對其有需要的受試者具有癌癥。"受試者"包括哺乳動物。該 哺乳動物可以是(例如)任何哺乳動物，如人類、靈長類、鳥類、小鼠、大鼠、狗、貓、牛、馬、山 羊、駱駝、綿羊或豬。優選地，該哺乳動物是人類。 本發明的受試者包括任何已經被診斷為癌癥或前癌狀態、具有癌癥或前癌狀態、或具 有發展癌癥或前癌狀態的風險的人類受試者。本發明的受試者包括任何表達突變體EZH2的 人類受試者。例如，突變體EZH2包括一個或多個突變，其中該突變是取代、點突變、無義突 變、錯義突變、缺失、或插入或任何其它本文描述的EZH2突變。 對其有需要的受試者可以具有難治性或抗性的癌癥。"難治性或抗性的癌癥"意味著癌 癥對治療不響應。該癌癥可以從治療開始就有抗性，或在治療中變得有抗性。在一些實施例 中，對其有需要的受試者在最近治療緩解后有癌癥復發。在一些實施例中，對其有需要的受 試者接受了用于治療癌癥的所有已知的有效治療并都失敗了。在一些實施例中，對其有需 要的受試者接受了至少一次前治療。在某些實施例中，前治療是單藥治療。在某些實施例 中，前治療是組合療法。 在一些實施例中，對其有需要的受試者由于以前的治療可以具有第二癌癥。"第二癌 癥"是指由于或因為以前的致癌治療(例如化療)發生的癌癥。 受試者也可以對EZH2組蛋白甲基轉移酶抑制劑或任何其它治療藥劑顯示出耐藥性。 本發明的特征還在于為具有癌癥的受試者選擇組合療法的方法。所述方法包括以下步 驟:從受試者的樣品中檢測本文描述的一個或多個EZH2突變;且基于該一個或多個EZH2突 變選擇用于治療癌癥的組合療法。在一個實施例中，該治療包括給予受試者本發明的組合 物。在一個實施例中，該方法進一步包括給予受試者治療有效量的本發明的組合物。可以使 用任何本技術領域已知的合適方法來檢測EZH2突變。更多方法描述在美國專利公開號 20130040906，以其整體通過引用在此結合。 本文所述的方法和用途可以包括在向受試者給予本發明的組合物(例如，含有化合物 44的組合物)或其藥學上可接受的鹽以及一種或多種治療劑之前和/或之后，從有需要的受 試者的樣品中檢測本文所述的一個或多個EZH2突變的步驟。在測試樣品中存在本文所述的 一個或多個EZH2突變表明所述受試者響應于本發明的組合療法。 通過在受試者中遺傳篩查本文所描述的一個或多個EZH2突變，本發明提供了個性化的 藥物、治療和/或癌癥管理給受試者。例如，本發明通過確定受試者對組合療法的響應性且 當受試者響應于所述組合療法時給予受試者本發明的組合物而提供了用于治療或減輕有 需要的受試者的癌癥或癌前狀態的癥狀的方法。通過從受試者獲得樣品，并檢測本文描述 的一個或多個EZH2突變來確定響應性，并且本文描述的這樣的一個或多個EZH2突變的存在 表明所述受試者響應于本發明的組合物。一旦受試者的響應被確定，可以給予治療有效量 的組合物，例如，包含化合物44或其藥學可接受的鹽的組合物和一種或多種治療劑。組合物 的治療有效量可以由本領域的普通技術人員來確定。 本文使用的術語"響應性"是與術語"響應"、"敏感"、和"敏感性"可互換，并且它是指當 給予本發明的組合物時受試者表現出治療響應，例如，受試者的腫瘤細胞或腫瘤組織經受 細胞凋亡和/或壞死，和/或顯示降低的生長、分裂或增生。該術語也指當給予本發明的組合 物時，受試者相對于大的群體會或具有更高的概率表現治療響應，例如，受試者的腫瘤細胞 或腫瘤組織經受細胞凋亡和/或壞死和/或顯示降低的生長、分裂或增生。 "樣品"是指任何源自于所述受試者的生物樣品，包括但不限于細胞、組織樣品、體液 (包括(但不限于)粘液、血液、血漿、血清、尿液、唾液、精液）、腫瘤細胞和腫瘤組織。優選地， 樣品是從骨髓、外周血細胞、血液、血漿和血清中選擇。樣品可以由接受治療或測試的受試 者提供。可替代地，根據本領域的常規實踐樣品可由醫師來獲得。 本文使用的術語"細胞增生性疾病"是指一種病癥，在其中細胞的非常規或異常的生長 或兩者可導致有害的病癥或疾病，其可以是或可以不是癌性的發展。本發明的示例性細胞 增生性疾病包括各種病癥，其細胞分裂是失調的。示例性細胞增生性病癥包括(但不限于） 腫瘤、良性腫瘤、惡性腫瘤、癌前期病癥、原位腫瘤、包封的腫瘤、轉移瘤、液體腫瘤、實體腫 瘤、免疫腫瘤、血液瘤、癌癥、癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤和快速分裂細胞。本文使用的術語"快 速分裂的細胞"被定義為相同的組織內超過或高于相鄰或并列的細胞所預期的或觀察到的 分裂速率的任何細胞。細胞增生性疾病包括癌前期或癌前狀態。細胞增生性病癥包括癌癥。 優選地，本文所提供的方法用于治療或減輕癌癥的癥狀。"癌癥"一詞包括實體瘤以及血液 腫瘤和/或惡性腫瘤。"癌前期細胞"或"癌前細胞"是體現細胞增生性病癥是癌前期或癌前 狀態的細胞。"癌細胞"或"癌性細胞"是體現細胞增生性病癥是癌癥的細胞。任何可重復測 量方式可以被用來識別癌細胞和癌前細胞。癌細胞或癌前細胞可通過組織樣品（例如，活組 織檢查樣品）的組織學分型或分級來鑒定。癌細胞和癌前期細胞可以通過使用適當的分子 標記來鑒定。 待治療的癌癥可以通過DNA細胞計量術、流式細胞術或圖像細胞儀來評估。待治療的癌 癥可分型為具有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的在細胞分裂的合 成階段(如在細胞分裂的S期）的細胞。待治療的癌癥可以分型為具有低S期分數或高S期分 數。 本文使用的"正常細胞"是不能被歸類為"細胞增生性病癥"的一部分的細胞。一個正常 細胞缺乏可導致不希望的病癥或疾病發展的非常規生長或異常生長或兩者。優選地，正常 細胞具有正常功能的細胞周期檢驗點控制機制。 本文使用的"接觸細胞"是指一種狀態，其中化合物或其他物質組合物直接接觸細胞， 或足夠接近以在細胞內誘導期望的生物效果。 本文使用的"候選化合物"是指已經或將要在一個或多個體外或體內生物測試中測定， 以確定該化合物是否可能在細胞、組織、系統、動物或人中引起正在被研究人員或臨床醫師 所尋求的期望的生物學或醫學響應的本發明的化合物、或藥學上可接受的鹽或其溶劑化 物。候選化合物是本發明的化合物、或藥學上可接受的鹽或其溶劑化物。生物學或醫學響應 可以是癌癥的治療。生物學或醫學響應可以是細胞增生性病癥的治療或預防。體外或體內 生物測定可以包括(但不限于)酶活性測定、電泳迀移率變動分析、報告基因測定、體外細胞 生存力測定、以及本文所述的測定。 本文使用的"治療"（"treating"或"treat"）描述了出于防治疾病、病癥或失調的目的 對患者的管理和護理，并包括給予本發明的化合物或藥學上可接受的鹽或其溶劑化物，以 減輕疾病、病癥或失調的癥狀或并發癥，或消除疾病、病癥或失調。 本發明的組合物，或藥學上可接受的鹽或其溶劑化物，還可以用于預防疾病、病癥或失 調。本文使用的"預防"（"preventing"或"prevent"）描述了減少或消除疾病、病癥或失調的 癥狀或并發癥的發作。 本文使用的"減輕"一詞是指用來描述一個過程，其中疾病的體征或癥狀的嚴重性降 低。重要的是，體征或癥狀可以減輕而不被消除。在一個優選的實施例中，給予本發明的藥 物組合物導致體征或癥狀的消除，然而，不需要消除。有效劑量預期降低體征或癥狀的嚴重 性。例如，可能發生在多個位置的病癥如癌癥的體征或癥狀得以減輕的條件是該癌癥的嚴 重性在多個位置中的至少一個內下降了。 本文使用的"嚴重性"一詞是指描述癌癥從癌前期或良性的狀態轉變成惡性狀態的潛 力。可替代地或另外地，嚴重性是指例如根據TM1分期系統（由國際抗癌聯盟(UICC)和美國 癌癥組合委員會(AJCC)接受)或者由其他技術領域公認的方法描述的癌癥階段。癌癥階段 指的是基于因素例如原發腫瘤的位置、腫瘤大小、腫瘤數和受累的淋巴結(癌癥擴散到淋巴 結)癌癥的程度或嚴重性。可替代地或另外地，嚴重性是指由本領域公認的方法(參見，美國 國家癌癥研究所，WWW. cancer, gov)描述的腫瘤分級。腫瘤等級是按照癌細胞在顯微鏡下的 外觀和腫瘤生長和擴散的可能速度，用于癌細胞分類的系統。當判斷腫瘤等級的時候，包括 細胞的結構和生長方式的很多因素被考慮。用于確定腫瘤等級的具體因素因每個類型癌癥 的不同而不同。嚴重性還描述了一種組織學分級，也稱為分化，其是指有多少腫瘤細胞類似 于同一組織類型的正常細胞(參見，美國國家癌癥研究所，www. cancer. gov)。此外，嚴重性 描述了一種核級，其是指腫瘤細胞中的核的大小和形狀以及正在分裂的腫瘤細胞的百分比 (參見，美國國家癌癥研究所，WWW ? cancer ? gov)。 