脂質體顆粒、制備所述脂質體顆粒的方法以及其用圖

脂質體顆粒、制備所述脂質體顆粒的方法以及其用圖
【專利摘要】被稱為小單層囊泡(SUV)的脂質體可在20?50nm大小范圍內合成，但遭遇如不穩定性和導致顆粒間融合的聚集的挑戰。這限制其作為治療遞送劑的用途。經由連接陰離子實體如DNA/RNA來增加SUV的表面負電荷使這些囊泡的膠體穩定性提高。另外，不同于其線性對應物，核酸的致密球形布置和徑向取向表現出獨特的化學和生物特性。這些脂質體是無毒的，并且雖然是陰離子的，但能夠以非免疫原性方式有效地進入細胞而無需輔助陽離子轉染劑的幫助。這些例外特性允許其用作不同療法中的基因調控的遞送劑并且提供金屬核心球形核酸的替代平臺。
【專利說明】脂質體顆粒、制備所述脂質體顆粒的方法以及其用途
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 根據美國法典第35篇第119條(e)款，本申請要求2013年12月3日提交的美國臨時 申請第61/911,334號和2014年4月21日提交的美國臨時申請第61/982,269號的優先權，其 公開內容以引用的方式整體并入本文。
[0003] 政府利益聲明
[0004] 本發明是根據由美國國防部高級研究計劃局（Defense Advanced Research Project Agency)授予的HR0011-13-2-0018和由美國國立衛生研究院（National Institutes of Health)授予的CA151880在政府支持下進行的。政府對本發明具有某些權 利。
[0005] 序列表
[0006] 本申請含有呈計算機可讀形式的序列表(文件名：2013-201_SeqListing.txt;倉|J 建:2014年12月3日；1，893字節)作為公開內容的單獨部分，所述序列表以引用的方式整體 并入本文。 發明領域
[0007] 本公開涉及脂質體顆粒、制備所述脂質體顆粒的方法以及其用途。脂質體顆粒適 用于基因調控和藥物遞送。 技術背景
[0008] 已探索化學來產生脂質體和小單層囊泡（SUV)。例如，Vogel等人，〃 DNA Controlled Assembly of Lipid Membranes〃，美國專利公布號2010/0144848公開用兩個 親脂性錨修飾的DNA可形成脂質體或SUV。這種后修飾技術不利于高表面密度修飾。
[0009] Hook等人，"Oligonucleotides Related to Lipid Membrane Attachment"，羞星 專利公布號2013/0252852描述所產生的脂質體或SUV具有寡核苷酸，所述寡核苷酸具有核 酸的第一鏈和第二鏈以及位于其末端中的兩個或更多個疏水性錨定部分，其中所述疏水性 錨定部分在雙層中發現。因為兩個膽固醇分子用于將分子錨定至脂質雙層中，所以這種后 修飾技術不利于高表面密度修飾。
[0010] Lu等人，''Amphiphi 1 ic Substances and Functionalized Lipid Vesicles Including the Same〃，美國專利公布號2010/0166842描述包含彼此雜交的至少兩個核苷 酸區段的脂質體SUV。這種基于囊泡的非后修飾技術在穩定囊泡方面不那么有效，因為它在 紙質雙層的兩側上均并入穩定化部分。
[0011] 非專利文獻也揭示了用于產生脂質體和SUV的化學，但這些化學各自也具有其問 題。例如，"Liposome-Anchored Vascular Endothelial Growth Factor Aptamers" Bioconjugate Chem.，1998,9,573-582描述了適體DNA功能化的脂質體的合成以及其針對 選擇性癌細胞靶向的應用。通過這種方法產生的大小為平均80納米的脂質體在雙脂質層的 兩側上均具有適體DNA分子，并且未展示基因調控。
[0012] ''Reversible Cell-Specific Drug Delivery with Aptamer-Functionalized Liposomes〃Angew.Chem. Int .Ed. 2009,48，6494_6498描述適體0嫩功能化的脂質體的合成 以及其針對選擇性癌細胞靶向和藥物遞送的應用。通過這種方法產生的平均140納米與200 納米之間的脂質體利用膽固醇單元來將DNA錨定至雙脂質層中，在雙脂質層的兩側上均包 含適體DNA分子，并且未表現出基因調控。
[0013] ''Selective delivery of an anticancer drug with aptamer-functionalized liposomes to breast cancer cells in vitro and in vivo〃J.Mater.Chem.B，2013,1， 5288公開了適體DNA功能化的脂質體的合成以及其針對選擇性癌細胞靶向和藥物遞送的應 用。此工作是在以上"Reversible Cell-Specific Drug Delivery with Aptamer-Functionalized Liposomes"中公開的研究的延伸。如同之前，這些顆粒利用膽固醇單元來 將DNA錨定至脂質雙層中，在雙脂質層的兩側上均包含適體DNA分子，并且未表現出基因調 控。
[0014] "Phospholipid Memb ranes Decorated by Cholesterol-Based Oligonucleotides as Soft Hybrid Nanostructures"J.Phys.Chem.B，2008,112,10942-10952表征了膽固醇DNA功能化的脂質體。在該報道中，大小為33至35nm的脂質體是從1-棕 櫚酰基-2-油酰基磷脂酰膽堿(P0PC)脂質制備的且用膽固醇修飾的DNA分子后功能化。所述 報道未展示基因調控，并且這些顆粒利用膽固醇單元來將DNA錨定至脂質雙層中。
[0015] ''Bivalent Cholesterol-Based Coupling of Oligonucleotides to Lipid Membrane Assemblies"】· Am.Chem. Soc · 2004，126，10224-10225描述了用于錯定至脂質雙 層中的含有兩個膽固醇單元的部分雙鏈體的DNA鏈的開發。使用兩個膽固醇單元來將DNA鏈 錨定至脂質雙層中導致與脂質體締合的寡核苷酸的表面密度降低。
[0016] 在〃Quantification of Oligonucleotide Modifications of Small Unilamellar Lipid Vesicles〃Anal .Chem.2006,78,7493-7498中，研究者描述了用于定量 功能化的脂質體納米顆粒上的DNA鏈的技術的發展。所描述的顆粒包含含有用于錨定至脂 質雙層中的兩個膽固醇單元的部分雙鏈體的DNA鏈。使用兩個膽固醇單元來將DNA鏈錨定至 脂質雙層中導致與脂質體締合的寡核苷酸的表面密度降低。
[0017] "Single-Molecule Detection and Mismatch Discrimination of Unlabeled DNA Targets〃Nano Lett.2008,8,183-188公開了用含有兩個膽固醇單元的部分雙鏈體的 DNA鏈功能化的100納米大小的脂質體。此工作是在上述〃Bivalent Choiesterol-Based Coupling of Oligonucleotides to Lipid Membrane Assemblies〃和〃Quantification of Oligonucleotide Modifications of Small Unilamellar Lipid Vesicles〃中公開的 研究的延伸。如同之前，這些顆粒包含含有用于錨定至脂質雙層中的兩個膽固醇單元的部 分雙鏈體的DNA鏈。使用兩個膽固醇單元來將DNA鏈錨定至脂質雙層中導致與脂質體締合的 寡核苷酸的表面密度降低。
[0018] "DNA-Induced Programmable Fusion of Phospholipid Vesicles" J .Am. Chem. Soc. 2007，129，9584-9585是關于膽固醇DNA功能化的脂質體納米顆粒的融合的 分析論文。在此論文中利用的囊泡是至少100納米大小。
[0019] ''Determinants for Membrane Fusion Induced by Cholesterol-Modified DNA Zippers〃J. Phys. Chem. B，2008，112，8264-8274是關于膽固醇DNA功能化的脂質體納米顆粒 的融合的分析論文，并且是來自上述〃DNA-Induced Programmable Fusion of Phospholipid Vesicles〃的工作的繼續。此論文將序列特異性融合與利用含有兩個膽固醇 單元的部分雙鏈體的DNA鏈組合用于將寡核苷酸錨定至脂質雙層中（例如，在以上〃 Quantification of Oligonucleotide Modifications of Small Unilamellar Lipid Ves ic 1 es〃中發現的部分雙鏈體的DNA鏈）。
[0020] ''Liposome-Based Chemical barcodes for Single Molecule DNA Detection Using Imaging Mass Spectrometry〃Nano Lett .,2010,10,732-737是關于取決于DNA序列 檢測特異性DNA靶標的分析論文。這是來自報道將序列特異性融合與不同的DNA錨定組合 的"DNA-Induced Programmable Fusion of Phospholipid Vesicles"的同一組的工作的 延伸（使用雙膽固醇基錨，參見:Anal. Chem. 2006，78，7493-7498)。
[0021] ''Programmable Assembly of DNA-Functionalized Liposomes by DNA〃是公開 膽固醇DNA功能化的脂質體的組裝的分析論文。在所述報道中，合成具有114和251nm流體動 力學直徑的脂質體并且用膽固醇修飾的DNA分子合成后功能化。在所述報道中的顆粒利用 寡核苷酸分子膽固醇錨定至脂質雙層中。
[0022] 發明概述
[0023]脂質體是由一個或數個具有親水性核心的疏水性脂質雙層組成的在變化大小范 圍內的球形自封閉結構。這些基于脂質的載體的直徑在〇 . 15-1微米范圍內，所述直徑顯著 高于20-100納米的有效治療范圍。被稱為小單層囊泡(SUV)的脂質體可在20-50納米大小范 圍內合成，但遭遇如不穩定性和導致顆粒間融合的聚集的挑戰。這種顆粒間融合限制SUV在 治療劑中的使用。
[0024] 為了對抗這種不穩定性，SUV可以通過兩種獨特技術用聚合物、肽、DNA以及其他目 標分子進行功能化。在第一種方法中，在脂質體合成過程中將目標修飾的分子添加至脂質、 脂質膜或水合緩沖液的混合物。這種方法產生在脂質體膜的內層和外層兩者上含有目標功 能分子的脂質體。一般而言，通過這種方法產生的結構在小于80納米(nm)的大小下是不穩 定的。在替代方法中，SUV可通過將目標底物錨定至預先形成的囊泡的脂質雙層中來制備 ("后修飾技術"）。這種替代方法產生在脂質體膜的外層上含有目標功能分子的脂質體納米 顆粒。重要地，這種替代后修飾方法允許產生任何大小、甚至小于50納米的脂質體。
[0025] 因此，一方面，本公開提供一種包含親脂性端和非親脂性端的構造。在一些實施方 案中，所述親脂性端包含生育酚。在另外實施方案中，生育酚選自由α-生育酚、β-生育酚、 γ -生育酚以及&生育酚組成的組。
[0026] 在其他實施方案中，所述非親脂性端是帶電荷的聚合物。在一些實施方案中，帶電 荷的聚合物是寡核苷酸。在相關實施方案中，寡核苷酸包含RNA或DNA，并且在各種實施方案 中，RNA是執行調控功能的抑制性RNA(RNAi)。在又其他實施方案中，RNAi選自由小抑制性 RNA(siRNA)、與雙鏈DNA形成三鏈體的RNA以及核酶組成的組。在另外實施方案中，RNA是 piwi-相互作用RNA(piRNA)，或RNA是執行調控功能的微RNA。在一些實施方案中，DNA是反義 DNA〇
[0027] 另一方面，本公開提供一種制備本公開的構造的方法，所述方法包括提供寡核苷 酸，提供亞磷酰胺修飾的生育酚，并且使所述寡核苷酸暴露于所述亞磷酰胺修飾的生育酚 以制備本公開的構造。
[0028] 另一方面，本公開提供一種脂質體顆粒，所述脂質體顆粒具有大致上球形的幾何 形狀，所述脂質體顆粒包含脂質雙層，所述脂質雙層包含多個脂質基團；以及寡核苷酸。
[0029] 在各種實施方案中，本公開考慮所述多個脂質基團包含選自由脂質的磷脂酰膽 堿、磷脂酰甘油以及磷脂酰乙醇胺家族組成的組的脂質。
[0030] 在各種實施方案中，所述脂質選自由以下各項組成的組：1，2_二油酰基-sn-甘油 基-3-磷酸膽堿(D0PC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰膽堿(DMPC)、1-棕櫚酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰膽堿(P0PC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸-0--rac-甘油）（DSPG)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-0- -rac-甘油）(D0PG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸 膽堿(DSPC)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺（DOPE)、以及1，2-雙十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺 (DPPE)〇
