專利名稱：原位構建基因突變文庫的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質工程、分子生物學技術、基因工程領域，具體涉及一種原 位構建基因突變文庫的方法，以及用這種方法構建1至多級突變文庫的試劑盒。
背景技術：
體外定向進化不僅為研究酶的底物特異性和確定酶的催化活性位點，改善酶 的熱穩定性等方面提供了強有力的手段，而且有助于了解蛋白結構與功能之間的 關系。定向進化策略主要是體外模擬自然進化過程，快速，高效地建立一個隨機 突變的基因文庫，這已成為蛋白質工程研究的重要措施。
易錯PCR是構建基因突變文庫的一種基本方法，其原理是在PCR過程中通 過調整Mg^和Mn^濃度等因素，提高r叫酶在擴增過程中引入錯配堿基的頻 次，導致目標基因的擴增產物發生適量的隨機突變(Kammann e ，Nucleic Acids Res. 1989, 17(13): 5404)。早期的通過易錯PCR構建突變文庫的步驟包括1)以 目標基因為模板在易錯條件下進行擴增出含有錯配堿基的突變基因；2)用限制 性內切酶對突變基因進行末端處理；3)用DNA連接酶將突變基因連接到表達載 體上；4)將重組的表達載體導入宿主細胞，獲得帶有各種不同突變基因的重組 細胞群體，即基因突變文庫。這個過程相當于對目標基因進行了再一次克隆或稱 亞克隆，所不同的是亞克隆只需要獲得幾個轉化子，而一個基因隨機突變文庫需 要從成千上萬個轉化子，才能從中篩選出目標突變子。
隨著現代科技的發展，早期發明的突變文庫的構建方法顯現出步驟煩瑣和效 率低等問題。為了提高構建基因突變文庫的效率，Miyazaki和Takenouchi于2002 年提出大引物擴增法(Biotechniques， 33(5): 1033-1036)，對上述方法中的第2 步和第3歩進行了替換以隨機突變后的目標基因為大引物，以表達質粒為模板， 采用高保真DNA聚合酶進行PCR，擴增出質粒的全長片斷；再用Z^" I的處理， 將模板質粒降解。這樣產生的含有突變基因的雙鏈質粒，避免了限制性內切酶處 理過程和突變基因與表達載體的連接過程。
大引物擴增法使構建基因突變文庫的效率提高了一些，但是其中仍然有很多不足之處，例如，其中所使用的大引物是特定基因的突變群體，不具有通用性； 只有當大引物大小在500-1000 bp才能獲得較好的擴增效果，突變基因的大小受 到限制；大引物擴增出來的是線性DNA，在退火時難以形成兩個缺口的環狀質 粒，轉化效率低；大引物誘變方法同樣需要對PCR產物進行酶切，對質粒模板 進行消化，步驟煩瑣。因此，構建基因突變文庫需要有簡便、快捷、具有通用性 的新方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種原位構建基因突變文庫的方法，以及用于方便實施 該方法的試劑盒。
本發明涉及用于原位構建基因突變文庫的方法和試劑盒，所說的原位構建基 因突變文庫的方法，其步驟是
(1) 將需要突變的目標基因克隆到表達載體的多克隆位點中構建成基因表 達質粒，并將基因表達質粒導入大腸桿菌，確認目標基因在大腸桿菌中得到表達；
(2) 以基因表達質粒為模板，用選擇標記不同于基因表達質粒的載體片斷 作引物，加入極耐熱性DNA連接酶、7邵DNA聚合酶和PCR緩沖液(含dNTP， MgCl2)， MnCl2禾P NAD+等；
(3) 在全自動PCR儀中進行易錯PCR和連接反應；
(4) 用PCR產物轉化大腸桿菌感受態細胞，并在與引物所帶的選擇標記相 應的抗性平板上，選擇性地培養含突變基因的轉化子，獲取含正突變基因的重組 質粒。
本發明的試劑盒含有 一種含pUC18/19復制基因的大小為2. 2至3 kb基因 高效表達載體；極耐熱性DNA連接酶；與高效表達載體相應的帶有不同抗性基 因的線性載體片段。
本發明方法的原理如圖l所示，(a)在初次循環中，以帶有抗性基因A(如 amp，氨芐青霉素抗性基因)的基因表達質粒為模板，帶有抗性基因B (如kan， 卡那霉素抗性基因)的線性載體片段為引物，對模板中的目標基因或部分目標基 因在易錯條件下進行聚合酶聚合反應，聚合完成后隨即被DNA連接酶連接成環 狀DNA，并進入下一個熱循環；(b)易錯PCR完成后，用PCR反應液轉化大腸 桿菌細胞，并在與抗性基因B相應的抗生素平條件下篩選；(c)再以正突變子 中的帶有抗性基因B質粒為模板，帶有抗性基因A的線性載體片段為引物，進行下一輪突變和篩選(d)。
本發明的特點在于極耐熱性DNA連接酶在PCR過程中介導擴增片段的環 化，產生的環狀質粒可直接用于基因轉化；在小型表達載體中以高保真性的線性 載體片段為引物，對表達質粒中的目標基因進行局部易錯PCR;通過不同的篩選
標記選擇性地培養含突變基因的轉化子，達到基因突變產物與原始模板分離。
上述原位構建基因突變文庫的方法步驟(1)和步驟(4)中涉及的目標基