本發明的另一個方面，嚴重性描述了腫瘤已分泌生長因子、降低細胞外基質、成為血 管、失去粘附到并列組織或轉移的程度。此外，嚴重性描述了原發腫瘤已經轉移的位置的數 目。最后，嚴重性包括治療不同類型和位置的腫瘤的難度。例如，不能手術的腫瘤、那些更多 的接近多個身體系統(血液學和免疫學腫瘤)的那些癌癥、和最抵抗傳統治療的那些被認為 是最嚴重的。在這些情況下，延長受試者的預期壽命和/或減輕疼痛，減少癌細胞的比例或 者限制細胞于一個系統，以及改善癌癥階段/腫瘤分級/組織學分級/核級被認為是減輕癌 癥的體征或癥狀。 本文使用的"癥狀"一詞被定義為疾病、病、損傷或某些在體內不正常的的指示。癥狀被 經歷該癥狀的個人感覺到或注意到，但可能不容易被其他人注意。其他人被定義為非醫護 人員。 本文所用的"體征"一詞也被定義為某些在體內不正常的指示。但體征被定義為可以由 醫生、護士和其他衛生保健專業人士可以看出的事物。 癌癥是一組可以導致幾乎所有的體征或癥狀的疾病。癥狀和體征將取決于癌癥在哪 里、癌癥的尺寸、它對附近器官或結構有多大的影響。如果癌癥傳播(發生轉移），那么癥狀 可出現在身體的不同部位。 治療癌癥可導致腫瘤尺寸的減小。腫瘤尺寸的減小也可以被稱為"腫瘤消退"。優選地， 治療后，相對于它在治療之前的大小，腫瘤尺寸被減小5 %或更多；更優選地，腫瘤尺寸被減 小10 %或更多；更優選地，被減小20 %或更多；更優選地，被減小30 %或更多；更優選地，被 減小40%或更多；甚至更優選地，被減小50%或更多；以及最優選地，被減小大于75%或更 多。腫瘤尺寸可通過任何可重復測量方式來測量腫瘤的大小可以測量為腫瘤的直徑。 治療癌癥可導致腫瘤體積的減小。優選地，治療后，相對于它在治療之前的大小，腫瘤 體積被減小5 %或更多；更優選地，腫瘤體積被減小10 %或更多;更優選地，被減小20 %或更 多；更優選地，被減小30 %或更多；更優選地，被減小40 %或更多；甚至更優選地，被減小 50%或更多；以及最優選地，被減小大于75%或更多。腫瘤體積可通過任何可重復測量方式 來測量。 治療癌癥可導致腫瘤數量的減少。優選地，治療后，相對于它在治療之前的數量，腫瘤 數量被減少5 %或更多；更優選地，腫瘤數量被減少10 %或更多;更優選地，被減少20 %或更 多；更優選地，被減少30 %或更多；更優選地，被減少40 %或更多；甚至更優選地，被減少 50 %或更多；以及最優選地，被減少大于75%或更多。腫瘤數量可通過任何可重復測量方式 來測量。腫瘤數量可以通過計數肉眼或在指定的放大率下可見的腫瘤來測量。優選地，指定 的放大率是 2x、3x、4x、5x、10x、S50x。 治療癌癥可以導致原生腫瘤位點遙遠的其它組織或器官的轉移病灶數量的減少。優選 地，治療后，相對于它在治療之前的數量，轉移病灶數量被減少5 %或更多；更優選地，轉移 病灶數量被減少10 %或更多;更優選地，被減少20 %或更多；更優選地，被減少30 %或更多； 更優選地，被減少40%或更多;甚至更優選地，被減少50%或更多；以及最優選地，被減少大 于75%或更多。轉移病灶數量可通過任何可重復測量方式來測量。轉移病灶數量可以通過 計數肉眼或在指定的放大率下可見的腫瘤來測量。優選地，指定的放大率是2x、3 X、4X、5x、 10x、或50x。 相對于僅接受載體的群體，治療癌癥可以導致接受治療的受試者群體的平均存活時間 增加。優選地，平均存活時間增加了多于30天;更優選地，增加了多于60天;更優選地，增加 了多于90天；以及最優選地，增加了多于120天。群體的平均存活時間的增加可以通過任何 可重復的方式來測量。群體的平均存活時間的增加可以（例如)通過使用活性化合物治療開 始后計算群體的平均存活長度來測量。群體的平均存活時間的增加可以（例如)通過使用活 性化合物治療第一輪完成后計算群體的平均存活長度來測量。 相對于未治療的群體，治療癌癥可以導致接受治療的受試者群體的平均存活時間增 加。優選地，平均存活時間增加了多于30天;更優選地，增加了多于60天;更優選地，增加了 多于90天；以及最優選地，增加了多于120天。群體的平均存活時間的增加可以通過任何可 重復的方式來測量。群體的平均存活時間的增加可以（例如)通過使用活性化合物治療開始 后計算群體的平均存活長度來測量。群體的平均存活時間的增加可以（例如)通過使用活性 化合物治療第一輪完成后計算群體的平均存活長度來測量。 相對于接受單藥治療(使用的藥物不是本發明的化合物或藥學上可接受的鹽或其溶劑 化物）的群體，治療癌癥可以導致接受治療的受試者群體的平均存活時間增加。優選地，平 均存活時間增加了多于30天;更優選地，增加了多于60天;更優選地，增加了多于90天；以及 最優選地，增加了多于120天。群體的平均存活時間的增加可以通過任何可重復的方式來測 量。群體的平均存活時間的增加可以（例如)通過使用活性化合物治療開始后計算群體的平 均存活長度來測量。群體的平均存活時間的增加可以（例如)通過使用活性化合物治療第一 輪完成后計算群體的平均存活長度來測量。 相對于僅接受載體的群體，治療癌癥可以導致接受治療的受試者群體的死亡率降低。 相對于未接受治療的群體，治療癌癥可以導致接受治療的受試者群體的死亡率降低。相對 于接受單藥治療(使用的藥物不是本發明的化合物或藥學上可接受的鹽或其溶劑化物）的 群體，治療癌癥可以導致接受治療的受試者群體的從死亡率降低。優選地，死亡率降低了多 于2%;更優選地，降低了多于5%;更優選地，降低了多于10%;以及最優選地，降低了多于 25%。接受治療的受試者群體的死亡率的降低可以通過任何可重復的方式來測量。群體的 死亡率的降低可以（例如)通過使用活性化合物治療開始后計算每個單位時間內群體的疾 病相關死亡的平均數量來測量。群體的死亡率的降低可以（例如)通過使用活性化合物治療 第一輪完成后計算每個單位時間內群體的疾病相關死亡的平均數量來測量。 治療癌癥可導致腫瘤生長率降低。優選地，治療后，相對于它在治療之前的數量，腫瘤 生長率降低了至少5%;更優選地，腫瘤生長率降低了至少10%;更優選地，降低了至少 20% ;更優選地，降低了至少30% ;更優選地，降低了至少40% ;更優選地，降低了至少50% ; 甚至更優選地，降低了至少60%;以及最優選地，降低了至少75%。腫瘤生長率可通過任何 可重復測量方式來測量。腫瘤生長率可以根據每個單位時間內腫瘤直徑的變化來測量。 治療癌癥可導致腫瘤再生長的降低。優選地，治療后，腫瘤再生長小于5% ;更優選地， 腫瘤再生長小于10% ;更優選地，小于20% ;更優選地，小于30% ;更優選地，小于40% ;更優 選地，小于50 % ;甚至更優選地，小于60 % ;以及最優選地，小于75 %。腫瘤再生長可通過任 何可重復測量方式來測量。腫瘤再生長的測量(例如)是通過測量治療后的居前腫瘤收縮后 腫瘤直徑的增加。治療停止后腫瘤復發的失敗表示腫瘤再生長的降低。 治療或預防細胞增生疾病可以導致細胞增生率的降低。優選地，治療后，細胞增生率降 低了至少5%;更優選地，降低了至少10%;更優選地，降低了至少20%;更優選地，降低了至 少30%;更優選地，降低了至少40%;更優選地，降低了至少50%;甚至更優選地，降低了至 少60% ;以及最優選地，降低了至少75%。細胞增生率可通過任何可重復測量方式來測量。 細胞增生率的測量(例如)是通過測量每個單位時間內組織樣品中分裂細胞的數量。 治療或預防細胞增生疾病可以導致增生細胞的比例的下降。優選地，治療后，增生細胞 的比例降低了至少5% ;更優選地，降低了至少10% ;更優選地，降低了至少20% ;更優選地， 降低了至少30% ;更優選地，降低了至少40% ;更優選地，降低了至少50% ;甚至更優選地， 降低了至少60%;以及最優選地，降低了至少75%。增生細胞的比例可通過任何可重復測量 方式來測量。優選地，增生細胞的比例例如是通過定量相對于非分裂細胞的數量而言組織 樣品中分裂細胞的數量來測量。增生細胞的比例可以是等同于細胞有絲分裂指數。 治療或預防細胞增生疾病可以導致細胞增生面積或區域大小的降低。優選地，治療后， 相對于它在治療之前的大小，細胞增生面積或區域大小降低了至少5%;更優選地，降低了 至少10%;更優選地，降低了至少20%;更優選地，降低了至少30%;更優選地，降低了至少 40%;更優選地，降低了至少50%;甚至更優選地，降低了至少60%;以及最優選地，降低了 至少75%。細胞增生面積或區域大小可通過任何可重復測量方式來測量。細胞增生面積或 區域大小可以通過細胞增生面積或區域的直徑或寬度來測量。 治療或預防細胞增生疾病可以導致具有異常外觀或形態的細胞的數量或比例的下降。 