[0031] 在其他實施方案中，寡核苷酸是含有親脂性栓系基團的寡核苷酸-脂質綴合物，其 中所述親脂性栓系基團被吸附至脂質雙層中。在各種實施方案中，所述親脂性栓系基團包 含生育酚或膽固醇。
[0032] 本公開還考慮在各種實施方案中，生育酚選自由生育酚衍生物α-生育酚、β-生育 酚、γ -生育酚以及生育酚組成的組。在其他實施方案中，本公開還考慮所述親脂性栓系 基團（即，脂質錨)包含例如但不限于棕櫚酰基、二棕櫚酰基、硬脂基或二硬脂基。
[0033]在其他實施方案中，寡核苷酸包含RNA或DNA。在另外實施方案中，RNA是非編碼 RNA，并且在其他實施方案中，非編碼RNA是抑制性RNA(RNAi)。本公開還考慮在一些實施方 案中，RNAi選自由小抑制性RNA(siRNA)、與雙鏈DNA形成三鏈體的單鏈RNA(ssRNA)以及核酶 組成的組。在其他實施方案中，RNA是微RNA。在一些實施方案中，DNA是反義DNA。
[0034] 在各種實施方案中，所述脂質體顆粒的直徑小于或等于約50納米。關于表面密度， 本公開提供組合物和方法，其中脂質體顆粒包含約10至約100個寡核苷酸，或約10至約80個 寡核苷酸。在一些實施方案中，所述顆粒包含70個寡核苷酸。
[0035] 在一些實施方案中，寡核苷酸是修飾的寡核苷酸。
[0036] 在本公開的另一方面，提供一種制備脂質體顆粒的方法，所述方法包括將磷脂添 加至溶劑以形成第一混合物，所述第一混合物包含多個脂質體;破壞所述多個脂質體以產 生第二混合物，所述第二混合物包含脂質體和小單層囊泡(SUV);從所述第二混合物分離所 述SUV，所述SUV具有約20納米與50納米之間的顆粒大小；并且將寡核苷酸添加至所述分離 的SUV以制備脂質體顆粒。
[0037] 在一些實施方案中，所述第一混合物中的多個脂質體的顆粒大小在約100納米與 150納米之間。在其他實施方案中，所述第二混合物中的脂質體和SUV的顆粒大小在約20納 米與約150納米之間。在其他實施方案中，所述脂質體顆粒具有小于或等于約50納米的顆粒 大小。
[0038] 在一些實施方案中，寡核苷酸是含有親脂性栓系基團的寡核苷酸-脂質綴合物，其 中所述親脂性栓系基團被吸附至脂質雙層中。在相關實施方案中，所述親脂性栓系基團包 含生育酚或膽固醇。在其他實施方案中，生育酚選自由生育酚衍生物生育酚、β_生育酚、 γ -生育酚以及&生育酚組成的組。
[0039]在其他實施方案中，寡核苷酸包含RNA或DNA。在一些實施方案中，RNA是非編碼 RNA。在其他實施方案中，非編碼RNA是抑制性RNA(RNAi)。本公開還考慮在另外實施方案中， RNAi選自由小抑制性RNA(siRNA)、與雙鏈DNA形成三鏈體的單鏈RNA(ssRNA)以及核酶組成 的組。
[0040] 在一些實施方案中，RNA是微RNA。在各種實施方案中，DNA是反義DNA。
[0041 ]在一些實施方案中，寡核苷酸是修飾的寡核苷酸。
[0042] 在本公開的另一方面，提供一種抑制基因的表達的方法，所述方法包括以下步驟： 將編碼所述基因產物的多核苷酸與同所述多核苷酸的全部或一部分互補的一個或多個寡 核苷酸雜交，所述寡核苷酸被連接至本公開的脂質體顆粒，其中所述多核苷酸與所述寡核 苷酸之間的雜交在所述多核苷酸的具有足以抑制所述基因產物的表達的互補性程度的長 度內發生。
[0043] 在一些實施方案中，在體內抑制所述基因產物的表達。在其他實施方案中，在體外 抑制所述基因產物的表達。
[0044] 在另外實施方案中，所述脂質體顆粒具有約小于或等于50納米的直徑。在一些實 施方案中，寡核苷酸包含RNA或DNA。在一些實施方案中，RNA是非編碼RNA。在相關實施方案 中，非編碼RNA是抑制性RNA(RNAi)。本公開還考慮在各種實施方案中，RNAi選自由小抑制性 RNA(siRNA)、與雙鏈DNA形成三鏈體的單鏈RNA(ssRNA)以及核酶組成的組。在一些實施方案 中，RNA是微RNA。在其他實施方案中，DNA是反義DNA。
[0045] 在本公開的另一方面，提供一種用于上調toll-樣受體(TLR)的活性的方法，所述 方法包括使具有toll-樣受體的細胞與本公開的脂質體顆粒相接觸。在一些實施方案中，寡 核苷酸是TLR激動劑。在其他實施方案中，toll-樣受體選自由以下各項組成的組:toll-樣 受體1、toll-樣受體2、toll-樣受體3、toll-樣受體4、toll-樣受體5、toll-樣受體6、toll-樣受體7、toll-樣受體8、toll-樣受體9、toll-樣受體10、toll-樣受體11、toll-樣受體12、 以及toll-樣受體13。
[0046] 在另一方面，本公開提供一種用于下調toll-樣受體(TLR)的活性的方法，所述方 法包括使具有toll-樣受體的細胞與本公開的脂質體顆粒相接觸。在一些實施方案中，寡核 苷酸是TLR拮抗劑。在其他實施方案中，toll-樣受體選自由以下各項組成的組:toll-樣受 體1、toll-樣受體2、toll-樣受體3、toll-樣受體4、toll-樣受體5、toll-樣受體6、toll-樣 受體7、toll-樣受體8、toll-樣受體9、toll-樣受體10、toll-樣受體11、toll-樣受體12、以 及toll-樣受體13。
[0047] 本公開還考慮，在各種實施方案中，如本文公開的方法在體外進行。在其他實施方 案中，本公開考慮如本文公開的方法在體內進行。
[0048] 附圖簡述
[0049]圖1描繪在脂質囊泡的表面上用DNA或RNA功能化的小單層囊泡(SUV)的合成。使用 探頭超聲波儀將較大大小的脂質體超聲處理成SUV，并且通過超速離心與重質雜質分離。
[0050] 圖2展示來自小單層囊泡(SUV)的脂質體顆粒的表征。在功能化之前和之后獲得動 態光散射(DLS)顆粒大小數據和透射電子顯微術(TEM)照片。
[0051] 圖3A-3C展示用具有用于將寡核苷酸錨定至脂質體的不同親脂性端的寡核苷酸穩 定的脂質體顆粒的穩定性。用生育酚修飾的寡核苷酸穩定化的脂質體展示相較于裸露脂質 體、用膽固醇修飾的寡核苷酸穩定化的脂質體以及用硬脂基修飾的寡核苷酸穩定化的脂質 體更好的穩定性。a)已用具有不同親脂性端的寡核苷酸功能化的FITC封裝的SUV的凝膠電 泳圖像;b)和c)已用Cy 5-標記的DNA功能化的FITC-封裝的SUV的凝膠電泳圖像。
[0052]圖4A-4B展示已用寡核苷酸穩定化的脂質體顆粒具有良好溫度穩定性，并且示出 用于穩定化SUV的生育酚修飾的DNA濃度的范圍。a)相較于已在4°C下儲存的LSNA，在37°C下 儲存24小時之后脂質體SNA(LSNA)的穩定性。b)示出用于穩定化SUV的α-生育酚修飾的DNA 濃度的范圍的凝膠電泳。
[0053] 圖5包括展示本文公開的脂質體顆粒能夠進入細胞的共焦圖像。將HeLa細胞在無 血清培養基中用ΙΟΟηΜ濃度的DNA(dT 3Q-Cy5或dT3Q)進行處理且在16小時之后進行分析。
[0054] 圖6示出展示相較于未修飾的脂質體，用生育酚修飾的寡核苷酸穩定化的脂質體 未表現出對細胞的實質性細胞毒性作用。
[0055]圖7描繪從DOPC SUV和生育酚修飾的DNA組裝脂質體球形核酸(SNA)。
[0056]圖8A-8D描繪SUV和LSNA的穩定性研究。(A)在于緩沖液中加熱之后SUV的動態光散 射輪廓。（B)在于緩沖液中加熱之后LSNA的動態光散射輪廓。（C)在牛血清白蛋白（胎牛血清 的一種主要組分)存在下脂質體分解的示意性表示。（D)在10%胎牛血清存在下SUV(上部跡 線)和LSNA(下部跡線）的降解，如通過封裝的若丹明染料的釋放所監測，所述釋放引起溶液 的熒光增加。
[0057]圖9A-9B示出(A)被監測為260nm下的吸光度的脂質體-SNA聚集體的熔融轉變。（B) 在接頭DNA鏈存在下在聚集之前（下部跡線）和在聚集之后（上部跡線）脂質體SNA的吸收光 譜。
[0058] 圖10A-10D示出（A)與ΙΟΟηΜ Cy5標記的脂質體SNA孵育24小時的SK0V3細胞的共焦 纖維照片。將細胞核用赫斯特33342染色。（B)通過MTT測定進行的SK0V3細胞中脂質體SNA和 Dharma FECT-DNA復合物的細胞毒性測量。（C)在孵育1小時(各組中的左條形)和36小時（各 組中的右條形）之后通過流式細胞術定量的SK0V3細胞中5-Cy5-標記的DNA鏈和5'-Cy5-標 記的脂質體-SNA的細胞攝取。（D)使用抗HER2脂質體-SNA構建體在ΙμΜ DNA濃度下進行的 SK0V3細胞中的HER2基因敲低。
[0059]圖11描繪在分離和純化之后SUV的ΤΕΜ顯微照片。
[0060]圖12Α-12Β描繪Α)用于計算給定溶液中的脂質體的總數目的等式。可以使用ICP測 定脂質的濃度。對于本文描述的大多數研究，工作脂質濃度1.3mM得到1.361 Χ1017個脂質 體/L和71個DNA鏈/顆粒的DNA負載(4pmo 1 cnf2)。B)取決于所估計的寡核苷酸負載，脂質體 SNA的顆粒流動性。
[0061 ]圖13A-13C示出在1 %瓊脂糖凝膠電泳圖像上已用5 ' -Cy5-標記的DNA鏈功能化得 FITC封裝的LSNA的移動。B)示出凝膠上由于帶負電荷的DNA電暈的存在所致的脂質體核心 的移動的FITC通道。C)Cy5通道指示由于自由鏈與在脂質體構建體上功能化得那些鏈之間 的大小差異所致的流動性的差異。兩個通道共定位在同一條帶上。
[0062]圖 14描繪Ramos-Blue? NF-κΒ/ΑΡ-Ι報道系統。
[0063]圖15示出當暴露于含CpG寡核苷酸時Ramos-Blue細胞的活化。
[0064]圖16是脂質體SNA的合成的圖形描述。
[0065]圖17示出為用不同數目的寡核苷酸功能化的表面的脂質體SNA的凝膠電泳圖像。 30nm SUV的濃度是0.22μΜ(通過元素分析和接近2.2X103個磷脂/30nm SUV通過磷脂含量 的分析所測定）。
[0066] 圖18示出其中脂質體顆粒用于敲低HIFl-α的表達的實驗的結果。
[0067] 圖19示出其中脂質體顆粒用于敲低ΒΑΧ的表達的實驗的結果。
[0068] 詳述
[0069]球形核酸(SNA)納米顆粒綴合物是通常從固定在這類顆粒表面上的高度定向的核 酸配體的無機納米顆粒模板和殼合成的[Mirkin等人，Nature 382:607(1996)]。已經以各 種不同的形式制備了 5財[0111:161'等人，]\4111.〇16111.3〇(3.134:1376(2012);?;[11等人，111 Nanomaterials for Biomedicine；American Chemical Society :第1119卷，第1-20頁 (2012)]。核心組合物，包括金、二氧化硅[Young等人，Nano Lett. 12:3867(2012)]、氧化鐵 [Cutler 等人，Nano Lett.l0:l 477( 2010); Zhang 等人，Nat .Mater .12:741(2013)]以及 Ag [1^6等人，似1101^1:1:.7:2112(2007)]與由0嫩、1?嫩、1^^\[361^1'08等人，01611113;[00161118: 1230(2007)]以及PNA[Lytton_Jean等人，Advanced Materials 21:706(2009)]組成的殼組 合物已全部制備且進行了探索。已合成由交聯寡核苷酸組成的中空SNA結構[Cutler等人， J.Am.Chem.Soc. 133:9254(2011)]，連同膠束-嵌段共聚物結構[Li等人，Nano Lett.4:1055 (2004) ;Alemdaroglu等人，Advanced Materials 20 :899(2008); Liu等人，Chemistry-A European Journal 16:3791(2010) ;Chien等人，Chem.Commun·47:167(2011)]。雖然已知的 SNA中現在存在極大結構和組分多樣性，但它們都共有一些特性和特征。它們的多價構造允 許它們協同地結合寡核苷酸并且形成表現出非常窄的熔融轉變的雙鏈體結構。這些特性已 在高靈敏性和高選擇性基因組檢測系統的開發中進行了探索[Rosi等人，Chem.Rev. 105: 1547(2005)]。雖然線性核酸在無聚合物、肽或病毒轉染劑的情況下不能良好進入細胞，但 三維 SNA 結構由 A 類清除受體識別[Patel 等人，Biocon jugate Chem. 21:2250(2010); Choi等 人，Proc. Natl. Acad. Sci.U.S. A. 110:7625(2013)]并且被迅速帶入超過60種不同的細胞類 型而無需輔助轉染劑[McAllister 等人，J .Am. Chem. Soc · 124:15198(2002); Whitehead 等 人，Nat Rev Drug Discov 8:129(2009);Zhang等人，Biomaterials 31:1805(2010)]。這種 特性使得這類結構是用于細胞內檢測[Zheng等人，Nano Lett.9:3258(2009) ;Prigodich等 人，ACS Nano 3:2147(2009)]和經由反義或siRNA途徑基因調控[Rosi等人，Science 312: 1027(2006) ;Agbasi-Porter等人，Bioconjugate Chem. 17 :1178(2006) ;Giljohann等人， J .Am · Chem · Soc · 131: 2072(2009); Jensen 等人，Science Translational Medicine 5: 209ral52(2013)]兩者的策略中的重要要素。