因的克隆、大腸桿菌的基因轉化等相關操作均按《分子克隆手冊》第三版上的標
準方法進行的(Sambrook and Russell, 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。
上述原位構建基因突變文庫的方法步驟(2)中MnCl2的濃度與易錯PCR的 突變頻率相關，推薦濃度范圍為0.05 0.5mM，建議對小于1 kb的目標基因采 用較高的MnCl2濃度，對大于1 kb的基因適當降低MnCl2的濃度。極耐熱性DNA 連接酶和NAD+按實施例中的用量使用；其它酶和試劑的濃度按常規PCR條件 使用。
上述原位構建基因突變文庫的方法步驟(3)中，連接反應和PCR反應同步 進行，建議參考實施例提供的反應溫度設定熱循環程序。
上述步驟原位構建基因突變文庫的方法(4)突變子的篩選方法因目標基因 性質而異，與本發明的技術沒有直接關系。突變子中，基因產物的性狀表現為向 所期望的目標性狀轉變的突變稱為正突變。
從所獲得的目標突變子中提取的含正突變基因的重組質粒可以被再次用作 模板，立即進入新一輪的隨機突變和篩選(圖l)。
所說的"原位"指對已經被插入表達載體的目標基因構建基因突變文庫的過 程中不需要進行再次克隆。試劑盒EvoGen Kit為用該方法構建基因突變文庫提 供了所需要的各種試劑和引物，其中包括普通制劑和特征性制劑。普通制劑包括 常規PCR所需要的DNA聚合酶和含dNTP和Mg"的PCR緩沖液、連接反應需要的 NAD+溶液，以及誘變所需要的MnCl2溶液。
本發明方法和試劑盒中，所使用的特征性制劑及其制備方法如下 (1)所說的表達載體是從pUC18/19改建的大小為2. 2至2. 5 kb基因高效 表達載體。本方法推薦使用pHsh系列的受cr32或(77()識別的表達載體，因為它 們分別帶三種不同抗性基因，而且可根據需要選擇分泌型表達、低溫或無誘導表 達。pHsh系列表達載體的性質參見國際專利文獻WO 2006/002574 Al和美國專利 文獻US-2007-0254335-A1;其基因序列參見基因庫資料(GenBank accession No.FJ571619, FJ571620， FJ571621， FJ715938， Fj715939)。
(2) 所說的極耐熱性DNA連接酶是從嗜極端高溫的細菌或古菌克隆和異源 表達的DNA連接酶，建議選用海棲熱袍菌(77 er7z "o卵/z7arj'ti'鵬)熱穩定性DNA 連接酶，其制備方法是用一對引物(5'-CTTCATATGAGTGAGAGAAAGAT C-3'禾n 5'-ACAAAGCTTACTCCATTCCTTCCAAC陽3')，從海棲熱袍菌基因 組中擴增DNA連接酶基因(GenBank accession No: NC_000853)，克隆到表達載 體pET-20b(+) (Novagen, Darmstadt Germany)，構建成重組質粒pET-//gaw，導 入￡ co//JM109(DE3)中進行表達，并純化出重組酶(圖2)。具體操作參考《分 子克隆手冊》第三版上的標準方法(Sambrook and Russell,2001,CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。
(3) 表達載體線性片段試劑盒提供兩種帶有不同選擇標記的表達載體片
段，其制備方法是分另ll以pHsh-amp、 pHsh-fe "或pHsh-c必 (GenBank accession No. FJ571619, FJ571620, FJ571621)為模板，用一對磷酸化的引物(5，-pCCTCC ATGGG TATAT CTCCT T-3'和5'—pAAGCT TGA AG GCCGC TTCCG A-3，)，并采
用高保真性的戶,o6eWDNA聚合酶(TaKaRa)進行PCR擴增。
本發明的有益效果體現在
(1) 原位隨機突變，效率高，操作方便極耐熱性DNA連接酶介導的環狀
質粒擴增，省略了限制性酶切、連接等繁瑣且降低效率的操作；
(2) 可進行大范圍的突變目標基因的大小不影響突變效果，還可以根據 具體要求制備線性表達質粒的片段，對目標基因中的特定區域進行隨機突變；
(3) 對突變體具有選擇性通過不同的篩選標記選擇性地培養含突變基因 的轉化子，將基因突變產物與原始模板分離，便于平板篩選和高通量篩選；
(4) 材料與方法具有通用性 一套試劑適用于各種目標基因；
(5) 便于進行多級隨機突變從篩選到的目標突變子中提取的含正突變基 因的重組質粒，可以用作模板直接進入突變文庫的再次構建，通過篩選獲得2 級或多級累加的正突變。
圖l.原位隨機突變原理示意圖。
圖2.海棲熱袍菌熱穩定性DNA連接酶的表達和純化的電泳分析。聚丙烯 酰氨凝膠電泳圖中，泳道M:蛋白分子量標準；泳道l:含pET-20b的大腸桿菌