優選地，治療后，相對于它在治療之前的數量，具有異常外觀或形態的細胞數量降低了至少 5% ;更優選地，降低了至少10% ;更優選地，降低了至少20% ;更優選地，降低了至少30% ; 更優選地，降低了至少40%;更優選地，降低了至少50%;甚至更優選地，降低了至少60%; 以及最優選地，降低了至少75%。異常細胞的外觀或形態可通過任何可重復測量方式來測 量。異常細胞的形態可通過顯微鏡檢查例如使用倒置的組織培養顯微鏡來測量。異常的細 胞形態可以采取核多形性的形式。 本文使用的"選擇性地"一詞是指傾向于在一個群體中比另一個群體中以更高的頻率 發生。比較的群體可以細胞群體。優選地，本發明的化合物、或藥學上可接受的鹽或其溶劑 化物選擇性地對癌癥或癌前細胞起作用，但不作用于正常細胞。優選地，本發明的化合物、 或藥學上可接受的鹽或其溶劑化物選擇性地調節一種分子靶(例如，靶蛋白甲基轉移酶）， 但不顯著調節另一種分子靶(例如，非靶蛋白甲基轉移酶）。本發明還提供了一種選擇性地 抑制酶(如蛋白質甲基轉移酶)的活性的方法。優選地，如果相對于群體B，它發生在群體A的 頻率超過2倍以上，那么相對于群體B，事件選擇性地發生在群體A。如果在群體A中發生的頻 率大于5倍以上，那么事件選擇性地發生。如果相對于群體B，在群體A中發生的頻率大于10 倍以上;更優選地，在群體A中發生的頻率大于50倍;甚至更優選地，在群體A中發生的頻率 大于100倍；以及最優選地，在群體A中發生的頻率大于1000倍以上，那么事件選擇性地發 生。例如，如果細胞死亡相對于正常細胞在癌癥細胞中發生的頻率多于2倍，細胞死亡被說 是選擇性地發生在癌癥細胞中。 本發明組合物(例如化合物44或其藥學上可接受的鹽)和一種或多種其它的治療藥物 (如強的松)可以調節分子靶標(例如靶蛋白甲基轉移酶)的活性。調節是指刺激或抑制分子 靶標的活性。優選地，如果相對于分子靶標在相同的條件下僅缺乏本發明的化合物的存在 時的活性，分子靶標的活性被刺激或抑制了至少2倍，那么本發明的化合物或藥學上可接受 的鹽或其溶劑化物調節分子靶標的活性。更優選地，如果相對于分子靶標在相同的條件下 僅缺乏本發明的化合物的存在時的活性，分子靶標的活性被刺激或抑制了至少5倍、至少10 倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍，那么本發明的化合物或藥學上可接受的鹽或其溶劑化 物調節分子靶標的活性。分子靶標的活性可以用任何可重復的方法測量。分子靶標的活性 可以在體外或體內測量。例如，分子靶標的活性在體外可以通過酶活性試驗或DNA結合試驗 測量，或分子靶標的活性在體內可以通過報告基因的表達試驗來測量。 優選地，如果相對于分子靶標在相同的條件下但僅缺乏本發明的化合物的存在時的活 性，所述化合物的加入不能刺激或抑制分子靶標的活性超過10%，那么本發明的化合物不 能顯著地調節分子靶標的活性。 本文使用的術語"同功酶選擇性"是指相比酶的第二同種型，優先抑制或刺激酶的第一 同種型(例如相比蛋白質甲基轉移酶的同工酶0，優先抑制或刺激蛋白質甲基轉移酶同工酶 a)。優選地，本發明的化合物或藥學上可接受的鹽或其溶劑化物，在實現生物效應所需的劑 量中顯示出最小4倍差異，優選是10倍差異，更優選是50倍差異。優選地，本發明的化合物或 藥學上可接受的鹽或其溶劑化物，顯示出這種橫跨抑制范圍的差別，且該差別的示例為 IC 50,即，對于感興趣的分子靶標50%的抑制。 向對其有需要的細胞或受試者給予本發明的組合物可導致感興趣的蛋白甲基轉移酶 活性的調節(即刺激或抑制）。 向對其有需要的細胞或受試者給予本發明的化合物(例如包含化合物44或其藥學上可 接受的鹽的組合物)和一種或多種其它治療劑(如強的松)導致細胞內靶標(如底物)活性的 調節（即刺激或抑制）。幾個細胞內靶標可以使用本發明的化合物、包括但不限于蛋白質甲 基轉移酶來調節。 激活是指放置物質組合物(例如蛋白質或核酸)進入適合執行期望的生物學功能的狀 態。能夠被激活的物質組合物也具有非激活的狀態。激活的物質組合物可以具有抑制或刺 激的生物學功能或兩者。提高是指物質組合物(例如蛋白質或核酸）的期望的生物學活性的 增加。提高可以發生在物質組合物濃度增加的過程中。 本文使用的"細胞周期關卡通路"是指涉及細胞周期關卡調節的生物化學通路。細胞周 期關卡通路可以在包括細胞周期關卡的一個或多個功能中具有刺激或抑制效應或兩者都 是。細胞周期關卡通路是由至少兩種物質組合物(優選是蛋白質）構成，其中兩種都對細胞 周期關卡的調節有貢獻。細胞周期關卡通路可以通過細胞周期關卡通路中一個或多個成員 的激活來激活。優選地，細胞周期關卡通路是生物化學信號通路。 本文使用的"細胞周期關卡調節子"是指可以至少部分在細胞周期關卡調節中起作用 的物質組合物。細胞周期關卡調節子在包括細胞周期關卡的一個或多個功能上可以具有刺 激或抑制效應或兩者都是。細胞周期關卡調節子可以是蛋白質或不是蛋白質。 治療癌癥或細胞增生性病癥可導致細胞死亡，并且優選地細胞死亡導致群體中細胞數 量減少至少10%。更優選地，細胞死亡是指減少至少20% ;更優選地，減少至少30% ;更優選 地，減少至少40%;更優選地，減少至少50%;最優選地，減少至少75%。群體中細胞數量可 以通過任何可重復的方式來測量。群體中細胞數量可以通過熒光激活細胞分選(FACS)、免 疫熒光顯微鏡和光學顯微鏡來測量。測量細胞死亡的方法顯示在李等人，美國國家科學院 院刊，100(5):2674-8,2003(Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.100(5):2674-8， 2003)。在一個方面，細胞死亡通過細胞凋亡發生。 優選地，本發明的組合物或藥學上可接受的鹽或其溶劑化物的有效量是對正常細胞沒 有顯著的細胞毒性。如果給予治療有效量的化合物不會引起正常細胞大于10%的細胞死 亡，那么治療有效量的化合物對正常細胞沒有顯著的細胞毒性。如果給予治療有效量的化 合物不會引起正常細胞大于10%的細胞死亡，那么治療有效量的化合物不會顯著地影響正 常細胞的生存能力。在一個方面，細胞死亡通過細胞凋亡發生。 使細胞接觸本發明的組合物或其藥學上可接受的鹽或其溶劑化物可選擇性地誘發或 激活癌細胞的細胞死亡。向對其有需要的受試者給予本發明的化合物或其藥學上可接受的 鹽或其溶劑化物可選擇性地誘發或激活癌細胞的細胞死亡。使細胞接觸本發明的組合物或 其藥學上可接受的鹽或其溶劑化物可選擇性地誘發受細胞增生性病癥影響的一種或多種 細胞的細胞死亡。優選地，向對其有需要的受試者給予本發明的組合物或其藥學上可接受 的鹽或其溶劑化物選擇性地誘發受細胞增生性病癥影響的一種或多種細胞的細胞死亡。 本發明涉及通過向對其有需要的受試者給予本發明的組合物或其藥學上可接受的鹽 或其溶劑化物來治療或預防癌癥的方法，其中，給予本發明的組合物或其藥學上可接受的 鹽或其溶劑化物導致以下項中的一個或多個:通過在細胞周期的一個或多個階段(例如，G1 期、G1/S期、G2/M期）中的細胞累積、或誘導細胞的衰老、或促進腫瘤細胞分化來阻止癌細胞 的增生;通過細胞毒性、壞死或凋亡促進癌細胞的細胞死亡，而不引起大量正常細胞的細胞 死亡，且在動物中抗腫瘤活性具有至少2的治療指數。本文所用的"治療指數"是由有效劑量 除最大耐受劑量。 本領域的技術人員可以參考一般參考文獻中在此討論的已知技術或等效技術的詳細 說明。這些文獻包括Ausubel等人，分子生物學現代方法（Current Protocols in Molecular Biology)，約翰威利父子公司（John Wiley and Sons, Inc. )(2005);Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第三版），紐約州 冷泉港的冷泉港出版社(2000年）；Coligan等人，免疫學現代方法(Current Protocols in Immunology)，紐約約翰威利父子公司；恩納（Enna)等人，藥理學現代方法（Current Protocols in Pharmacology)，紐約約翰威利父子公司；Fingl等人，治療學的藥學基礎 (The Pharmacological Basis of Therapeutics)(1975)，雷明頓的藥物科學（Remington' s Pharmaceutical Sciences)，賓夕法尼亞州伊斯頓的Mack出版公司，第18版（1990)。當 然，這些文獻也可以在建立或使用本發明的一個方面提及。 實例1 EZH2抑制劑和糖皮質激素的協同抗腫瘤活性 化合物44的合成描述于美國專利號8,410,088中，其通過引用以其全文特此結合。 