[0070]然而，治療性使用的障礙較高，尤其是當這類結構是由具有已知的清除問題或未 知的生物分布特征的材料制成時。理想地，將期望由可容易獲得的起始材料制成的SNA結構 可按比例合成，并且由已經是FDA批準的藥物的一部分的組分組成[Cutler等人， J .Am. Chem. Soc .134:1376(2012) ;Farokhzad 等人，Drug Delivery Rev · 58:1456(2006) ] 〇 在本文中，提供一種用于制備這類結構策略，所述結構由用具有疏水性尾的帶電荷的聚合 物的致密殼穩定化的小脂質體核心組成，所述脂質體核心可夾在限定脂質體結構的磷脂之 間。考慮用于使用的這樣一種帶電荷的聚合物是核酸。如同常規SNA，這些脂質體結構快速 地進入多種細胞系并且在一些實施方案中用于經由反義途徑有效地敲低基因表達。常規 SNA已顯示進入源自許多器官和組織的細胞，包括乳腺（SKBR3、MDA-MB-231、AU-565)、腦 (1]87、1^229、1]118)、膀胱（!11'-1376、5637、了24)、結腸（1^513)、宮頸（此1^、3川&)、皮膚 (C166、KB、MCF 10A)、腎（MDCK)、腦（大鼠海馬神經元、星形細胞、膠質細胞）、膀胱、血液 (PBMC、T-細胞）、胰腺（人β-胰島）、皮膚（人）、血液（Sup T1、Jurkat)、白血病(K562)、肝 (HepG2)、腎（293T)、卵巢(CH0)、成纖維細胞(NIH3T3)、巨噬細胞(RAW264.7)。球形核酸構造 有助于通過結合至清除受體A(-種細胞膜受體)而使這些構建體進入細胞。表達這種受體 的細胞系的一些非限制性實例是拖1^、31(0￥-3、1]87、如虹〇24、1^1細胞、他?62、他？38、]\0^-MB-468、MCF-7、C8S、Cl 66Bend3、A549、Rab9、HeyA8、Jurkat細胞。
[0071]采用SUV的主要缺點是它們在溶液中的固有不穩定性，這是由于融合成較大脂質 體結構的高傾向性所致。本文公開用帶負電荷的DNA的致密層功能化這些結構通過例如減 少由于帶負電荷的顆粒表面的排斥所致的顆粒-顆粒相互作用來提高它們的穩定性。在本 文描述的研究的過程中，據發現生育酚功能化的DNA相較于其他已知的疏水性DNA類似物在 顆粒上提供更高密度的DNA鏈，從而顯著提高顆粒的穩定性。除了總體膠體穩定性，高密度 的DNA將經由清除受體B途徑增加這種納米顆粒的攝取并且將允許遺傳物質誘導遞送至細 胞中。最后，DNA的致密層預期提高體內的顆粒穩定性、其循環速率且因此改進這種納米藥 物的生物分布。
[0072] 本公開教導通過增加 SUV的表面負電荷，經由連接陰離子實體(包括但不限于DNA 和RNA)，這些囊泡的膠體穩定性得以提高。另外，不同于其線性對應物，核酸的致密球形布 置和徑向取向表現出獨特的化學和生物特性。這些球形核酸(SNA)是無毒的，并且雖然是陰 離子的，但能夠以非免疫原性方式有效地進入細胞而無需輔助陽離子轉染劑的幫助。這些 例外特性允許其用作不同療法中的基因調控的遞送劑。脂質體模板介導的SNA合成提供金 屬核心SNA的替代平臺，所述金屬核心SNA因金屬核心的生物積聚和不能封裝治療實體而限 制SNA治療多樣性。
[0073] 現在將在下文更全面地描述生育酚修飾的寡核苷酸和制備所述寡核苷酸的方法、 脂質體顆粒以及制備所述脂質體顆粒的方法、以及脂質體顆粒的用途。確實，本公開可以許 多不同的形式實施且不應被解釋為限于本文提出的實施方案。這些實施方案以足夠的書面 細節提供以描述本發明并且使本領域的技術人員能夠制備和使用本發明，連同用于實踐本 發明的最佳模式的公開內容，如由權利要求及其等效物所限定。
[0074] 同樣，本發明所屬領域的技術人員將會想到本文描述的方法的許多修改和其他實 施方案，其具有前述描述和相關附圖中所提出的教義的益處。因此，應理解，本發明不限于 所公開的特定實施方案，并且所述修改和其他實施方案意圖包括在所附權利要求的范圍 內。盡管本文采用特定術語，但是僅在一般意義和描述性意義上而不是出于限制的目的使 用這些術語。
[0075] 術語
[0076] 除非另外定義，否則本文使用的所有技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域 中的技術人員通常理解的相同的含義。雖然可在本發明的實踐或測試中使用類似或等同于 本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料，但本文描述優選方法和材料。
[0077] 首先定義某些術語。在整個說明書中定義另外的術語。
[0078]為了簡潔，在小單層囊泡（SUV)、脂質體SNA(LSNA)、脂質體顆粒或球形核酸（SNA) 方面對本公開的實施方案的描述也可適用于使用任何其他前述術語的實施方案。作為舉 例，使用脂質體SNA調控基因表達的方法也可在本文描述為使用脂質體顆粒調控基因表達 的方法。小單層囊泡（SUV)是100納米大小以下的脂質體顆粒并且用作LSNA的前體。SUV和 LSNA因而可被視為脂質體顆粒的亞類。
[0079] 本文使用的術語意圖作為"開放"術語(例如，術語"包括"應被解釋為"包括但不限 于"，術語"具有"應被解釋為"具有至少"，術語"包含"應被解釋為"包含但不限于"）。
[0080] 此外，在使用類似于"A、B和C等中的至少一個"的慣例的那些情況下，一般而言這 種造句意圖是本領域的普通技術人員將理解所述慣例的意義(例如，"一種具有A、B和C中的 至少一個的系統"將包括但不限于具有單獨A、單獨B、單獨C、A和B-起、A和C一起、B和C一起 和/或A、B和C一起的系統）。本領域的技術人員還將理解，無論在說明書或附圖中，表示兩個 或更多個替代術語的幾乎任何轉折性詞語和/或短語應被理解為考慮包括所述術語中的一 個、所述術語中的任一個或兩個術語的可能性。例如，術語"A或B"將被理解為包括"A或B"或 "A和B"的可能性。
[0081 ]所有語言如"從"、"至"、"達"、"至少"、"大于"、"小于"等包括所列舉的數字并且是 指可隨后分解成如上文所討論的子范圍的范圍。
[0082] 范圍包括每個單獨成員。因此，例如，具有1-3個成員的組是指具有1、2或3個成員 的組。類似地，具有6個成員的組是指具有1、2、3、4、或6個成員的組，依次類推。
[0083] 情態動詞"可"是指在若干描述的實施方案或在所述實施方案內包括的特征之中 一個或多個選項或選擇的優選使用或選擇。在關于具體實施方案或在所述實施方案中包括 的特征未公開選項或選擇的情況下，情態動詞"可"是指關于如何制備或使用所描述的實施 方案或在所述實施方案中包括的特征的確認行為，或使用關于所描述的實施方案或在所述 實施方案中包括的特征的特定技能的最后決策。在此后者背景下，情態動詞"可"與助動詞 "能夠"具有相容意義和涵義。
[0084] 如本文所用，冠詞"一個(種)"（"a"和"an"）是指一個或多于一個（例如指至少一 個)的所述冠詞的語法賓語。
[0085] "約"和"大約"應總體上意指鑒于測量的性質或準確度，所測量的量的可接受的誤 差程度。示例性誤差程度在給定值或值范圍的20-25% ( % )內，通常在10%內，并且更通常 在5%內。
[0086] 本文描述的化學結構是根據IUPAC命名規則命名的并且在適當的情況下包括本領 域公認的常見名稱和縮寫。IUPAC命名可用化學結構繪圖軟件程序獲得，如ChemDraw? (PerkinElmer，Inc ·)、CheinD(i〇dkD (iChemLabs，LLC)和Marvin(ChemAxon Ltd ·)。在 IUPAC名稱錯誤命名或另外與本文公開的化學結構沖突的程度上以本公開中的化學結構為 準。
[0087] 呈現標題(例如(A)、（B)、（i)等)僅是為了便于閱讀本說明書和權利要求書。本說 明書或權利要求書中標題的使用并不要求步驟或要素是以字母或數字順序或以它們出現 的順序進行。
[0088] 本公開描述被稱為脂質體顆粒的新穎顆粒、制備所述顆粒的方法以及這些顆粒的 用途。本發明的脂質體顆粒相較于基于其他已知脂質體的材料是有利的，在于所述脂質體 顆粒在小于其他已知脂質體顆粒的顆粒大小下是穩定的，并且DNA的致密層提高體內的顆 粒穩定性且因此提高脂質體囊泡的循環速率，這改進這些顆粒在體內的生物分布。
[0089] A.生育酚修飾的寡核苷酸
[0090] 在第一實施方案中，公開一種包含生育酚修飾的寡核苷酸的構造。生育酚修飾的 寡核苷酸包含親脂性端和非親脂性端。所述親脂性端包含生育酚，并且可選自由生育酚衍 生物生育酚、生育酚、γ-生育酚以及&生育酚組成的組。在其他實施方案中，所述親脂 性端包含棕櫚酰基、二棕櫚酰基、硬脂基或二硬脂基。
[0091] 生育酚修飾的寡核苷酸的非親脂性端是寡核苷酸。寡核苷酸是RNA或DNAANA可以 是執行調控功能的抑制性RNA(RNAi)，并且選自由小RNAi組成的組，所述小RNAi選自由小抑 制性RNA(siRNA)、與雙鏈DNA形成三鏈體的RNA以及核酶組成的組。或者，RNA是執行調控功 能的微RNA。在其他實施方案中，RNA是piwi相互作用RNA(piRNA)。在一些實施方案中，DNA是 反義DNA。
[0092] 考慮用于根據本公開使用的寡核苷酸的長度是約5至約100個核苷酸。方法和組合 物還考慮其中寡核苷酸的長度是約5個至約90個核苷酸、長度是約5至約80個核苷酸、長度 是約5至約70個核苷酸、長度是約5至約60個核苷酸、長度是約5至約50個核苷酸、長度是約5 至約45個核苷酸、長度是約5至約40個核苷酸、長度是約5至約35個核苷酸、長度是約5與約 30個核苷酸、長度是約5至約25個核苷酸、長度是約5至約20個核苷酸、長度是約5至約15個 核苷酸、長度是約5至約10個核苷酸，以及處于具體公開的長度大小之間的所有寡核苷酸， 只要所述寡核苷酸能夠實現所需的結果。因此，考慮長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、 65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99以及100個核苷酸的寡核苷酸。
[0093]修飾的寡核苷酸
[0094]寡核苷酸的特定實例包括含有修飾的主鏈或非天然核苷酸間鍵聯的寡核苷酸。具 有修飾主鏈的寡核苷酸包括在主鏈中保留磷原子或在主鏈中不具有磷原子的寡核苷酸。在 其核苷酸間主鏈中不具有磷原子的修飾的寡核苷酸被認為處于"寡核苷酸"的含義之內。 [0095]含有磷原子的修飾的寡核苷酸主鏈包括，例如，具有正常3 ' -5 '鍵聯的硫代磷酸酯 類、手性硫代磷酸酯類、二硫代磷酸酯類、磷酸三酯類、氨基烷基磷酸三酯類、甲基和其他烷 基磷酸酯類(包括3'-烯基磷酸酯類、5'-烯基磷酸酯類和手性磷酸酯類、次磷酸酯類）、磷酰 胺酯類（包括3 ' -氨基磷酰胺酯和氨烷基磷酰胺酯、硫羰磷酰胺酯 (thionophosphoramidates))、硫幾烷基磷酸酯（thionoalky lphosphonates)、硫幾烷基磷 酸三酯（thionoalkylphosphotriesters)、硒代磷酸酯和硼燒磷酸酯（boranophosphates)、 這些修飾的寡核苷酸主鏈的2'-5'連接的類似物、以及具有反轉極性的修飾的寡核苷酸主 鏈，其中一個或多個核苷酸間鍵聯是3'至5'、5'至5'或2'至'2鍵聯。還考慮具有反轉極性的 寡核苷酸，其在3 最末端的核苷酸鍵聯上包含單一3 '至3 '鍵聯，即，可能無堿基的(此核苷 酸失去或在其位置上具有羥基基團）單一反轉核苷酸殘基。還考慮鹽類、混合鹽類以及游離 酸形式。可教導制備上述含磷的鍵聯的代表性美國專利包括：美國專利號3，687，808、4， 469,863、4,476,301、5,023,243、5，177，196、5，188,897、5,264,423、5,276,019、5,278， 302、5,286,717、5,321，131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5， 476,925、5,519，126、5,536,821、5,541，306、5,550，111、5,563,253、5,571，799、5,587， 361、5，194,599、5,565,555、5,527,899、5,721，218、5,672,697和5,625,050，所述專利的公 開內容以引用的方式并入本文。
[0096]其中不包含磷原子的修飾的寡核苷酸主鏈具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵聯、 混合雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵聯或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵聯形成 的主鏈。這些主鏈包括:具有嗎啉代鍵聯的主鏈;硅氧烷主鏈;硫化物、亞砜和砜主鏈；甲酰 乙酰基和硫代甲酰乙酰基主鏈;亞甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主鏈;核糖乙酰基主 鏈;含烯烴的主鏈;氨基磺酸酯主鏈;亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈;磺酸酯和磺酰胺主 鏈；酰胺主鏈；以及其他具有混合的N、0、S和CH 2組成部分的主鏈。參見例如美國專利號5， 034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264, 564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5, 596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623, 070 ;5,663,312;5,633,360;5,677,437;5,792,608;5,646,269以及5,677,439，所述專利的 公開內容以引用的方式整體并入本文。
[0097]在其他實施方案中，考慮其中核苷酸單位的一個或多個糖和/或一個或多個核苷 酸間鍵聯被"非天然存在的"基團置換的寡核苷酸。一方面，本實施方案考慮肽核酸(PNA)。 在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主鏈被含酰胺的主鏈置換。參見，例如美國專利號5，539， 082、5,714,331 和5,719,262,以及Nielsen等，1991，Science, ,254:1497-1500,所述文獻的 公開內容以引用的方式并入本文。
[0098]在其他實施方案中，寡核苷酸具有硫代磷酸酯主鏈，并且寡核苷具有雜原子主鏈， 并且包括在美國專利號5,489,677和5,602,240中所描述的一012-順一0-012-、一01 2-~ (CH3) -0-CH2-、一CH2-0-N (CH3) -CH2-、一CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2- 以及一0-N (CH3) - CH2-CH2-。還考慮具有美國專利號5,034,506中描述的嗎啉代主鏈結構的寡核苷 酸。
[0099]在各種形式中，寡核苷酸中兩個連續單體之間的鍵聯由2至4個(理想情況下是3 個)基團/原子組成，所述基團/原子選自一ch2-、一0-、一S-、一 nrh-、〉c=o、>c=nrh、>c =S、一 Si(R")2 -、一 SO -、一 S(0)2 -、一 P(0)2 -、一 po(bh3) -、一 P(0，S) -、一 P(S)2 -、一 P0 (R〃) 一、一P0 (0CH3) -以及一P0 ( NHRh ) -，其中RH選自氫和心―4-烷基，并且R〃選自Ci-6-烷 基和苯基。這類鍵聯的示例性實例是一 CH2-CH2-CH2 -、一 CH2-C0-CH2 -、一 CH2-CH0H- CH2 -、一0-CH2-0-、一0-CH2-CH2 -、一0-CH2-CH =(當用作與下一個單體的鍵聯時包 括 R5)、一CH2-CH2-0-、一NRH-CH2-CH2-、一CH 2-CH2-NRH-、一CH2-NRH-CH2-、一0- CH2-CH2-NRH-、一NRH-⑶一0-、一NR H-⑶一NRH-、一NRH-CS-NRH-、一NR H-C (= NRH) -NRH-、一NRH-⑶一CH2-NRh-0-⑶一 0-、一0-⑶一 CH2-0 -、一0-CH2-⑶一 0-、一CH2-C0-NRH-、一0-⑶一 NRH-、一NRH-C0-CH2 -、一0-CH2-⑶一 NRH-、一0- CH2-CH2-NRH-、一CH=N-0-、一CH2-NR H-0-、一CH2-0-N =(當用作與下一個單體的 鍵聯時包括R5)、一CH2-0-NRH-、一⑶一NR H-CH2 -、一CH2-NRH-0-、一CH2-NRH- C0-、一0-NRh-CH2-、一0-NRH、一0-CH2-S-、一S-CH2-0-、一CH2-CH2-S-、一0- CH2-CH2 - S -、一S-CH2-CH=(當用作與下一個單體的鍵聯時包括R5)、一S-CH2 - CH2-、一S-CH2-CH2--0-、一S-CH2-CH 2-S-、一CH2-S-CH2-、一CH2-S0-CH 2-、一 CH2-S〇2-CH2 -、一 0-S0-0 -、一0-S(0)2-0-、一0-S(0)2-CH2 -、一0-S(0)2- NRH-、一NRH-S (0) 2-CH2-; 一0-S (0) 2-CH2-、一0-P (0) 2-0-、一0-P (0，S) -0-、一 0-P(S)2-0 -、一 S-P(0)2-0 -、一 S-P(0，S) - 0 -、一 S-P(S)2-0 -、一 0-P(0)2- S -、一 0-P(0，S)-S -、一 0-P(S)2-S -、一 S-P(0)2-S -、一 S-P(0，S) - S -、一 S-P (S) 2-S-、一0-PO (R") -0-、一0-PO (0CH3) -0-、一0-P0 (0 CH2CH3) -0-、一0-P0 (0 CH2CH2S-R) -0-、一0-P0(BH3) -0 -、一0-P0(NHRn) -0 -、一0-P(0)2-NRH Η-、一 NRH-P (0) 2-0-、一0-Ρ (0，NRH) -0-、一CH2-Ρ (0) 2-0-、一0-Ρ (0) 2-CH2-、以及一 0-S i (R") 2-0-;其中考慮一CH2-⑶一 NRH-、一CH2-NRH-0-、一 S-CH2-0-、一0-P (0)2-0-0-P(-0，S)-0-、一0-P(S)2-0-、一NRh P(0)2-0-、一0-P(0，NRh)-0-、一 0-PO (R〃) 一0-、一0-PO (CH3) -0- 以及一0-PO ( NHRn ) -0-，其中 RH選自氫和&―4-烷基， 并且R〃選自Ci-6-烷基和苯基。Mesmaeker等，1995，Current Opinion in Structural Biology，5: 343-355以及Susan M. Freier和Karl-Heinz Altmann, 1997 ,Nucleic Acids Research,第25卷:第4429-4443頁中給出了另外的說明性實例。
[0100]寡核苷酸的其他修飾形式在美國專利申請號20040219565中進行了詳細描述，所 述專利的公開內容以引用的方式整體并入本文。
[0101] 修飾的寡核苷酸還可包含一個或多個取代的糖部分。在某些方面，寡核苷酸在2' 位置上包含以下中的一個:〇H; F; 0-、S-或N-烷基;0-、S-或N-烯基;0-、S-或N-炔基;或0-烷 基-0-烷基，其中烷基、烯基以及炔基可以是取代或未取代的&至(^烷基或(： 2至(^烯基和炔 基。其他實施方案包括〇 [ (CH2) n0 ]mCH3、0 (CH2) n0CH3，0 (CH2) nNH2、0 (CH2) nCH3、0 (CH2) η0ΝΗ2 以 及0(CH2)n0N[(CH2)nCH 3]2,其中n和m是1至約10。其他寡核苷酸在2'位置包含以下中的一個： &至&〇低級烷基、取代的低級烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或0-芳烷基、SH、 501 3、0^(：1、81、^0?3、(^^3、30013、3〇2〇13、0勵2、勵2川3、順2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨基 烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基團、報告基因、嵌入劑、用于改進寡核苷 酸的藥代動力學特性的基團或用于改進寡核苷酸的藥效學特性的基團，以及其他具有類似 特性的取代基。一方面，修飾包括2 甲氧基乙氧基(2' -0-CH2CH20CH3，也稱為2 ' -0- (2-甲氧 乙基）或2'-]/[(^)(]\^1'1:;[11等，1995，!161￥.01；[111.六(^&，78:486-504)，即烷氧基烷氧基。其他修 飾包括2 ' -二甲基氨基氧基乙氧基，即0 (CH2) 20N( CH3) 2基團，也稱為2 ' -DMA0E，如本文以下 實例中所描述；以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本領域中也稱為2'-0_二甲基_氨基_ 乙氧基-乙基或2'-DMAE0E)，即2'-0-CH 2-0-CH2-N(CH3)2，也在本文以下實例中描述。
[0102] 其他修飾包括2 ' -甲氧基（2 ' -0-CH3)、2 ' -氨基丙氧基（2 ' -〇CH2CH2CH2NH2)、2 ' -烯 丙基(2 '-CH2-CH=CH2)、2 ' -0-烯丙基(2 ' -0-CH2-CH=CH2)以及2 ' -氟基(2 ' -F)。2 ' -修飾 可處于阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。一方面，2'-阿拉伯糖修飾是2'-F。類似的修飾還可 在所述寡核苷酸上的其他位置處進行，例如，位于3 '末端核苷酸或2 ' -5 '連接的寡核苷酸的 糖的3'位置以及5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸還可具有替代五碳呋喃糖的糖類似結 構，如環丁基部分。參見例如美國專利號4,981，957 ;5，118,800;5,319,080;5,359,044;5， 393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591, 722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5, 792，747;以及5，700，920，所述專利的公開內容以引用的方式整體并入本文。
[0103] -方面，糖的修飾包括鎖核酸(LNA)，其中2'-羥基連接至糖環的3'或4'碳原子，從 而形成雙環糖部分。在某些方面，所述鍵聯是橋聯2'氧原子和4'碳原子的亞甲基(一 CH2-)n 基團，其中η是1或2兒熟及其制備描述于W0 98/39352和W0 99/14226中。
[0104] 寡核苷酸還可包含堿基修飾或取代。如本文所使用，"未修飾"或"天然"堿基包括 嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾 的堿基包括其他合成和天然的堿基，如5-甲基胞嘧啶（5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、 次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥 嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代 尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其他炔基衍生物、6-偶氮基尿 嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶）、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-巰基、8-硫 烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代(具體為5-溴）、5_三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮 雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌 呤。其他修飾的堿基包括三環嘧啶類，如吩噁嗪胞苷（1H-嘧啶并5，4-b] [ 1，4]苯并噁嗪2 (3H)-酮）、吩噻嗪胞苷（1H-嘧啶并[5，4-b] [ 1，4]苯并噻嗪-2 (3H)-酮）、G-形鉗如取代的吩 噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-13][1，4]苯并噁嗪-2(3!〇-酮）、咔唑胞苷 (2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮）、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3'，2'：4,5]吡咯并[2,3-d]嘧 啶2-酮）。修飾的堿基還可包括其中嘌呤或嘧啶堿基被其他雜環類置換的那些堿基，例如7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、2-氨基吡啶以及2-吡啶酮。其他堿基包括公開于美國專利號3， 687,808中的那些、公開于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，第858-859頁，Kroschwitz，J · I ·編著John Wiley&Sons，1990中的那些、由 Englisch等，1991，Angewandte Chemie，International Edition，30:613公開的那些以及 由Sanghvi，Y.S.，第15章 ，Antisense Research and Applications,第289-302頁，Crooke, 5.1\和1^131611，8.編著，0^?代^，1993公開的那些。這些堿基中的某些堿基適用于提高結 合親和力并且包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙 基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示使核酸雙鏈體 的穩定性提高0.6-1.2°C并且在某些方面與2'-0_甲氧基乙基糖修飾組合。參見美國專利號 3,687,808,美國專利號 4,845,205 ;5,130,302 ;5,134,066; 5,175,273; 5,367,066 ;5,432， 272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5， 594,121,5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,750,692 以及5,681，941，所述專利的公開內容以引用的方式并入本文。