當化合物44(Cpd 44)僅與CHOP的糖皮質激素受體激動劑(GRag)潑尼松龍或與其它 GRag如地塞米松組合時觀察到顯著的協同作用。當與CHOP組合時化合物44的抗增生效應被 大大地增加了，且這種協同作用的大部分可以歸因于CHOP的GRag成分潑尼松龍(強的松的 活性代謝物）。引人注目地，化合物44和潑尼松龍的組合延伸了對EZH2抑制敏感的細胞的范 圍，從僅僅攜帶突變的GCB NHL細胞延伸至所有GCB NHL細胞。 兩個EZH2突變體細胞系(WSU-DLCL2和SU-DHL10)使用化合物44預處理4天，然后使用化 合物44和單獨CHOP組分共處理另外的3天(4+3模型）。馬磷酰胺(環磷酰胺的類似物）、阿霉 素和長春新堿都自身顯示出在突變體細胞系中濃度依賴性的生長抑制。因此，在與化合物 44組合時獲得它們藥物的組合指數(使用Calcusyn軟件計算的CI)。然而，這些細胞系它們 自身沒有顯示對潑尼松龍(強的松的活性代謝物）的敏感性。因此，在這種情況下不能確定 CI，反而基于使用潑尼松龍的濃度響應曲線觀察的化合物44的IC 5Q的變化計算出效力的增 加。 化合物44和馬磷酰胺的組合導致在兩個EZH2突變體細胞系中的總體加成組合益處（圖 1C、1F)。在WSU-DLCL2細胞中化合物44和阿霉素的組合在4+3模型中起到協同作用（圖1A)， 同時這個組合在SU-DHL10細胞中具有加和性（圖1D)。化合物44和長春新堿的組合在兩個 EZH2突變體細胞系中顯示加和性（圖1B、1E)。當使用潑尼松龍和化合物44的組合處理WSU-DLCL2細胞時，觀察到比化合物44大9倍的效力轉變。使用不同的GRag(地塞米松)處理導致 甚至更大的轉變，是化合物44的IC 5Q的17倍（圖2A、2B)。在SU-DHL10細胞中觀察到化合物44 效力轉變的類似趨勢（圖2C、2D)。 調查了化合物44和CHOP的組合效應是否使得野生型EZH2淋巴瘤細胞系對化合物44敏 感。因為化合物44單獨治療不會誘發EZH2野生型淋巴瘤系的生長抑制，基于CHOP組分各自 的濃度響應曲線來計算效力的轉變。在測試的CHOP組分中，僅僅GRag和化合物44的組合導 致了野生型GCB淋巴瘤細胞系的效力轉變。 下一步調查了化合物44和CHOP的組合效應是否可以使得EZH2突變體和野生型細胞系、 WSU-DLCL2EZH2突變體（圖3A、3B)和D0HH2EZH2野生型（圖3C、3D )GCB淋巴瘤細胞系對化合物 44敏感。使用潑尼松龍和化合物44組合處理WSU-DLCL2細胞導致了化合物44活性的增加（圖 3A)，且化合物44的IC5Q降低了最大24倍。使用不同的GRag(地塞米松)處理導致化合物44的 IC 5〇降低甚至更多即30倍（圖3B)。在lyM潑尼松龍和lOOnM地塞米松的生物學相關濃度，效力 分別增加了7倍和15倍。化合物44在D0HH2EZH2野生型細胞中作為單一藥劑沒有顯示抗增生 作用（圖3C、3D)，因此測定了潑尼松龍或地塞米松的效力轉變。有趣地，當在野生型GCB淋巴 瘤細胞系(D0HH2)中測試化合物44,僅僅CHOP的GRag組分在化合物44存在下顯示出增加的 效力（圖3C、3D)。在D0HH2細胞中加入化合物44,潑尼松龍或地塞米松的效力增加（圖3C、 3D)。 鑒于相對于單個藥劑，GRag和EZH2i組合在EZH2野生型和突變體GCB淋巴瘤細胞系中誘 發了大大增加的抗增生效應，確定了化合物治療的持續時間和/或添加的順序是否影響敏 感性。細胞系組也被延伸至包括EZH2野生型、EZH2突變體、化合物44敏感型、以及EZH2突變 體、化合物44不敏感型細胞系（以前被麥凱布(McCabe)等人報道，和內部未發表數據）。在之 前的4+3模型中，效力轉變是基于化合物44(在EZH2Y646(也被稱為Y641)敏感型細胞系中） 或潑尼松龍(在EZH2野生型細胞系中）的暴露。對于這組實驗，在潑尼松龍的固定濃度下化 合物44IC5Q的轉變被用于確定接受4+3模型、4天或7天共處理、或4天潑尼松龍前處理加3天 共處理的處理的細胞系中的組合益處。當EZH2突變體、化合物44敏感型細胞系被共處理4天 時，觀察到化合物44IC 5Q降低30-60倍，顯示了與4+3處理方案相似的趨勢(表1)。使用7天共 處理和4+3模型觀察到了相似的結果(表1)。在EZH2野生型GCB細胞系中，盡管4天后沒有產 生可測量的化合物44IC 5Q，但是在與潑尼松龍共處理4天后兩個細胞系都顯示出降低的增生 和可測量的化合物44IC5Q(表1KEZH2野生型GCB細胞也響應4+3模型和/或7天共處理方案 (表1)。引人注目地，EZH2突變體、化合物44不敏感細胞系，處理4天后也不顯示可測量的化 合物44IC 5Q，而共處理4天后顯示降低的增生，使用4+3處理方案以及7天共處理對該組合顯 示出更大的響應(表1)。當使用潑尼松龍預處理細胞，然后使用化合物44和潑尼松龍共處 理，這些細胞系中僅僅一個細胞系顯示組合益處，表明藥物添加的順序對協同效應是重要 的(表1)。 表1.化合物44/GRag組合在EZH2Y646(Y641)細胞系中增加EZH2i敏感性并且在抵抗 EZH2 i的細胞系中克服EZH2 i的不敏感性
為了評估對在這些細胞系中觀察到的化合物44和GRag的組合益處響應的潛在機制，我 們確定了在WSU-DLCL2、0CI-LY19、和RL細胞中單獨或組合使用化合物44處理4天后潑尼松 龍處理是否影響H3K27整體的甲基化和乙酰化。單一藥劑潑尼松龍在WSU-DLCL2或RL細胞中 對H3K27Me3水平沒有效應，但是在0CI-LY19細胞中更高的劑量的確增加H3K27Me3水平（圖 9A)。由于0CI-LY19細胞對潑尼松龍的高敏感性，相對于潑尼松龍不敏感的EZH2突變體系， 更低的潑尼松龍劑量對于處理0CY-LY19細胞是必要的。潑尼松龍的加入不會改變任何細胞 系中對H3K27Me3抑制的化合物44IC 5Q(圖9A)。同樣地，整體的H3K27乙酰化水平不會被潑尼 松龍或化合物44與潑尼松龍組合的影響（圖9B、9C和9D)。 已經發現H3K27乙酰化或三甲基化的整體水平不被影響，研究了 GR信號通路的轉錄調 節。使用化合物44、潑尼松龍、或其組合的單一濃度處理WSU-DLCL2、SU-DHL10、RL、SU-DHL4、 0CI-LY19、和D0HH2細胞4天，且使用糖皮質激素信號PCR試驗分析基因表達(表4)。總體上在 所有細胞系中使用潑尼松龍和組合治療很多的基因被下調了，表明GR在基因表達中起到激 活劑和抑制劑的作用。這里聚焦了 GR的激活功能且描述了在細胞系組中使用組合治療具有 協同上調的3個基因。一個抑制mTOR信號(ref)的候選腫瘤抑制基因瑟斯崔因（SESN1)在4個 EZH2突變體細胞系中（而不是在EZH2野生型細胞系中）使用組合治療以協同作用的方式被 識別為通常上調的基因（圖8A和表2) JNF表達僅僅在兩個EZH2突變體、化合物44不敏感的 細胞系（SUDHL4)的一個中被協同地上調，且其它EZH2突變體、化合物44不敏感的細胞系 (RL)的趨勢顯示了相同的結果（圖8B和表2KTSC22D3/GILZ的表達在所有細胞系中被潑尼 松龍上調，但在EZH2突變體化合物44敏感型細胞中僅被組合治療協同地提高（圖8C和表2)。 表2:基因表達數據的統計分析描述在圖8