[0105] "修飾的堿基"或其他類似的術語是指可與天然堿基(例如，腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧 啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶）配對和/或可與非天然存在的堿基配對的組合物。在某些方面， 修飾的堿基提供15、12、10、8、6、4、或2 °C或更小的Tm差異。示例性修飾的堿基描述于EP 1 072 679和W0 97/12896 中。
[0106] "核堿基"是指天然存在的核堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T) 和尿嘧啶(U)，以及非天然存在的核堿基，如黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N 6-甲基腺嘌呤、 7_脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶、Ν'，N'_橋亞乙基-2，6_二氨基嘌呤、 5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C 3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥 基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷，以及Benner等，美國專利號5，432， 272以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann, 1997,Nucleic Acids Research,第25卷： 第4429-4443頁中所描述的"非天然存在的"核堿基。術語"核堿基"因此不僅包括已知的嘌 呤和嘧啶雜環類，而且包括其雜環類似物和互變異構體。其他天然和非天然存在的核堿基 包括美國專利號3，687，808(Merigan等）；Sanghvi 的第15章 ，Antisense Research and Application，S.T.Crooke 和 B.Lebleu 編著，CRC Press，1993;Englisch 等，1991， △叫6￥311(^6〇1611^6，國際版本，30:613-722(特別參見第622頁和第623頁，并且參見 Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I .Kroschwitz編著， John Wiley&Sons，1990,第858-859頁，Cook,Anti-Cancer Drug Design 1991,6,585-607， 所述文獻各自以引用的方式整體并入本文）中公開的那些。術語"核苷堿基"或"堿基單元" 還意圖包括可充當核堿基的化合物如雜環化合物，所述核堿基包括在最傳統意義上不是核 苷堿基但充當核苷堿基的某些"通用堿基"。作為通用堿基尤其提及3-硝基吡咯、任選取代 的吲哚（例如5-硝基吲哚）以及任選取代的次黃嘌呤。其他理想的通用堿基包括吡咯、二唑 或三唑衍生物，包括本領域中已知的那些通用堿基。
[0107] B.制備生育酚修飾的寡核苷酸的方法
[0108] 在第二實施方案中，公開制備生育酚寡核苷酸的方法。首先，提供寡核苷酸和亞磷 酰胺修飾的生育酚。然后，將所述寡核苷酸暴露于所述亞磷酰胺修飾的生育酚以產生生育 酚修飾的寡核苷酸。雖然不意圖是限制性的，但本領域技術人員已知的任何化學可用于將 生育酚連接至寡核苷酸，包括酰胺連接或點擊化學。
[0109] C.脂質體顆粒
[0110] 在第三實施方案中，公開脂質體顆粒。所述脂質體顆粒具有至少大致上球形的幾 何形狀、內側以及外側，并且包含脂質雙層。所述脂質雙層包括第一脂質和第二脂質。在一 些實施方案中，所述第一脂質和第二脂質是相同的。在其他實施方案中，所述第一脂質和第 二脂質是不同的。
[0111] 所述第一脂質選自脂質的磷酸膽堿家族或脂質的磷酸乙醇胺家族。雖然不意圖是 限制性的，但所述第一脂質選自由以下各項組成的組：1，2_二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽 堿(D0PC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰膽堿(DMPC)、1-棕櫚酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰膽 堿(P0PC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸-0--rac-甘油）（DSPG)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-0- -rac-甘油）（D0PG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DSPC)、 1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、以及1，2-雙十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)。
[0112] 所述第二脂質選自脂質的磷酸膽堿家族或脂質的磷酸乙醇胺家族。雖然不意圖是 限制性的，但所述第二脂質選自由以下各項組成的組：1，2_二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽 堿(D0PC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰膽堿(DMPC)、1-棕櫚酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰膽 堿(P0PC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸-0--rac-甘油）（DSPG)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-0- -rac-甘油）（D0PG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DSPC)、 1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、以及1，2-雙十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)。
[0113] 所述脂質顆粒還包含生育酚修飾的寡核苷酸，其中所述生育酚修飾的寡核苷酸的 親脂性端被吸收至脂質雙層中。生育酚選自由生育酚、生育酚、γ-生育酚以及S-生育 酚組成的組。生育酚修飾的寡核苷酸的非親脂性端是寡核苷酸。在各種實施方案中，這種寡 核苷酸是RNA或DNAANA可以是執行調控功能的抑制性RNA(RNAi)，并且在各種實施方案中 選自由小抑制性RNA(siRNA)、與雙鏈DNA形成三鏈體的RNA以及核酶組成的組。或者，并且在 其他實施方案中，RNA是執行調控功能的微RNAANA任選地是反義DNA。在其他實施方案中， RNA是piwi相互作用RNA(piRNA)。
[0114] 換言之，本公開提供一種脂質體顆粒，所述脂質體顆粒具有大致上球形的幾何形 狀，所述脂質體顆粒包含脂質雙層，所述脂質雙層包含多個脂質基團；以及寡核苷酸。在各 種實施方案中，寡核苷酸是修飾的寡核苷酸。在一些實施方案中，所述多個脂質基團包含選 自由脂質的磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油以及磷脂酰乙醇胺家族組成的組的脂質。在其他實施 方案中，寡核苷酸是含有親脂性栓系基團的寡核苷酸-脂質綴合物，其中所述親脂性栓系基 團被吸附至脂質雙層中。在各種實施方案中，所述親脂性栓系基團包含生育酚、棕櫚酰基、 二棕櫚酰基、硬脂基、二硬脂基或膽固醇。
[0115] 或者，所述脂質體顆粒還包含封裝在所述脂質體顆粒的內側上的治療劑。在其他 實施方案中，本公開的脂質體顆粒還包含直接或間接地連接至所述脂質體顆粒的治療劑。 間接連接包括，例如但不限于，連接至進而連接至脂質體顆粒的寡核苷酸。
[0116] 在一些實施方案中，所述脂質體顆粒還包含封裝在所述脂質體顆粒的內側上的診 斷劑。在一些實施方案中所述診斷劑是釓。
[0117] 關于本公開的脂質體顆粒的表面上的寡核苷酸的表面密度，考慮如本文所述的脂 質體顆粒在其表面上包含約1至約100個寡核苷酸。在各種實施方案中，脂質體顆粒在其表 面上包含約10至約100、或10至約90、或約10至約80、或約10至約70、或約10至約60、或約10 至約50、或約10至約40、或約10至約30、或約10至約20個寡核苷酸。在其他實施方案中，脂質 體顆粒在其表面上包含至少約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸。
[0118] D.制備脂質體顆粒的方法
[0119] 在第四實施方案中，公開制備脂質體顆粒的方法。首先，提供磷脂、溶劑以及生育 酚修飾的寡核苷酸。然后，將磷脂添加至溶劑以形成包含脂質體的第一混合物。所述第一混 合物中的脂質體的大小在約100納米與約150納米之間。
[0120] 接下來，將所述脂質體破壞以產生第二混合物，所述第二混合物包含脂質體和小 單層囊泡(SUV)。所述第二混合物中的脂質體和SUV的大小在約20納米與約150納米之間。
[0121] 接下來，從所述第二混合物分離具有約20納米與約50納米之間的顆粒大小的SUV。 最后，將生育酚修飾的寡核苷酸添加至所分離的SUV以制備脂質體顆粒。
[0122] 通過本公開的方法產生的脂質體顆粒的顆粒大小小于或等于50納米。在一些實施 方案中，產生多個脂質體顆粒，并且所述多個脂質體顆粒中的顆粒具有小于或等于約50納 米(例如，約5納米至約50納米、或約5納米至約40納米、或約5納米至約30納米、或約5納米至 約20納米、或約10納米至約50納米、或約10納米至約40納米、或約10納米至約30納米、或約 10納米至約20納米)的平均直徑。在其他實施方案中，通過本公開的方法產生的多個脂質體 顆粒中的顆粒具有小于或等于20納米、或小于或等于約25納米、或小于或等于約30納米、或 小于或等于約35納米、或小于或等于約40納米或小于或等于約45納米。
[0123] 換言之，在一些方面，本公開提供一種制備脂質體顆粒的方法，所述方法包括將磷 脂添加至溶劑以形成第一混合物，所述第一混合物包含多個脂質體;破壞所述多個脂質體 以產生第二混合物，所述第二混合物包含脂質體和小單層囊泡(SUV);從所述第二混合物分 離所述SUV，所述SUV具有約20納米與50納米之間的顆粒大小；并且將寡核苷酸添加至所述 分離的SUV以制備脂質體顆粒。
[0124] E.脂質體顆粒在基因調控/治療中的用途
[0125] 本文提供的用于抑制基因產物表達的方法包括其中相較于在脂質體SNA不存在下 的基因產物表達，靶基因產物的表達被抑制至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約 20 %、至少約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約 55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約 90%、至少約95%、至少約96%、至少約97 %、至少約98 %、至少約99%或100 %的那些方法。 換言之，所提供的方法涵蓋實質上產生靶基因產物的表達的任何程度的抑制的那些方法。
[0126] 抑制的程度是從體液樣品或從活檢樣品在體內測定或通過本領域中熟知的程序 技術來測定。或者，在細胞培養測定中測定抑制的程度，通常作為由于使用特定類型的脂質 體SNA和特異性寡核苷酸而可在體內預期的抑制程度的可預測的測量。
[0127] 在本公開的一些方面，考慮脂質體顆粒執彳丁基因抑制功能以及治療劑遞送功能。 在這類方面，治療劑被封裝在本公開的脂質體顆粒中，并且所述顆粒另外用被設計來實現 靶基因表達的抑制的一個或多個寡核苷酸功能化。在其他實施方案中，治療劑被連接至本 公開的脂質體顆粒。