成對統計比較采用雙尾t檢驗進行。 ns:不顯著；*p〈0 ? 05; **p〈0 ? 01; ***p〈0 ? 001; ****p〈0 ? 0001 對于EZH2野生型（即OCI-LY19、DOHH2)、EZH2Y646-敏感型（即WSU-DLCL2、SUDHL10)和 EZH2Y646抗性（即RL、SUDHL4)細胞系，在使用指示的化合物44、潑尼松龍、化合物44和潑尼 松龍龍的組合或DMS0處理后，測量了歸一化至DMS0對照的糖皮質激素受體的表達水平(2個 生物學重復，詳情請參見方法材料和方法第5部分）。如結果顯示，糖皮質激素受體表達水平 在細胞系中通常不受該組合的影響。（圖19)使用A A Ct法和ACTB、B2M和GATOH作為參考基 因定量了倍數變化值。 然后檢查了從CHOP方案刪除一個或多個化學治療組分在兩個另外的異種移植研究中 的效果。使用化合物44、C0P(沒有阿霉素組分的化學治療)或它們的組合處理攜帶SUDHL10 (EZH2Y646F)異種移植物的小鼠28天（圖20A)。比較了在第28天處死的8/16只小鼠的平均腫 瘤重量，表明各組之間腫瘤重量存在顯著差異（雙尾t檢驗，*p〈0 ? 05，林p〈0.01，*林*p〈 0.0001)。給予小鼠最大耐受劑量的化合物44或化合物44/C0P的組合物顯示在第60天100% 存活，該組合物組顯示最小的第28天腫瘤重量，與所有其它治療組(包括化合物44的最大耐 受劑量組)存在統計學上的差異(P〈〇.〇5)(圖20A)。 然后，我們調查了在SUDHL10異種移植模型中化合物44與強的松的組合給藥持續28天， 其中在兩個不同方案中使用兩個劑量的化合物44或強的松(在第1-5和第22-26天，Pred-1 =強的松〇.15mg/kg BID x 5;Pred-2 =強的松0.15mg/kg BID x 28)。如體外實驗數據顯 示，單獨的強的松給藥不會誘發任何有意義的抗腫瘤效果（圖20B)。與以前的研究一致， 125mg/kg BID(每日兩次）劑量的化合物44只產生部分響應，但是化合物44與0.15mg/kg BID的強的松(不是2個周期的強的松方案)組合給藥誘發了使用更高劑量的單獨化合物44 所能達到的最大可能消退。所有給藥小鼠的體重顯示在圖20C。 如在方法中說明，使用化合物44、C0P(沒有阿霉素成分的化學治療）、或其組合處理攜 帶SUDHL-10(EZH2Y646F)異種移植的小鼠28天。比較了在第28天處死的8/16只小鼠的平均 腫瘤重量，表明各組之間腫瘤重量存在顯著差異(雙尾1：檢驗，葉〈0.05，*葉〈0.01，****口〈 0.0001)。幻在兩個不同方案中使用兩個劑量的化合物44或強的松處理攜帶SUDHL10 ((EZH2Y646F)異種移植物的小鼠28天（在第1-5和第22-26天，Pred-1 =強的松0.15mg/kg BID x 5;Pred-2 =強的松0.15mg/kg BID x 28)。兩種化合物如指示的組合給藥。在頂部圖 繪制了平均腫瘤體積±SEM(n = 10)。所有被給予EPZ-6438的組在腫瘤生長方面顯示統計學 上顯著的降低（至少p〈〇. 01，在兩個方案中相對于運載體或強的松單一藥劑；重復測量 ANOVA、鄧尼特事后檢驗(Dunnett's post test))，而相比運載體，強的松單一藥劑不會引 起任何顯著的抗腫瘤效果。 表3.與化合物44組合的匯總
最后，在3個不同的EZH2突變體淋巴瘤異種移植模型中評估了腫瘤生長抑制。使用化合 物44和化學治療(CHOP或C0P(沒有阿霉素的CHOP))共同處理SCID或攜帶皮下淋巴瘤異種移 植物的裸鼠，且與單一藥劑處理進行了比較。在攜帶WSU-DLCL2異種移植物的小鼠中，所有 化合物44劑量和應用的方案實現了腫瘤生長抑制，且比單獨的CHOP化學治療更好（圖7A)。 同時，化合物44與CHOP組合療法誘發了強的抗腫瘤應答且比單獨的任何單一藥劑（p〈 0.001)(對于CHOP和化合物44分別是45%和71 % )顯著地更好的腫瘤生長抑制(93% )。所有 單一治療都被耐受;在第一個周期后化合物44/CH0P組合物組的有小的體重損失（11.3%)， 其后小鼠在下一個周期治療前恢復了。 在SU-DHL6異種移植模型中，使用單獨的CHOP或化合物44沒有觀察到顯著的腫瘤生長 抑制（圖7B，頂部圖），與貝格蘭(Beguelin)等人之前使用EZH2抑制劑GSK503發表的結果形 成對比。引人注目地，化合物44/CH0P的組合導致腫瘤消退。當在第28天停止給藥且小鼠的 腫瘤生長延遲被觀察到第60天時，這個組合導致58 %的小鼠無腫瘤地存活（圖7B，底部圖）。 CHOP的阿霉素組分具有因為它的心臟毒性具有<550mg/m2的終生累積劑量限制。因此， 調查了排除這個組分的化合物44/化學治療方案的組合益處。在第三個研究中，使用增加劑 量的化合物44(BID)、無阿霉素的化學治療方案(COP)、或COP和化合物44的組合處理攜帶 SU-DHL10異種移植物的小鼠28天，在所有化合物44劑量和包含COP的組中觀察到腫瘤生長 抑制（圖7C，頂部圖）。如通過重復測驗AN0VA和鄧尼特事后檢驗評估的，266mg/kg、532mg/kg 以及⑶P/化合物44組合治療導致與運載體顯著不同的消退(p>0.001)，其中化合物44/C0P 組合物組顯示出最好的總體響應。給藥28天后，具有最小腫瘤負荷的小鼠亞組(每組8只小 鼠）保持存活，沒有針對腫瘤生長延遲終點的進一步給藥。使用化合物44處理的小鼠具有明 顯的劑量依賴性腫瘤生長延遲益處，而COP治療的腫瘤比化合物44處理的那些進展要更快 (圖7C，中部圖）。給予小鼠最大耐受劑量的化合物44或化合物44/C0P的組合物顯示在第60 天100 %存活，而組合物組顯示最小的終點腫瘤重量，與所有其它治療組(包括化合物44的 最大耐受劑量組)存在統計學上的差異(P>〇. 05)(圖7C，底部圖）。 B細胞NHL的標準治療是組合化學治療方案，該方案包括環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和 潑尼松龍。完全響應率可以達到40 % -50 %，很大比例的患者舊病復發，而3年總體存活率僅 為約30%。復發的淋巴瘤可以對很大范圍的抗癌藥物顯示耐藥性，其給臨床上管理這些激 進的惡性腫瘤提出了嚴峻的挑戰。在淋巴瘤中獲得耐藥性的部分原因是由于腫瘤細胞的遺 傳異質性和不穩定性。從而，化療抗性NHL的成功治療將需要藥物的合理組合，這些藥物靶 向對B細胞NHL不同亞型特異的多種途徑。例如，在活化的B細胞型淋巴瘤中，NFkB途徑的組 成型活化已經涉及治療耐藥性，且幾種新型靶向療法已經在這種亞型顯示出潛力。 表觀遺傳效應物，如多梳蛋白（polycomb)，也被牽連于癌細胞的化療耐藥性。多梳蛋白 抑制復合物2(PRC2)的催化亞基EZH2是生發中心起源的B細胞淋巴瘤中的關鍵的致癌因子。 這些更原始的B細胞惡性腫瘤，尤其是表達EZH2突變體具有改變的催化活性的變體需要 EZH2來增生和存活。從臨床前研究獲得的結果預測EZH2抑制劑治療這種遺傳定義的癌癥具 有很大的潛力，且EZH2抑制劑也可緩和化學治療耐藥性。本文展現的數據顯示臨床階段 EZH2抑制劑化合物44與CHOP的組分一起顯示出從加和效應到協同效應的不同程度的組合 益處。那些組合益處被特異地在生發中心起源的淋巴瘤中發現，并且在環磷酰胺、阿霉素和 長春新堿的情況下，被限制在攜帶EZH2突變體的細胞中。當化合物44與CHOP在體內共同給 藥時，在殺死淋巴瘤細胞方面也發現顯著的協同作用。在SU-DHL6異種移植模型中尤其是這 樣，其中單一藥劑都沒有顯示顯著的抗腫瘤活性，但是該組合在>50%的小鼠中誘發了持續 的消退。這重申了過于活躍的EZH2在EZH2突變體淋巴瘤的化療耐藥性中潛在的重要性。在 CHOP組分中，化合物44與強的松的組合誘發了最強的抗增生活性，且無論EZH2突變的狀態 如何，該組合也可以使不敏感的GCB淋巴瘤細胞系對EZH2抑制敏感。另外地，當化合物44與 強的松一起給藥或以特定順序的方式給藥時這種組合益處更加明顯；因而，使用EZH2抑制 劑致敏細胞，接著使用G R激動劑處理證明特別有效。這個意外的發現對于在臨床上應用 EZH2抑制劑具有潛在的重要意義。首先，廣泛使用的GRag通常與抗癌藥物共同給藥以防止 藥物引發的過敏反應并減輕疼痛、惡心和嘔吐，而且它們在治療造血系統的惡性腫瘤中很 關鍵，因為它們在這些癌癥中具有誘發細胞凋亡的能力。相比其它的CHOP組分，GRag誘發了 最少的嚴重副作用。同時，如在SU-DHL10異種移植模型中的數據顯示，在保留與化合物44的 組合益處的同時，從CHOP方案中排除阿霉素的機會可以讓患者免受阿霉素的劑量限制的心 臟毒素副作用。最后，臨床前研究顯示單一藥劑EZH2抑制劑僅在攜帶EZH2突變體的淋巴瘤 (其代表一部分(20%)具有高的未滿足的臨床需求的GCB淋巴瘤患者）中誘發顯著的細胞死 亡。在此的這些結果顯示GRag/EZH2抑制劑組合可能在所有生發中心起源的B細胞淋巴瘤中 具有臨床實用性。 結合糖皮質激素的GR分子移動至細胞核并可以作為轉錄激活子或抑制子起作用，這取 決于細胞環境。已經表明，GR不斷地采集核小體以產生相互作用，且染色體修飾酶的目的是 給DNA提供GR的受調節的接近、它的輔因子和基本的轉錄機制。其它研究顯示GR經常結合至 原有的開放染色質區域，并識別在給定的細胞類型中的染色質結構使得GR可以以組織特異 性方式起作用。GR結合位點的可及性可以通過ATP依賴性的染色質重塑進一步提高，并且 SWI /SNF復合物在這個活動中起到關鍵的作用。不想被特定的理論或具體的機制約束，可想 象的是，由EZH2介導的H3K27超三甲基化誘發的異常染色質抑制可以阻止一些其他可及的 GR結合位點，干擾正常GR介導的基因誘導或抑制。事實上，所有EZH2突變體淋巴瘤細胞系對 GRag治療不敏感，而在EZH2野生型細胞中觀察到濃度依賴性的細胞死亡。使用潑尼松龍預 處理，接著使用化合物44處理在幾乎所有測試的細胞系中不會誘發協同作用，該觀察指出 EZH2抑制劑誘導的染色質重塑的可能是GR增加活性的速率限制性步驟。另外，PRC2已知與 SWI/SNF功能拮抗，并且SWI/SNF復合物的核心亞基（SMARCA4、ARID1A與INI 1)的下調與急性 淋巴母細胞性T細胞白血病中對潑尼松龍的耐藥性有關聯。由于INI1損失和EZH2過度激活 的關系已經在橫紋肌樣瘤中建立，調查了是否整體INI1蛋白質水平將在暴露于化合物44和 潑尼松龍的各種淋巴瘤細胞中增加，這在SWI/SNF功能增加后潛在地允許GR更多地接近它 的結合位點。 GR通路基因表達試驗揭示使用化合物44、潑尼松龍和它們的組合處理幾種GCB淋巴瘤 細胞(EZH2野生型和突變型）后增加和減少的基因表達確認了GR的雙向功能。在所有EZH2突 變體淋巴瘤細胞中與該組合協同上調的唯一基因是SESN1，它是對DNA損傷和氧化脅迫具有 細胞響應功能的TP53腫瘤抑制子。瑟斯崔因通過激活AMP活化的蛋白激酶、導致mTOR通路的 抑制來抑制細胞生長。因此，SESN1介導的mTOR通路抑制可以是化合物44處理后在EZH2突變 體淋巴瘤細胞中重新引入GRag敏感性的重要機制。 相反地，GRag/化合物44組合治療也可以在被報道為對EZH2抑制劑治療頑固的那些 EZH2突變體淋巴瘤細胞系(RL、SU-DHL4)中誘導細胞死亡。使用組合治療，SESN1也在那些細 胞系中被誘導，但是尤其是在RL和SU-DHL4細胞中觀察到另外的TNF (強的炎性細胞因子)協 同上調。這一觀察似乎令人驚訝，因為TNF和糖皮質激素通常拮抗作用。TNF通過它的受體 TNFR-1可以誘導細胞凋亡，但是也具有轉換生存信號的能力，主要是通過NFkB通路。因而， 有可能在GR激動劑抑制NFkB介導的轉錄的背景下由化合物44/潑尼松龍組合誘導的增加的 TNF表達可以轉變TNF作用朝向細胞凋亡。然而，為什么在化合物44不敏感的EZH2突變體細 胞中這種機制會導致協同的細胞死亡還不清楚。我們觀察到的GILZ在使用該組合的6個細 胞系的2個中被協同地上調，其進一步支持了在GRag耐藥性中NFkB通路的負調節因子的異 常抑制的潛在重要性和介導它的EZH2的潛在作用。 方法 培養基通量試驗 淋巴瘤細胞被接種進燒瓶(WSU-DLCL2和D0HH2為50，000細胞/mL，SU-DHL10為10，000細 胞/mL，以及特萊多為100,000細胞/11^)，并且使用7個劑量的化合物44預處理或使用01^0預 處理4天或對于特萊多試驗預處理6天。然后細胞分為50,000細胞/111以131]-01(^2和00冊2) 或30,000細胞/11^(31]-0見-10)，并且使用即0300數字分配器〇6〇 &11)用化合物44和感興趣 的化合物共處理。兩種藥物進行連續稀釋2倍，并在跨平板的斜對角具有恒定比率的矩陣中 進行組合，最終DMSO含量為0.11 % (v/v)。共處理3天(對于特萊多試驗是5天)后，通過ATP含 量使用CellTiter-Glo? (Promega公司）測量了細胞活力，并且使用SpectraMax M5酶標儀 (分子器件公司(Molecular Devices))檢測了發光。 使用Chou-Talalay方法對藥物組合進行了協同作用定量(參考文獻1)。組合指數(CI) 方程式提供了加和作用(CI = 1)、協同作用(CI〈1)和拮抗作用(CI>1)的數量定義。此公式采 用來自恒定比例的藥物組合的分數效應(Fa)值來確定CI值。所得的曲線圖（Fa-CI曲線圖） 示出了由95 %置信區間括號內的所得CI值。這些Fa-CI曲線圖是使用Windows軟件Cal cusyn 產生的（參考文獻2)<XI值〈1且置信區間線也低于1表明統計學上顯著的協同作用。 用于藥物組合，其中只有一種藥物顯示出超過50%的抑制，對效力位移進行了測定。劑 量響應使用圖板棱柱(GraphPad Prism)作圖，并且50%或60%的抑制濃度從劑量響應曲線 內推。當劑量響應的置信區間不重疊時，效力位移被認為是顯著的。 細胞系、化合物、和治療概述 ￥51]-01(^2、51]-01〇0、此、51]-014、0(：1-1^19和00冊2在以前描述過（自然化學生物學 (NatChemBio)，2012)。對于組合物研究，使用我們在懸浮細胞中增生測定的修改版本，如先 前所述(Daigle等人，癌細胞(Cancer Cell)，20卷，1.53-65頁（2011) ;Daigle等人，血液 (Blood) 121，13,2533-2541 (2013))。簡要地說，在第0天，將細胞一式三份以初始密度接種 于96孔平板，以確保4天以上的線性對數生長期。使用化合物44的任一劑量曲線(在liiM的頂 劑量開始）、潑尼松龍（目錄號和制造商）的單劑量(比該藥物的第4天IC50低10倍以上的濃 度)或化合物44和潑尼松龍的組合處理細胞。在第4天，在番石榴easyCyte流式細胞儀中使 用Viacount試劑計數細胞，并且活細胞數目用于以原始密度重新鋪板細胞另外3天。使用化 合物44預處理的細胞接受連續的單獨的化合物44或化合物44與潑尼松龍的組合(恒定劑 量）；接受潑尼松龍預處理的細胞接受連續的潑尼松龍或潑尼松龍和化合物44的組合;共處 理4天的細胞繼續接受7天的共處理。 異種移植研究 所有涉及到動物處理的過程，本研究中的護理和治療方法是根據CRL皮埃蒙特和上海 化學伙伴的機構動物護理和使用委員會（IACUC，Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)of CRL Piedmont and Shanghai ChemPartner)核準的準則以及實驗動 物管理評估和評審委員會(AAALAC，Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)的指導意見進行。WSU-DLCL2、SU-DHL6或SU-DHL10細胞在中期對 數生長期間收獲，并重新懸浮于含有50%基質膠?(BD Biosciences公司）的roS中，并注射 到免疫缺陷小鼠中。每只小鼠在右脅皮下接受1 X 107個細胞(0.2毫升細胞懸浮液），且一旦 腫瘤達到預定大小，小鼠在不同時間口服不同劑量的化合物44持續至28天和/或按以下方 案服用CH0P/C0P:環磷酰胺經腹腔（i . p.)給藥，且阿霉素和長春新堿分別經推注尾靜脈注 射（i . v.)給藥;在SU-DHL6研究中在第1天和第8天每種每天給藥一次，在WSU-DLCL2和SU-DHL10研究中在第1天和第22天每種每天給藥一次。強的松經口服給藥進行兩個5天劑量的 周期，在SU-DHL6研究中起始于第1和8天（（qdX5)X2,第1和8天），并且在WSU-DLCL2和SU-DHL10研究中在第1和22天（（qd X 5) X 2，第1和22天）。每個劑量被遞送0.2mL/20g小鼠 (10mL/kg)的體積，并針對各個動物的最后記錄的重量進行調整。每周兩次收集腫瘤測量和 體重，所有研究持續28天。為了在SU-DHL10和SU-DHL6研究中確定腫瘤生長延遲，當腫瘤達 到2000立方毫米的終點體積或在研究的最后一天(第60天）（無論哪種情況居先)對每個測 試動物實施安樂死。 定量PCR 使用DMS0、lyM化合物44(SU-DHL10使用100nM化合物44處理）、低于4天IC5Q 10倍濃度 的潑尼松龍、或藥物的組合平行處理151]-01(^2、51]-01〇0、此、51]-0乩4、0(：1-1^19和00冊2 細胞4天。細胞被收集且總mRNA使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen;74134)從細胞沉淀中 提取。對于RT2糖皮質激素信號PCR試驗（RT2Glucocorticoid Signaling PCR array) (Qiagen;PAHS-154ZE-4)，使用RT2第一鏈試劑盒（RT2First Strand Kit)(Qiagen;330401) 制備cDNA。使用RT2SYBR Green ROX qPCR Mastermix(Qiagen;330521)，在ViiA 7實時PCR 系統[應用生物系統公司(Applied Biosystems)(AB)]上進行陣列RT-PCR分析。基因表達歸 一化至陣列的B2M且使用A A Ct方法計算相對于DMS0的倍數變化。