[0128] 在各種方面，所述方法包括使用與靶多核苷酸100%互補（即，完全匹配)的寡核苷 酸，而在其他方面，寡核苷酸在所述寡核苷酸的長度上與所述多核苷酸至少(意指大于或等 于）約95%互補，在所述寡核苷酸的長度上與所述多核苷酸至少約90%、至少約85%、至少 約80 %、至少約75 %、至少約70 %、至少約65 %、至少約60 %、至少約55 %、至少約50 %、至少 約45 %、至少約40 %、至少約35 %、至少約30 %、至少約25 %、至少約20 %互補，只要所述寡 核苷酸能夠實現靶基因產物的所需抑制程度。
[0129] 在本領域中應了解，反義化合物的序列無需與其可特異性雜交的靶核酸的序列 100%互補。此外，寡核苷酸可在一個或多個區段上雜交，以使得插入或相鄰區段不牽涉到 雜交事件中（例如環結構或發夾結構）。互補性百分比在寡核苷酸的長度內測定。例如，在反 義化合物的20個核苷酸中的18個與總長度100個核苷酸的靶多核苷酸中的20個核苷酸區互 補的反義化合物的情況下，寡核苷酸將是90%互補的。在此實例中，剩下的非互補核苷酸可 與互補核堿基集群或穿插在互補核堿基中并且不需要彼此鄰接或與互補核苷酸鄰接。反義 化合物與靶核酸的區的互補性百分比可常規地使用本領域中已知的BLAST程序(基本局部 比對搜尋工具（basic local alignment search tool))和PowerBLAST程序來測定 (Altschul等，J.Mol.Biol.,1990,215,403-410;Zhang和Madden，Genome Res·，1997，7， 649-656)。
[0130] 因此，在第五實施方案中，提供在基因調控療法中利用脂質體顆粒的方法。所述方 法包括以下步驟:將編碼所述基因產物的多核苷酸與同所述多核苷酸的全部或一部分互補 的一個或多個寡核苷酸雜交，所述寡核苷酸被連接至脂質體顆粒，其中所述多核苷酸與所 述寡核苷酸之間的雜交在所述多核苷酸的具有足以抑制所述基因產物的表達的互補性程 度的長度內發生。所述脂質體顆粒具有約小于或等于50納米的直徑。基因表達的抑制可在 體內或在體外發生。
[0131] 在所述方法中使用的寡核苷酸是RNA或DNA ANA可以是執行調控功能的抑制性RNA (RNAi)，并且在各種實施方案中選自由小抑制性RNA(siRNA)、與雙鏈DNA形成三鏈體的RNA 以及核酶組成的組。或者，RNA是執行調控功能的微RNA。在一些實施方案中，DNA是反義DNA。
[0132] 在本公開的另一方面，脂質體顆粒用于一種治療創傷性腦損傷(TBI)的方法中。在 美國，自從2000年以來在軍隊中的TBI已經超過244，000例，并且其是45歲以下的人的死亡 和殘基的主要原因。此外，當前難以預測"輕度嚴重程度"事件的神經學結果，并且損傷的繼 發階段(例如，炎癥、局部缺血和細胞凋亡)非常難以治療。
[0133] 因此，在一些實施方案中，本公開的方法涉及使用被設計用于靶向在TBL中牽涉的 基因產物和調控所述基因產物的表達的脂質體顆粒。例如且不限于，所述靶基因產物選自 由以下各項組成的組:組蛋白脫乙酰酶(HDAC)、BCL2相關X(BAX)、基質金屬肽酶/金屬蛋白 酶(MMP;包括但不限于，基質金屬肽酶9(MMP-9))、缺氧誘導因子(HIF;包括但不限于，缺氧 誘導因子la(HIFl-a))以及鈣蛋白酶。
[0134] F.脂質體顆粒在免疫調控中的用途
[0135] Toll樣受體(TLR)是在崗哨細胞中表達的在先天性免疫系統的調控中起關鍵作用 的一類蛋白質。哺乳動物免疫系統使用兩種一般策略來對抗感染性疾病。病原體暴露迅速 地引發先天性免疫應答，所述免疫應答特征在于免疫刺激細胞因子、趨化因子和多反應性 IgM抗體的產生。先天性免疫系統通過暴露于由一組不同的感染性微生物表達的病原體相 關分子模式(PAMP)而活化。PAMP的識別通過Toll-樣受體家族的成員介導。對特異性寡核苷 酸有反應的TLR受體(如TLR 4、TLR 8和TLR 9)位于被稱為內體的內部特異性細胞內區室。 TLR 4、TLR 8和TLR9受體的調節機制是基于DNA-蛋白質相互作用。
[0136] 包含與在細菌DNA中發現的那些相似的CpG基序的合成免疫刺激性寡核苷酸刺激 TLR受體的類似反應。因此，免疫調節0DN具有各種潛在治療用途，包括治療免疫缺陷和癌 癥。采用用免疫調節0DN功能化的脂質體納米顆粒將允許增加的優先攝取且因此增加的治 療功效。值得注意地，較小顆粒(25至40nm)(如本文提供的那些)更有效地穿透組織屏障，從 而提供先天性免疫應答的更有效的活化。因此，用含有功能性CpG基序的DNA功能化、穩定化 的大小為30nm的小脂質體納米顆粒將提供增強的治療作用。
[0137] 免疫系統的下調將涉及敲低負責Toll樣受體的表達的基因。這種反義方法涉及使 用用特異性反義寡核苷酸序列功能化以敲除任何toll樣蛋白的表達的脂質體納米顆粒。
[0138] 因此，在第六實施方案中，公開利用脂質體顆粒調節toll樣受體的方法。所述方法 通過分別使用TLR激動劑或TLR拮抗劑來上調或下調To 11 -樣受體。所述方法包括使具有 Toll-樣受體的細胞與脂質體顆粒相接觸。所調節的toll-樣受體包括tol 1-樣受體l、toll-樣受體2、toll-樣受體3、toll-樣受體4、toll-樣受體5、toll-樣受體6、toll-樣受體7、 toll-樣受體8、toll-樣受體9、toll-樣受體10、toll-樣受體11、toll-樣受體12以及toll-樣受體13。
[0139] G.脂質體顆粒在Nanoflare技術中的用途
[0140] 在本公開的另外方面，脂質體顆粒用于檢測細胞內靶標。這類方法公開于美國專 利號8，507，200中，所述專利以引用的方式整體并入本文。
[0141]簡言之，將含有對靶分子具有特異性的識別序列的寡核苷酸連接至如本文所描述 的脂質體顆粒。因此，如本文所描述的"識別序列"應被理解為意指與目標靶分子部分或完 全互補的序列。
[0142]具有含有識別序列的連接的寡核苷酸的脂質體顆粒與報道序列初始相關。如本文 所用，"報道序列"應被理解為意指與識別序列部分或完全互補且因此能夠與所述識別序列 雜交的序列。所述報道序列用可檢測的標記(如但不限于熒光團）標記，并且還被稱為纖耀 斑(nanoflare)。所述報道序列在各種方面包含比識別序列少、相同或更多的堿基，以使得 識別序列與其靶分子的結合引起所雜交的報道序列的釋放，從而產生連接至所述報道序列 的標記的可檢測和可測量的變化。
[0143] 本發明通過以下實施例進行說明，所述實施例不意圖以任何方式限制。 實施例
[0144] 實施例1-通用
[0145] 所有試劑是從供應商以最高純度獲得且不經任何進一步純化而使用。在Varian Prostar系統上進行HPLC。在Varian Cary 300分光光度計上記錄UV/V。在SPEX FluoroLog 上熒光計上獲得應該光譜。
[0146] 實施例2-寡核苷酸的合成
[0147] 在自動DNA合成儀(ABI 3400，Applied Biosystems，Inc ·)上以 1 · 0微摩爾規模合 成寡核苷酸。在裂解且用水性氫氧化銨(55°C，14小時)脫保護之后，將DNA通過反相HPLC進 行純化且通過UV光譜儀進行定量。
[0148] 實施例3-脂質體顆粒的合成
[0149] 將脂質單體（40μπι〇1的溶解于氯仿中的1，2_二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿 (D0PC))添加至20mL小瓶且隨后蒸發，之后過夜凍干以除去溶劑，從而產生薄脂質膜。然后 將所述膜用HBS緩沖液(5.0mL，20mM ifepes緩沖液，150mM NaCl(pH 7.4))再水化，接著劇烈 混合以形成脂質體懸浮液且隨后在冰浴中探頭超聲處理30分鐘而無脈沖。然后將所得懸浮 液在104,986g和4°C下超速離心90分鐘。使用元素分析計算磷脂濃度。
[0150] 接下來，在Expedite核苷酸合成系統上經由標準固相亞磷酰胺化學用α-生育酚修 飾合成DNA/RNA鏈。將所述鏈從固體載體裂解且通過反相高效液相色譜法進行純化。
[0151] 最后，將適當的DNA/RNA(16yM)添加至SUV的1.3mM溶液且使其攪拌過夜。然后將所 述顆粒在第二天通過具有100kDa截留的離心過濾器進行純化。然后經由TEM和動態光散射 對顆粒進行分析。用FITC封裝且用CY5標記的DNA表面功能化得脂質體顆粒的凝膠電泳在圖 13中示出。
[0152] 實施例4-脂質體顆粒的細胞攝取的可視化
[0153] 為了可視化LSNA的細胞攝取，將HeLa細胞在:Lab-Tek_ Π Chamber# 1.5 German Coverglass System(Nalge Nunc International)上生長過夜且與Cy5_標記的LSNA(0.1yM 的DNA濃度）一起孵育。在16小時孵育之后，將培養基用新鮮培養基更換，且用赫斯特33342 (Invitrogen)按照制造商的說明書對活細胞進行染色。使用Mai Tai 3308激光器 (Spectra-Physics)用Zeiss 510 LSM在40x放大率下獲得所有圖像。在390-465nm和650-710nm下收集熒光發射，其中激發分別在729和633nm下（圖5)。圖5的左圖示出脂質體熒光素 進入HeLa細胞，而圖5的右圖示出熒光素和Cy5的共定位，從而表明整個脂質體遞送至細胞 中。
[0154] 實施例4-細胞活力
[0155] 用AlamarBlue?.測定（Invitrogen)來評價脂質體顆粒的細胞毒性。簡言之，將 HeLa細胞在96孔板上接種于200yL的培養基中且孵育24小時。然后將細胞用FITC封裝的裸 露SUV和DNA功能化的LSNA在不同濃度的磷脂濃度(0、32.5、65、162.5以1〇下進行處理。在16 小時之后，除去培養基，將細胞用roS洗滌3次且然后與90yL的新鮮培養基和10yL的alamar 藍試劑孵育4小時。然后通過檢查在560nm下的激發和在590nm下的發射來對它們進行分析。
[0156] 實施例5-SUV的制備
[0157] 材料
[0158] 1 ,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿脂質單體（D0PC)購自Avanti Polar Lipids公司，呈干燥粉末形式或呈氯仿溶液形式且不經進一步純化而使用。亞磷酰胺和其 他DNA合成試劑以最高純度購自Glen Research公司且如從制造商所接收樣使用。
[0159] 儀器
[0160] 凍干使用Freezone Lyohilizer(Labconco,Kansas City,M0)進行。超聲處理使用 鈦合金固體實心探頭超聲波儀(500瓦特Vibra-Cell? VC 505，Sonics&Materials，Inc., Newtown ,CT)進行，所述超聲波儀設置在20kHz的40 %強度下而無脈沖。超速離心是使用 Beckman-Coulter Avanti J-30I (Beckmann-Coulter，Inc ·，Indianapolis，IN)進行。透身才 電子顯微術（TEM)是使用Hitachi-2300STEM電子顯微鏡進行。動態光散射（DLS)是使用 Malvern Zetasizer Nano_ZS(Malvern Instruments，UK)收集的。MALDI-ToF分析是使用 Bruker Autoflex III SmartBean質譜儀（Bruker Daltonics Inc.，MA,USA)進行的。焚光 測量在Fluorlog-3系統（H0RIBA Jobin Yvon Inc.,NJ,USA)進行。UV-Vis光譜是使用Cary 5000 UV-Vis分光光度計(Varian Inc.,CA,USA)收集的。
[0161] 寡核苷酸合成
[0162] 使用DCI作為活化劑在Expedite 8909核苷酸合成系統（MM48 Synthesizer, Bioautomation)上使用自動固體載體亞磷酰胺合成來合成寡核苷酸。將生育酸亞磷酰胺經 由自動方案使用延長的15分鐘偶聯時間進行偶聯。在完成固相合成之后，使用用水性氫氧 化銨(28-30 %水溶液，A1 dr i ch)過夜處理將寡核苷酸鏈從固體載體裂解，在所述時間之后 使用氮氣(使用室內氮氣）的緩慢流動除去過量氨。使用Microsorb C18柱在反相高壓液相 色譜(HPLC，Var ian)上使用TEAA (乙酸三乙銨）緩沖液和乙腈(梯度：10 % v/v至100 % v/v乙 腈歷經30分鐘)純化寡核苷酸。在凍干器上濃縮含有產物的所收集的級分。將獲得的寡核苷 酸再懸浮于超純水中且使用MALDI-T0F和變性丙烯酰胺凝膠電泳技術分析純度。
[0163]
[0164]
[0165] 表1.用于實驗中的寡核苷酸序列
[0166] 小單層囊泡的合成
[0167] 將一定體積的脂質單體儲備溶液(25-50mg)添加至20mL小瓶且放置到25mL玻璃小 瓶中，并且使用氮氣流小心地蒸發溶劑。將所獲得的脂質單體在真空下進一步干燥過夜以 除去殘余氯仿。然后將所得脂質膜用20mM HBS(5.0mL)水化，接著渦旋小瓶以形成脂質體懸 浮液。將所述懸浮液進一步探頭超聲處理30分鐘，將脂質混合物的溫度保持在10°C以下（用 冰-水浴冷卻）。在超聲處理之后，使懸浮液在12°C下經受在100,000 Xg的超速離心90分鐘。 在離心之后，收集含有所需小單層囊泡(SUV)的澄清上清液并且丟棄沉淀（圖1)。為了獲得 具有較窄大小分布的顆粒，將所獲得的SUV顆粒進一步通過聚碳酸酯膜(30nm空隙大小)擠 出。
[0168] 將獲得的SUV使用動態光散射(DLS)和透射電子顯微術(TEM)技術（圖11)進一步分 析。經由感應耦合等離子體質譜（ICP-MS)測定給定樣品中的最終磷脂濃度。溶液中的脂質 體的數目和脂質體的表面上的寡核苷酸的數目可根據圖12中描繪的等式進行計算。
[0169] DNA功能化的脂質體SNA的制備
[0170]為了制備脂質體SNA，將15μΜ的所需3'-生育酚修飾的寡核苷酸添加至SUV溶液 (1.3mM的[磷脂])且使其振蕩過夜。然后將所得溶液在交聯瓊脂糖柱（Separose CL 4Β， Aldrich)上經由凝膠過濾色譜法進行純化。使用DLS分析顆粒大小分布。為了使用TEM觀察 脂質體SNA，將樣品放置到等離子體清潔的碳TEM柵格上且用乙酸鈾酰(2%w/v)的溶液進一 步染色(染色2分鐘，隨后用水洗滌且使其干燥）。然后將干燥的柵格在Hitachi-2300STEM電 子顯微鏡下成像。
[0171]脂質體SNA的凝膠電泳
[0172]所有凝膠電泳實驗都在1 X TBE (三硼酸酯，EDTA)緩沖液中的1 %瓊脂糖凝膠中進 行。將樣品在作為負載劑的甘油(30%v/v，5μυ的幫助下負載在孔中。將凝膠室填充1XTBE 并且用冰預先冷卻。將凝膠在l〇°C下在70V下運行1小時并且用具有Cy5濾器的Fluorchem Q 記錄凝膠的圖像。
[0173]脂質體表面上的DNA密度的定量
[0174]為了測定脂質體的表面上的DNA的負載，將增加濃度的Cy5_標記的3'生育酚修飾 的DNA與固定濃度的SUV (1.3mM的[P ])孵育過夜。然后使用凝膠電泳分析脂質體SNA。為了定 量SUV上功能化的DNA密度，將構建體溶解于1%SDS溶液中并且在260nm下收集且使用對應 DNA鏈的消光系數計算吸光度。使用理論等式計算相應溶液中脂質體的數目，其中假定脂質 體的磷脂濃度在功能化之后保持恒定。
[0175] 熔融測定
[0176] 使用用與表1中所描述的接頭鏈互補的鏈功能化的脂質體SNA形成一種雙納米顆 粒-組分系統。通過添加兩種DNA功能化的脂質體SNA形成聚集體且將所述聚集體以1:1比例 雜交至接頭鏈(總DNA濃度1.5μΜ，體積lmL)。使用Cary 5000 UV-Vis光譜儀收集具有所述接 頭的脂質體SNA的吸收光譜并且將其與無所述接頭的脂質體SNA的吸收光譜進行比較。然后 使所述聚集體經受在〇.25°C/分鐘速率下溫度的從20至65°C的逐漸增加，并且在260nm下監 測所述聚集體的吸光度。
[0177] 若丹明封裝
[0178] 將干燥D0PC單體(25mg)再懸浮于HBS(5mL)中的20mM磺酰若丹明B溶液中。將所得 懸浮液通過一系列聚碳酸酯膜（1〇〇11111、8〇11111、5〇11111、3〇111]1大小）逐漸擠出。經由鉸鏈瓊脂糖 (瓊脂糖CL-4B，Aldrich)上的凝膠過濾色譜法使含有若丹明的脂質體與游離若丹明分離。 使用上述程序將所獲得的顆粒用DNA-生育酚綴合物功能化。為了分析構建體的血清穩定 性，將含有若丹明的脂質體和脂質體SNA懸浮于HBS中的10 %胎牛血清溶液中，并且通在 420nm下激發樣品且測量在480nm下的強度來在Fluorlog-3系統中監測染料的釋放。
[0179] 細胞培養研究
[0180] SK0V-3細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)且根據ATCC說明書生長在具有 10%熱滅活的胎牛血清、100U的青霉素和50yg的鏈霉素的McCoy's 5A培養基中且維持在37 °C、5 % C02下。對于細胞研究，將細胞接種24小時，之后再50 %匯合下處理。
[0181]脂質體SNA的共焦顯微鏡檢查
[0182] 為了可視化脂質體SNA的細胞內化，將SK0V3細胞以50 %匯合接種在35mm FluoroDish?室上。將細胞與Cy5標記的脂質體SNA(0.1yM的DNA濃度)在培養基中孵育20小 時，接著用含有〇. 〇 1 % (按體積計)tween-20的1 X roS洗滌，然后用新鮮培養基更換。將細胞 核用赫斯特3342(Invitrogen)按照制造商的方案進行染色。然后將活細胞用具有Mai Tai 3308激光器的Zeiss LSM 510倒置激光掃描共焦顯微鏡(Spectra-Physics)在40x放大率下 成像。將赫斯特在780nm下激發且在390-495nm收集并且在640nm下激發且在650-71 Onm下發 射。
[0183] 流式細胞術實驗
[0184] 為了比較脂質體SNA與游離DNA鏈的細胞攝取，將所述細胞在96孔板上接種于100μ L的培養基中且與Ο.ΙμΜ濃度的游離DNA或脂質體SNA-起孵育24小時。未處理的細胞用作實 驗的陰性對照。在所述孵育期之后，將細胞用含有0.01 % (按體積計）的Tween-20的1 XPBS 洗滌三次且然后胰蛋白酶化以形成懸浮液。如針對背景強度使使用來自未處理的細胞的信 號在Guava easyCyte 8HT(Millipore，USA)上用Cy5強度通道對細胞懸浮液進行流式細胞 術。使用來自表示單一樣品的不同孔的中值信號的平均值的標準誤差計算誤差值。
[0185] 細胞毒性研究(MTT測定）：
[0186] 為了評價脂質體SNA的細胞毒性，在實驗之前24小時將SK0V-3細胞接種在96孔班 上。將所述細胞在不同的DNA濃度下用脂質體SNA處理24小時。將脂質體SNA的細胞毒性與 IMiarmaFECT· 1 (Dharmacon)(可商購的轉染劑)進行比較。將所述細胞用不同濃度的用 DliarmaFECT_l轉染的DNA按照制造商的轉染方案進行轉染。未接受處理的細胞用作陰性 對照。在24小時的孵育期之后，將所述細胞用1 X PBS洗滌三次且與alamarBlue?溶液 (Thermo Fisher Scientific Inc.)-起孵育且在37°C在5%⑶2中孵育4小時。使用 BioTek,Synergy H4 Hybrid讀書器記錄在590nm下的焚光發射。
[0187]用于定量HER2蛋白質敲低的蛋白質印跡
[0188] 將SK0V-3細胞接種在6孔板中且在37°C下在5%C02中孵育過夜。將細胞與抗HER2 反義脂質體SNA和錯義脂質體SNA-起孵育。在處理24小時之后，將培養基用新鮮培養基更 換并且使細胞生長另外48小時。為了分析HER2蛋白質敲低，將細胞收集且再懸浮于含有蛋 白酶和磷酸酶抑制劑（Thermo Scientific，IL，USA)的100yL哺乳動物細胞裂解緩沖液 (Cell Signaling，MA，USA)中。使用BCA蛋白質測定試劑盒(Pierce，IL，USA)測定細胞溶解 產物中的蛋白質濃度。將相等量(20yg)的蛋白質通過4-20%Precast梯度凝膠(Bio-Rad)分 級分離并且轉移至硝基纖維素膜(Thermo Scientific，IL，USA)。將膜使用5%脫脂奶粉溶 液(w/v)在tris-緩沖鹽水(TBS)中封閉。用針對HER2(1:1000)和GAH)H(1: 500)的第一兔抗 體檢測蛋白質，接著用抗兔第二抗體（1:1〇,〇〇〇) (LI-C0R Biosciences，NE，USA)檢測蛋白 質。使用Odyssey?紅外成像系統(LI-C0R Biosciences，NE，USA)記錄熒光信號。
[0189] 合成
[0190]在兩個步驟中合成典型的脂質體SNA(圖7)。第一步驟涉及從脂質單體制備30nm直 徑單層囊泡。這種大小的顆粒從SNA轉染的角度是理想的，并且是用于最大化較高血液循環 和最小化通過腎清除的適當范圍。不幸的是，這種大小范圍中的脂質體經常是不穩定的且 融合而形成較大結構。因此，此工作的目標是確定合成這類結構且避免這類顆粒生長途徑 的方式。
[0191] 為了制備小單層囊泡(SUV)，選擇D0PC(1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿）， 其是從磷酸酯部分延伸且以季銨頭部基團終止的含有兩種油酸衍生物的不飽和脂質。在典 型實驗中，將D0PC單體于20mM HBS中的懸浮液超聲處理以產生平均30nmSUV顆粒。將所述顆 粒通過離心（100, 〇〇〇 Xg)分離。通過具有30nm孔的聚碳酸酯膜進一步擠出這種材料產生具 有0.11多分散性指數(PDI)、70%總體產率的顆粒。然后將所述顆粒再分散于鹽水中，并且 DLS用于確認其30 ± 3nm直徑，其還使用陰性染色通過TEM分析隨后確認。
[0192] 第二合成步驟涉及用具有疏水性生育酚部分的核酸衍生物進行脂質體的表面功 能化，其有效地插入到限定SUV的脂質雙層中。雖然多種疏水性頭部基團可以是適合的 [Pfeiffer等人，J.Am. Chem. Soc · 126:10224(2004) ;Banchelli等人，J.Phys · Chem.B 112: 10942(2008) ;Dave等人，ACS Nano 5:1304(2011) ;Jakobsen等人，Bioconjugate Chem.24: 1485(2013)]，但選擇a-生育酚(維生素 E的一種形式），這是由于其生物相容性和低成本。利 用可商購的生育酚亞磷酰胺衍生物(Glenn Research)，將a-生育酚經由常規核苷酸合成安 裝到核酸鏈(DNA)。通過使用8:1的脂質-核酸比例將SUV的懸浮液(1.3mM按脂質計)與核酸-生育酚綴合物（16mM)在室溫下孵育12小時來合成脂質體SNA。然后在瓊脂糖柱(瓊脂糖4LB) 上通過大小排阻色譜法從所述樣品除去不含脂質體的生育酚-核酸。在DNA的情況下，從-1 至-23的ζ電勢的顯著降低在所述步驟之后發生，從而指示用帶負電荷的核酸脂質體表面功 能化。此外，最終納米顆粒樣品的動態光散射(DLS)分析顯示顆粒大小從30至46nm的增加， 這與8-9nm長雙鏈體結構的負載一致。為了定量地測定負載到脂質體表面上的核酸鏈的平 均數目，將脂質體-SNA在Triton X存在下溶解以釋放它們。通過相對于校準的寡核苷酸標 準測量在260nm下的吸光度來測定最終核酸濃度。涂覆有DNA的脂質體SNA具有平均70個鏈/ 顆粒（圖17 )。此密度低于典型的基于金的SNA結構[Hurst等人，Anal. Chem. 78 : 8313 (2006)]，但足以表現出這類結構的許多協作特性。脂質體SNA的圖形描述提供于圖16中。
[0193] 這些脂質體SNA結構具有幾種令人感興趣的特性。首先，它們相較于它們所源自的 天然30nm脂質體構建體是相當穩定的（圖2,圖8)。例如，如果將無寡核苷酸表面層的SUV在 37°C (生理溫度)下儲存四天，它們融合且形成較大多分散結構(具有一些微米大小實體的 100nm結構）。相較之下，脂質體SNA在幾乎相同的條件下載相同時間段內未顯示顆粒降解或 融合的跡象。脂質體-SNA系統的穩定性的這種增加可能是包含脂質體-SNA表面的帶負電荷 的核酸鏈之間的排斥力的結果，所述排斥力使單獨顆粒穩定化且抑制顆粒-顆粒融合相互 作用[Li等人，Biocon jugate Chem. 24:1790(2013)]。此外，脂質體-SNA上的帶負電荷的DNA 電暈充當脂質體核心的保護層，從而防止其在存在血清蛋白的情況下降解[Senior等人， Life Sci · 30:2123( 1982) ;Kim等人，Arch.Pharmacal Res · 14:336( 1991); Sulkovvski 等人， J.Mo 1. Struct. 744-747:737(2005)]。例如，通過測量在20mM的自淬滅濃度(核心濃度)下物 理地并入脂質體-SNA的核心內的磺酰若丹明染料的釋放來研究脂質體-SNA系統的血清穩 定性。在所述實驗中，脂質體核心的破裂導致磺酰若丹明染料從顆粒的內部釋放以及自淬 滅的隨后消除，從而產生熒光的增加[Versluis等人，J.Am.Chem.Soc. 135:8057(2013)]。在 典型實驗中，將含有若丹明的脂質體納米顆粒在10%胎牛血清中在37°C下孵育，并且持續3 小時連續記錄焚光光譜。對于未功能化的顆粒進行相同穩定性研究。類似于熱穩定性研究， DNA功能化的顆粒針對實驗持續時間在血清中保持穩定。在3小時孵育過程中未觀察到染料 的釋放。相較之下，孵育裸露D0PC脂質體導致若丹明熒光團的顯著釋放，從而指示脂質體結 構在血清中的快速分解(圖8)。
[0194] 脂質體SNA的第二特性是其協同結合互補核酸的能力。這是所有SNA的標志特征并 且源自表面結合的核酸的致密包裝且高度定向的構型。為了探索脂質體-SNA構建體的結合 和隨后熔融特性，合成各自用不同的DNA序列制備的兩組脂質體-SNA納米顆粒:顆粒A和顆 粒B。與脂質體-SNA的寡核苷酸序列互補的DNA接頭序列用于通過雜交促進聚合。在將接頭 序列添加至兩種脂質體SNA顆粒的等摩爾混合物之后，聚集發生，如由DLS所證明；并且最終 形成片狀沉淀[Dave等人，ACS Nano 5:1304(2011)]。將這些聚集體再懸浮于20mM HBS (150mM NaCl)中，并且通過監測在260nm下的吸光度來進行熔融分析。重要地，在47.5 °C下 觀察到顯著較窄的熔融轉變(在第一衍生物的半最大值下全部寬度是大約2°C)，這高度診 斷具有高表面核酸密度的SNA結構（圖9)。