為了驗證陣列中的數據， 使用TaqMan Fast Advanced Master Mix(AB;4444964)和針對瑟斯崔因（AB;Hs00902787_ ml)和TNF(AB; HsOl 113624_ml)的TaqMan引物/探針組來執行基于TaqMan探針的qPCR。如上 述計算倍數變化，歸一化至RPLP0(AB; 4333761F)。 ELISA 如上所述，組蛋白從腫瘤樣品中提取。以當量濃度在涂層緩沖液(PBS+0.05 % BSA)中制 備組蛋白，得到0.5ng/yl的樣品，并將100y 1的樣品或標準品一式兩份加入到2個96孔ELI SA 板(熱實驗室系統公司（Thermo Labsystems)，Immulon 4HBX#3885)。將平板密封并在4°C溫 育過夜。第二天，使用300yl/孔PBST(PBS+0.05%Tween 20;10X PBST，KPL#51-14-02)在Bio Tek洗板器上洗滌平板3次。用300y 1/孔稀釋液(PBS+2 % BSA+0.05 % Tween 20)封閉平板，在 室溫下溫育2小時，并用PBST洗滌3次。所有抗體在稀釋液中稀釋。100yl/孔的抗H3K27me3 (〇5丁#9733,50%甘油儲液1:1，000)或抗總113(41?^1113131791，50%甘油1:10,000)被添加到 每個平板。平板在室溫溫育90分鐘并使用TOST洗滌3次。將100yl/孔的抗Rb-IgG-HRP(細胞 信號技術公司（Cell Signaling Technology)，7074)以1:2,000加入到H3K27Me3平板并以 1:6，000加入到H3平板，并在室溫溫育90分鐘。將平板在TOST中洗滌4次。對于檢測，加入100 yl/孔TMB底物(BioFx實驗室公司（BioFx Laboratories)，#TMBS)并且將平板在室溫暗處溫 育5分鐘。使用100yl/孔IN H2S〇4停止反應。在SpectraMax M5酶標儀上讀取450nm的吸光值。 表4a.對0CI細胞系進行的RT2糖皮質激素信號PCR陣列分析的Ct值和倍數變化。
[0209]表4b.對D0HH2細胞系進行的RT2糖皮質激素信號PCR陣列分析的Ct值和倍數變化。
表4c.對WSU細胞系進行的RT2糖皮質激素信號PCR陣列分析的Ct值和倍數變化。
實例2.
化合物44和依維莫司協同作用增強在EZH2突變WSU-DLCL2細胞中G1期的細胞周期阻滯 和在野生型EZH2SU-DH-L5細胞中的細胞凋亡 在圖11的圖B和E中，每個點代表在細胞凋亡早期和晚期門控細胞百分比的平均值(膜 聯蛋白-V陽性，平均值+/-S. D.，n = 3)。在圖C和F中，漸進曲線上的點代表門控細胞的DNA含 量的平均百分比（PI陽性，平均值+/_S.D.，n = 2)。在圖A中，使用化合物44和依維莫司的組 合以400 :1的恒定比例處理WSU-DLCL2細胞。該組合被證明誘導很強的協同作用，CI值為 0.34-0.003。在圖8)中，在使用化合物44(500恤）、依維莫司（51^)或組合在同一濃度處理的 WSU-DLCL2細胞中評估細胞凋亡水平。沒有觀察到WSU-DLCL2細胞凋亡的增加。在圖C中，相 比單獨的化合物44,共處理后觀察到細胞周期G1期顯著的增加。在圖D中，組合以4000: 3的 恒定比例處理SU-DHL-5細胞。該組合被證明誘導很強的協同作用，CI值為0.135-0.008。在 圖E中，相比單獨的化合物44，共處理(500nM化合物44，0.75nM依維莫司）后測量了膜聯蛋白 陽性細胞的顯著增加(P〈〇.0001)。在圖F中，共處理后觀察到細胞周期G1亞期顯著的增加。 實例3 化合物44和依魯替尼協同作用增強在EZH2突變WSU-DLCL2細胞和野生型EZH2SU-DH-L5 細胞中的細胞凋亡 在圖12的圖B和E中，每個點代表在細胞凋亡早期和晚期門控細胞百分比的平均值(膜 聯蛋白-V陽性，平均值+/-S. D.，n = 3)。在圖C和F中，漸進曲線上的點代表門控細胞的DNA含 量的平均百分比（PI陽性，平均值+/_S.D.，n = 2)。在圖A中，使用化合物44和依魯替尼的組 合以4: 5的恒定比例處理WSU-DLCL2細胞。這些藥劑的組合顯示強的協同作用，CI值為0.39 和0.14之間。在圖B中，在使用化合物44(500nM)、依魯替尼(625nM)或組合處理的WSU-DLCL2 細胞中評估細胞凋亡水平。這一組合揭示了 WSU-DLCL2細胞的協同的時間依賴性的細胞凋 亡增加。在圖C中，組合治療后細胞周期分析揭示處于G1期的WSU-DLCL2細胞的百分比具有 陡然的時間依賴性增加。在圖D中，化合物44:依魯替尼以1: 5的恒定比例處理SU-DHL-5細 胞。該組合被證明誘導很強的協同作用，CI值為0.222-0.002。在圖E中，與化合物44單獨相 比，使用化合物44(1000nM)和依魯替尼（2500nM)共同處理后，聯蛋白陽性染色的SU-DHL-5 細胞的協同性和時間依賴性增加(P〈〇.0001)。在圖F中，相比每個藥劑單獨處理，組合處理 的SU-DHL-5細胞的細胞周期分析揭示共處理后處于G1亞期群體的細胞增加。 實例4 化合物44和MK-2206協同作用增強在EZH2突變WSU-DLCL2細胞和野生型EZH2 (SU-DH-L5 和OCI-LY-19)細胞中的細胞凋亡。 在圖13的圖A中，使用化合物44和MK-2206的組合以4:1的恒定比例處理WSU-DLCL2細 胞。Fa-CI曲線圖證明很強的協同作用，CI值為0.77-0.005。在圖B中，當使用化合物44 (2000nM)和MK-2206 (400nM)共處理時，膜聯蛋白陽性WSU-DLCL2細胞百分比時間依賴性增 加。在圖C中，相比化合物44單獨處理，組合治療1天后細胞周期分析揭示處于G1期的WSU-DLCL2細胞的百分比具有陡然的時間依賴性增加化〈0.0001)。在圖0中，化合物44:1?-2206 以2:1的恒定比例處理SU-DHL-5細胞。該組合誘導很強的協同作用，CI值為0.276-0.001。在 圖E中，相比單獨的化合物44,共處理（500nM的化合物44,250nM的MK-2206)24小時后，SU-DHL-5的細胞凋亡水平評估揭示膜聯蛋白陽性細胞增加(p〈0.0001)。在圖F中，相比藥劑單 獨處理，組合處理的SU-DHL-5細胞的細胞周期分析揭示處于G1亞期的群體的細胞的百分比 增加。在圖G中，使用化合物44與MK-2206組合處理觀察到在OCI-LY19細胞中強的協同作用， 1/a值為71.4。在圖11中，相比單獨的化合物44，當使用組合（1000碰的化合物44,2500碰的 MK-2206)處理OCI-LY19細胞時顯示時間依賴的細胞凋亡增加(p〈0.0001)。在圖I中，使用該 組合處理的OCI-LY19細胞的細胞周期分析揭示處于細胞周期的G1亞期中的細胞的時間依 賴增加(P〈〇. 0001)。 實例5 使用化合物44與BCR通路抑制劑調節靶標基因 在圖14的圖A中，相比單一藥劑，在WSU-DLCL2細胞中使用化合物44和依魯替尼組合后 EGR1(40倍)和F0S(4倍)下調。在圖B中，相比單一藥劑，在WSU-DLCL2細胞中使用化合物44和 MK-2206組合后AICDA(3倍)和TCL1A| (5倍）上調。在圖C中，相比單一藥劑，在SU-DHL-5細胞 中使用化合物44和依魯替尼組合后GJA1(3倍)上調。統計分析的值是兩個重復或三個重復 的平均+/-SD。t 檢驗，*P〈0 ? 05，**P〈0 ? 01，***P〈0 ? 001，****P〈0 ? 0001。 實例6 在生發中心B細胞系中EZH2抑制和BCR信號通路的調節之間、BCL2抑制和GR激動之間的 協同作用。 在這項研究中使用在DLBCL生物學中暗示的信號通路中的關鍵成員揭示了一些協同作 用組合（參見圖15)。當與EZP-6438組合(EZP-6438將EZH2抑制的影響從攜帶突變體EZH2GCB 細胞系延伸向野生型亞型的那些)時，祀向B細胞受體通路節點（例如PI3K/Akt/mTOR信號級 聯的那些，MAPK級聯中的MEK1 /2，SYK和BTK)的抑制劑表現出很強的協同作用。BCL-2家族蛋 白質的抑制劑、奧巴克拉、納威托克斯和ABT-199與化合物44的組合顯示出協同的抗增生活 性。糖皮質激素受體激動劑、潑尼松龍和地塞米松在突變體細胞系中顯示EZH2抑制顯著的 增加且使野生型對EZH2i敏感。利妥昔單抗，該抗體與化學治療劑R-CHOP組合靶向cd-20在 體外在突變體細胞系中引起增強的抗增生效應。 實例7 化合物44和依維莫司的協同作用減少突變體WSU-DLCL2細胞的處于S和G2/M期的細胞 群并且減少野生型SU-DHL-5細胞的處于Gl、S和G2/M期的細胞群。 WSU-DLCL2、SU-DHL-5和OCI-LY19(數據未顯示)細胞的預處理是使用化合物44(針對 WSU和SU-DHL-5是500nM)，接著使用化合物44和依維莫司組合共處理(WSU: 5nM，SU-DHL-5: 0.75nM)。在圖16的圖A中，當使用單一藥劑或組合治療WSU-DLCL2細胞時，沒有觀察到細胞 周期G1亞期方面的變化。在圖B和C中，當使用該組合治療WSU-DLCL2細胞時，分別觀察到處 于細胞周期的S期和G2/M期中細胞的協同時間依賴性減少。在圖D、E和F中，對SU-DHL-5細胞 上組合治療48小時后分別觀察到處于細胞周期的G1、S、G2/M期中的細胞的協同減少。 實例8 化合物44和依魯替尼協同作用減少突變體WSU-DLCL2細胞與野生型SU-DHL-5細胞的處 于G1、S和G2/M期的細胞群。 WSU-DLCL2、SU-DHL-5和OCI-LY19(數據未顯示）細胞的預處理是使用化合物44(WSU: 500nM，SU-DHL-5:1000nM)，接著使用化合物44和依魯替尼組合共處理(WSU: 625nM，SU-DHL-5:2500nM)。在圖17的圖A、B、C中，相對于化合物44或依魯替尼作為單一藥劑，對WSU-DLCL2 細胞組合治療24小時后分別觀察到處于細胞周期的Gl、S、G2/M期中的細胞的協同減少。在 圖D、E、F中，相對于化合物44或依魯替尼作為單一藥劑，對SU-DHL-5細胞組合治療后分別觀 察到處于細胞周期的Gl、S、G2/M期中的細胞的協同時間依賴性減少。 實例9 化合物44和MK-2206協同作用減少突變體WSU-DLCL2細胞與野生型SU-DHL-5和0CI-LY19細胞的處于Gl、S和G2/M期的細胞群。 WSU-DLCL2、SU-DHL-5和0CI-LY19細胞的預處理是使用化合物44(分別是2000nM、500nM 和lOOOnM)，接著使用化合物44和Mk-2206(分別是400nM、250nM和2500nM)的組合共處理。在 圖18的圖A中，當使用MK-2206組合治療WSU-DLCL2細胞時觀察到細胞周期的G1期的協同時 間依賴性減少。在圖B和C中，當組合治療WSU-DLCL2細胞時，分別觀察到處于細胞周期的S期 和G2/M期的細胞的協同減少。在圖D、E和F中，相對于單一藥劑，對SU-DHL-5細胞上組合治療 48小時后分別觀察到處于細胞周期的Gl、S、G2/M期中的細胞的協同減少。在圖G、H和I中，當 組合治療OCI-LY19細胞時，分別觀察到處于細胞周期的Gl、S和G2/M期中的細胞的協同時間 依賴性減少。 使用化合物44與各個S0C或其它選擇的藥劑的組合針對野生型DLBCL細胞系和攜帶 EZH2突變體的DLBCL細胞系進行的增生研究的結果顯示在表5中。 表5.增生研究結果。
CR=組合比例，Cl =組合指數 在分數效應以上的、0.5的CI范圍 a_基于實驗1，其它實驗是6438與藥物單獨的最高濃度之間的IC5Q轉變值，因為使用化 合物44沒有獲得50 %抑制 b_不能計算a值，因此報道了 IC5Q轉變 C-DOHH2數據，歸一化至單個6438濃度而不是DMSO d_利妥昔單抗的濃度是yg/mL e-這些CI值與1不是顯著地不同 用于增生實驗的化合物的效力和用于每個細胞系的劑量范圍顯示在表6中。 表6 ?化合物效力和劑量范圍。
a-利妥昔單抗的濃度是yg/mL 列出的IC5Q值是給藥3天后計算的，除了特萊多，其給藥是5天 化合物44IC5Q對于所有細胞系是7天后計算的，除了特萊多是處理11天后計算的 引用參考 在本說明書中所引用的所有公開以及專利文件都通過引用以其全部內容結合在此，就 像這樣的公開或文件被確切地并且個別地指出通過引用被結合一樣。公開和專利文件的引 用不旨在為承認任何這些是相關的現有技術，也不構成對關于相同內容或日期的任何承 認。本發明現在已經通過書面描述的方式進行了描述，本領域的技術人員將認識到本發明 可以以各種實施例的方式來實施，并且在前面的描述和下面的實例是為了說明的目的，而 不是限制后面的權利要求。 等同方案 可以按其他具體形式實施本發明而不背離本發明的精神或本質特征。因此，上述的實 施例被認為在所有方面是用作說明的而不是對在此所描述的本發明進行限制。因此，本發 明的范圍是由所附的權利要求書而不是通過上述的說明來指明的，并且在權利要求書的等 效性的含義和范圍之內的所有變化均旨在涵蓋于其中。
【主權項】
1. 一種在有需要的患者中治療癌癥的方法，該方法包括給予治療有效量的EZH2抑制劑 和治療有效量的標準治療藥劑。2. -種在有需要的患者中治療癌癥的方法，該方法包括給予包括EZH2抑制劑和標準治 療藥劑的、治療有效量的組合。3. -種在有需要的患者中治療癌癥的方法，該方法包括給予包括EZH2抑制劑和標準治 療藥劑的、治療有效量的組合物。4. 如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述癌癥是非霍奇金淋巴瘤。5. 如權利要求4所述的方法，其中所述非霍奇金淋巴瘤是DLBCL(彌漫性大B細胞淋巴 瘤)或GCB(生發中心B細胞樣)淋巴瘤。6. 如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述癌癥是EZH2野生型癌癥。7. 如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述癌癥的特征為在H3K27處增加的三 甲基化。8. 如權利要求5所述的方法，其中所述淋巴瘤是EZH2突變體淋巴瘤。9. 如權利要求8所述的方法，其中所述EZH2突變體淋巴瘤具有Y646、A682或A692突變。10. 如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述癌癥是EZH2抑制劑抗性或難治性 癌癥。11. 如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述標準治療藥劑是選自下組的一種 或多種化合物，該組由以下各項組成:R-CHOP組分、BCL抑制劑或BCR抑制劑。12. 如權利要求11所述的方法，其中所述R-CHOP是糖皮質激素受體激動劑。13. 如權利要求12所述的方法，其中所述糖皮質激素受體激動劑是潑尼松龍或地塞米 松。14. 如權利要求11所述的方法，其中從R-CHOP排除阿霉素。15. 如權利要求11所述的方法，其中所述BCL抑制劑是納威托克斯、奧巴克拉或ABT- 199〇16. 如權利要求11所述的方法，其中所述BCR抑制劑是PI 3K/Akt/mTOR信號級聯抑制劑。17. 如權利要求11所述的方法，其中所述BCR抑制劑是利妥昔單抗、MK-2206、艾代拉里 斯、曲美替尼、塔瑪塔尼伯、依維莫司、VELCADE、或依魯替尼。18. 如權利要求1-17中任一項所述的方法，其中所述EZH2抑制劑是具有以下化學式的 化合物44:或其藥學上可接受的鹽。19. 如權利要求18所述的方法，其中所述EZH2抑制劑和所述標準治療藥劑是同時或依 次給予。20. 如權利要求18所述的方法，其中所述EZH2抑制劑是在所述標準治療藥劑給藥之前 給予。21. 如權利要求18所述的方法，其中至少一個基因在患者中上調。22. 如權利要求21所述的方法，其中所述基因選自下組，該組由以下各項組成：瑟斯崔 因、TNF、和 GILZ。23. 如權利要求21所述的方法，其中所述基因是糖皮質激素靶基因。24. 如權利要求21所述的方法，其中基因的上調被用于確定或調整如權利要求1所述的 EZH2抑制劑的治療有效量。25. 如權利要求21所述的方法，其中基因的上調被用于確定或調整如權利要求1所述的 標準治療藥劑的治療有效量。26. -種針對如權利要求1所述的治療方法對患者進行篩選的方法，其中基于選自下組 的一個或多個基因的表達譜來篩選所述患者，該組由以下各項組成：瑟斯崔因、TNF、和 GILZ〇 2 7.如權利要求1至3中任一項所述的治療方法，其中所述患者具有瑟斯崔因 、T N F或 GILZ的上調表達。
【文檔編號】A61K31/5377GK105873592SQ201480071510
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年12月8日
【發明人】海克·凱爾哈克, 薩拉·K·克努森, 凱文·W·孔茨
【申請人】Epizyme股份有限公司