[0195] SNA的重要特性涉及其無需輔助轉染劑進入細胞的能力[Cutler等人， J.Am.Chem. Soc. 134:1376(2012)]。為了測定脂質體SNA是否表現出這種行為，將卵巢癌腹 水(SK0V3，美國典型培養物保藏中心)在用5 ' -Cy 5-標記的DNA合成的SNA存在下在不存在任 何轉染劑的情況下在不同DNA濃度下孵育。使用共焦顯微鏡檢查和流式細胞術技術對SK0V3 細胞中脂質體-SNA的攝取進行分析。顯著地，脂質體SNA即使在1小時孵育之后也容易地大 量進入細胞，這證明其作為細胞內探針和靶標調控劑的效用。此外，即使在相同條件下36小 時孵育之后，也未檢測到SK0V3細胞中游離DNA鏈(5 ' -Cy5-標記的）的顯著攝取。類似于Au-SNA，SK0V3細胞中脂質體-SNA的高攝取即使在高濃度下也未引起任何細胞毒性（圖10)。相 反，在試圖遞送由脂質體-SNA遞送的相等DNA中采用DharmaFECTDNA產生顯著細胞毒性，這 在24小時孵育期內使細胞活力降低至35 %。
[0196] 在確立脂質體-SNA無細胞毒性之后，合成能夠敲低人表皮生長因子受體2(HER2) (在SK0V3細胞中過度表達的致癌基因）的脂質體-SNA[Zhang等人，J.Am.Chem.Soc.134: 16488(2012)]。為了比較脂質體-SNA與常規轉染系統的反義活性的有效性，將SK0V3細胞在 抗HER2脂質體-SNA和對照脂質體-SNA(各自在ΙμΜ的DNA濃度下)存在下進行孵育。在72小時 孵育之后，收獲細胞并且通過蛋白質印跡針對蛋白質含量進行分析。重要地，HER2蛋白質水 平在抗HER2脂質體-SNA存在下相較于內部參考基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)降低 85% (圖10)。總之，這些結果證明使用脂質體-SNA來實現細胞轉染和基因調控的潛力。
[0197] 總之，已經開發了新穎無金屬脂質體SNA的可縮放的合成途徑。這類結構是從可容 易獲得的無毒起始材料快速組裝的。所述核酸構造不僅使這些小脂質體結構穩定化，而且 還促進其通過SK0V3細胞的內化。因此，這類結構顯示作為新的生物相容的基因調控構建體 的效用，所述構建體表現出更常規的基于金納米顆粒的SNA許多有吸引力的特性。
[0198] 實施例6-在Ramos-Blue?細胞中測試脂質體顆粒
[0199] Ramos-Blue?細胞是NF-κΒ/ΑΡ-Ι受體B淋巴細胞。Ramos-Blue是穩定地表達NF-kB/ AP-1-誘導型SEAP(分泌的胚胎堿性磷酸酶)受體基因的B淋巴細胞系。當刺激時，它們產生 在上清液中產生SEAP，這可使用QUANTI-Blue測定容易地監測。QUANTI-Blue是在SEAP存在 下變藍的SEAP檢測介質（圖14)。
[0200] 當與含有CpG的寡核苷酸相接觸時，檢測到Ramos-Blue細胞的活化（圖15)。基于 TLR9-激動寡核苷酸CpG 7909(5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'（SEQIDN0:8))合成代 表性化合物。這些包括具有在13nm金納米顆粒上致密功能化的磷酸二酯主鏈的CpG 7909 (CpG 7909-po SNA(Au))、具有完全硫代磷酸酯主鏈的CpG 7909(CpG 7909-ps)、具有磷酸 二酯CpG 7909的脂質體SNA(7909靶向（顆粒））、全部磷酸二酯主鏈寡核苷酸的C和G反轉以 消除TLR 9結合位點的脂質體SNA(7909對照(顆粒））、具有磷酸二酯主鏈和3'-生育酚脂質 而無需配制成脂質體SNA的CpG 7909(7909靶向（生育酚））、以及具有反轉的C和G的也無需 配置成脂質體SNA的對照序列(7909對照(生育酚））。將這些化合物連續稀釋，然后與Ramos-Blue 細胞 (一種在活化促炎性轉錄因子 NF-κΒ 時表達分泌 的堿性磷酸酶 (SEAP) 的細胞) 孵育 過夜，且然后經由QuantiBlue試劑盒（InVivogen)針對細胞培養基中的SEAP水平進行探測。 通過在650nm下的光吸收測量活化。
[0201] 實施例7-使用脂質體顆粒來調控HIFl-a
[0202] 為了進一步證明本公開的組合物的有效性，將脂質體顆粒設計成單獨靶向HIFl-a 和ΒΑΧ。所述實驗利用Neur〇-2a(N2A)細胞系，其是快速生長的小鼠成神經細胞瘤細胞系。使 N2A細胞與靶向HIFl-α(圖18)和ΒΑΧ(圖19)的脂質顆粒相接觸顯示靶基因產物的量的顯著 減少。在所述實驗中的每個中，在于6孔板中開始處理Ν2Α細胞之后72小時通過定量PCR (qPCR)測定mRNA表達的相對量-將細胞在OptiMEM中用脂質體顆粒處理24小時，之后除去脂 質體顆粒且用MEM和10 %胎牛血清(FBS)更換培養基。
[0203] 對于靶向HIFl-a的實驗，首先使N2A細胞經受Cocl2_刺激的缺氧，這使HIFl-amRNA 表達增加約50 %。接著，使N2A細胞與用針對HIFl-a的siRNA功能化的脂質體顆粒相接觸。所 述接觸導致HIFl-a敲低約50% (圖18)。
[0204] 對于靶向ΒΑΧ的實驗，用處理N2A細胞導致通過脂質體顆粒大約65 %敲低ΒΑΧ mRNA，以及通過脂質膠束SNA大于50%敲低BAX mRNA(如針對對照脂質體SNA所測量）（圖 19)〇
[0205]這些實驗表明本公開的脂質體顆粒在抑制哺乳動物細胞中的靶基因表達方面是 高度有效的。
[0206]對于本領域的技術人員將顯而易見，本發明不限于前述說明性實施例，并且本發 明可以其他特定形式實施而不背離其本質屬性。因此期望所述實施例在所有方面被視為說 明性而非限制性的，參考所附權利要求書而不是參考前述實施例，并且所有變化在權利要 求書的等價意義和范圍內且因此意圖涵蓋于其中。
【主權項】
1. 一種脂質體顆粒，所述脂質體顆粒具有大致上球形的幾何形狀，所述脂質體顆粒包 含： 脂質雙層，其包含多個脂質基團；以及 寡核苷酸。2. 如權利要求1所述的脂質體顆粒，其中所述多個脂質基團包含選自由脂質的磷脂酰 膽堿、磷脂酰甘油以及磷脂酰乙醇胺家族組成的組的脂質。3. 如權利要求2所述的脂質體顆粒，其中所述脂質選自由以下各項組成的組：1，2_二油 酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰膽堿(DMPC)、1-棕櫚酰 基-2-油酰基-sn-磷脂酰膽堿(POPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸-0- -rac-甘油） (DSPG)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-0- -rac-甘油）（DOPG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘 油基-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二-(9Z-十 八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)以及1，2-雙十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙 醇胺(DPPE)。4. 如權利要求1-3中任一項所述的脂質體顆粒，其中所述寡核苷酸是含有親脂性栓系 基團的寡核苷酸-脂質綴合物，其中所述親脂性栓系基團被吸附至所述脂質雙層中。5. 如權利要求4所述的脂質體顆粒，其中所述親脂性栓系基團包含生育酚或膽固醇。6. 如權利要求5所述的脂質體顆粒，其中生育酚選自由生育酚衍生物α-生育酚、β-生育 酚、γ-生育酚以及&生育酚組成的組。7. 如權利要求1-6中任一項所述的脂質體顆粒，其中所述寡核苷酸包含RNA或DNA。8. 如權利要求7所述的脂質體顆粒，其中所述RNA是非編碼RNA。9. 如權利要求8所述的脂質體顆粒，其中所述非編碼RNA是抑制性RNA(RNAi)。10. 如權利要求8或權利要求9所述的脂質體顆粒，其中所述RNAi選自由小抑制性RNA (siRNA)、與雙鏈DNA形成三鏈體的單鏈RNA(ssRNA)以及核酶組成的組。11. 如權利要求8或權利要求9所述的脂質體顆粒，其中所述RNA是微RNA。12. 如權利要求7所述的脂質體顆粒，其中所述DNA是反義DNA。13. 如權利要求1-12中任一項所述的脂質體顆粒，其中所述脂質體顆粒的直徑小于或 等于約50納米。14. 如權利要求1-13中任一項所述的脂質體顆粒，其中所述顆粒包含約10至約80個寡 核苷酸。15. 如權利要求14所述的脂質體顆粒，其中所述顆粒包含70個寡核苷酸。16. 如權利要求1-15中任一項所述的脂質體顆粒，其中所述寡核苷酸是修飾的寡核苷 酸。17. -種制備脂質體顆粒的方法，所述方法包括： 將磷脂添加至溶劑以形成第一混合物，所述第一混合物包含多個脂質體； 破壞所述多個脂質體以產生第二混合物，所述第二混合物包含脂質體和小單層囊泡 (SUV)； 從所述第二混合物分離所述SUV，所述SUV具有約20納米與50納米之間的顆粒大小； 將寡核苷酸添加至所述分離的SUV以制備所述脂質體顆粒。18. 如權利要求17所述的方法，其中所述第一混合物中的所述多個脂質體的顆粒大小 在約100納米與150納米之間。19. 如權利要求17或權利要求18所述的方法，其中所述第二混合物中的所述脂質體和 所述SUV的顆粒大小在約20納米與約150納米之間。20. 如權利要求17所述的方法，其中所述脂質體顆粒具有小于或等于約50納米的顆粒 大小。21. 如權利要求17-20中任一項所述的脂質體顆粒，其中所述寡核苷酸是含有親脂性栓 系基團的寡核苷酸-脂質綴合物，其中所述親脂性栓系基團被吸附至所述脂質雙層中。22. 如權利要求21所述的方法，其中所述親脂性栓系基團包含生育酚或膽固醇。23. 如權利要求22所述的方法，其中生育酚選自由生育酚衍生物α-生育酚、β-生育酚、 γ -生育酚以及&生育酚組成的組。24. 如權利要求17-23中任一項所述的方法，其中所述寡核苷酸包含RNA或DNA。25. 如權利要求24所述的方法，其中所述RNA是非編碼RNA。26. 如權利要求25所述的方法，其中所述非編碼RNA是抑制性RNA(RNAi)。27. 如權利要求26所述的方法，其中所述RNAi選自由小抑制性RNA(siRNA)、與雙鏈DNA 形成三鏈體的單鏈RNA( ssRNA)以及核酶組成的組。28. 如權利要求24所述的方法，其中所述RNA是微RNA。29. 如權利要求24所述的方法，其中所述DNA是反義DNA。30. 如權利要求17-29中任一項所述的方法，其中所述寡核苷酸是修飾的寡核苷酸。31. -種抑制基因的表達的方法，所述方法包括以下步驟:將編碼所述基因產物的多核 苷酸與同所述多核苷酸的全部或一部分互補的一個或多個寡核苷酸雜交，所述寡核苷酸被 連接至如權利要求1-16中任一項所述的脂質體顆粒，其中所述多核苷酸與所述寡核苷酸之 間的雜交在所述多核苷酸的具有足以抑制所述基因產物的表達的互補性程度的長度內發 生。32. 如權利要求29所述的方法，其中在體內抑制所述基因產物的表達。33. 如權利要求29所述的方法，其中在體外抑制所述基因產物的表達。34. 如權利要求31-33中任一項所述的方法，其中所述脂質體顆粒具有約小于或等于50 納米的直徑。35. 如權利要求31-34中任一項所述的方法，其中所述寡核苷酸包含RNA或DNA。36. 如權利要求35所述的方法，其中所述RNA是非編碼RNA。37. 如權利要求36所述的方法，其中所述非編碼RNA是抑制性RNA(RNAi)。38. 如權利要求37所述的方法，其中所述RNAi選自由小抑制性RNA(siRNA)、與雙鏈DNA 形成三鏈體的單鏈RNA( ssRNA)以及核酶組成的組。39. 如權利要求35所述的方法，其中所述RNA是微RNA。40. 如權利要求35所述的方法，其中所述DNA是反義DNA。41. 一種上調toll-樣受體(TLR)的活性的方法，所述方法包括使具有所述toll-樣受體 的細胞與如權利要求1 -16中任一項所述的脂質體顆粒相接觸。42. 如權利要求41所述的方法，其中所述寡核苷酸是TLR激動劑。43. 如權利要求41或權利要求42所述的方法，其中所述toll-樣受體選自由以下各項組 成的組:toll-樣受體1、toll-樣受體2、toll-樣受體3、toll-樣受體4、toll-樣受體5、toll- 樣受體6、toll-樣受體7、toll-樣受體8、to 11-樣受體9、toll-樣受體10、toll-樣受體11、 toll-樣受體12以及toll-樣受體13。44. 一種下調toll-樣受體(TLR)的活性的方法，所述方法包括使具有所述toll-樣受體 的細胞與如權利要求1 -16中任一項所述的脂質體顆粒相接觸。45. 如權利要求44所述的方法，其中所述寡核苷酸是TLR拮抗劑。46. 如權利要求44或權利要求45所述的方法，其中所述toll-樣受體選自由以下各項組 成的組:toll-樣受體1、toll-樣受體2、toll-樣受體3、toll-樣受體4、toll-樣受體5、toll-樣受體6、toll-樣受體7、toll-樣受體8、to 11-樣受體9、toll-樣受體10、toll-樣受體11、 toll-樣受體12以及toll-樣受體13。47. 如權利要求41-46中任一項所述的方法，其是在體外進行。48. 如權利要求41-46中任一項所述的方法，其是在體內進行。
【文檔編號】A61K8/14GK105939699SQ201480072672
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年12月3日
【發明人】查德·A·米爾金, 松兵·T·恩吉耶, 雷沙姆·辛格·邦加, 納塔利·切爾尼亞克, 謝爾蓋·格里亞茲諾夫, 亞歷山大·拉多維奇-莫雷諾, 克里斯托弗·梅德
【申請人】西北大學, 埃克西奎雷股份有限公司