JM109(DE3)的胞內全蛋白；泳道2:從含pET-//gaw的大腸桿菌JM109(DE3)提 取的粗酶液；泳道3:粗酶液經過75'C熱處理和離心；泳道4: His-tagged親和 層析后獲得的純酶。
圖3.實施例1中的易錯PCR反應產物的瓊脂糖凝膠電泳分析。
M, DNA分子量標準；1 ,空白對照，不加Tm DNA ligase和ra《DNA聚合酶 的PCR反應；2,不加Tm DNA ligase，力P T叫DNA聚合酶的PCR反應；3和4， 加入Tm DNA ligase和T叫DNA聚合酶的PCR反應。
圖4.實施例1中的易錯PCR產物轉化到宿主大腸桿菌中，突變子在含有 木聚糖的LB平板上生長。
圖5.實施例2易錯PCR產物轉化到宿主大腸桿菌中，突變子在含有羧甲 基纖維素(CMC)的LB平板上生長。
具體實施例
下面結合具體的實施例及附圖進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施 例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
在以下實施例中所使用的術語，除非有另外說明， 一般具有本領域普通技術 人員通常理解的含義；實施例中未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的 常規方法，可參考《分子克隆手冊》第三版上的標準方法(SambrookandRussdl， 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York);所用特征性制劑在發明內容部 分已經描述，其它常規試劑的來源、商品名以及有必要列出組成成分者，均在首 次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。
以下實施列中涉及的pHsh系列載體，由發明人實驗室構建保存；公眾可從 發明人實驗室獲取，也可根據現有技術自行構建。
實施例l:疏棉狀嗜熱絲孢菌(77iw附(w^ces/做"g/"仍附)木聚糖酶基因突變文
庫的構建和篩選(1) 根據疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶基因序列(GenBank: U35436)合成 編碼成熟肽的完整基因，并插入帶有氨芐青霉素抗性基因的表達載體pHsh-amp 構建成重組表達質粒pHsh-Jcy"J，具體方法參見Yin Erkang等(World J Microbiol Biotechnol， 2008, 24: 275-280)。
(2) 以pHsh-:c""為模板，選用帶有卡那霉素抗性基因的線性載體片段為 引物，配制以下PCR反應體系(20pl):
線性載體片段1 pi
熱穩定性DNA連接酶1 pi
質粒模板(pHsh-x，J)1 pi (30 ng爾l)
10 mM MnCl20.8 pi
10xPCR buffer2 pi
10 mM NAD+ (sigma公司)1 ^
ddH2012.8 pi
ra《DNA聚合酶(TaKaRa)0.4 pi ( 0.5 U )
(3) PCR擴增，循環程序為95°C， 5min; (94°C， 1 min, 72°C， 1.5 min 和60°C， 2 min) X15循環；60。C延伸10 min。 PCR完成后對產物進行瓊脂糖 凝膠電泳分析(圖3)。結果表明，在同時加入r叫DNA聚合酶和TmDNAligase 的PCR反應中，環狀質粒條帶中DNA量有明顯的提高。
(4) PCR產物轉化￡ JM109感受態細胞(Promega Corp., Madison, WI, USA),涂布在含有2%木聚糖和卡那霉素的LB培養基平板上，置37匸溫箱中 培養(圖4)，菌落周圍的透明圈的大小表明基因突變導致木聚糖酶活性發生很 大的變化。
實施例2:海棲熱袍菌纖維素酶基因突變文庫的構建和篩選
試劑盒由8種試劑組成熱穩定性連接酶、2種線性載體片段、表達載體
pHsh、 Tag DNA聚合酶、10 mM MnCl2、 10 mM NAD+、 10xPCR buffer (含 MgCl2和dNTP)。
使用上述試劑盒構建海棲熱袍菌纖維素酶CdB基因突變文庫的方法如下 (1)根據海棲熱袍菌纖維素酶CelB的基因序列(GenBank Accession No.NC—000853)設計引物(5'-GGGCT CGAGT TATTT TACAA CTTCG ACAG -3' 禾口 5，- CTAGC GTTGG TGCAACGGAC -3，)，以海棲熱袍菌基因組DNA為模板， 擴增出除信號肽以外的全部編碼基因，按照標準的分子克隆方法將基因插入帶有 卡那霉素抗性基因表達載體pHsh-kan，構建成重組表達質粒pHsh-ce/S。
(2)以pHsh-cdS為模板、帶有氨芐青霉素抗性基因的線性質粒片段為引物，
建立以下PCR反應體系
線性載體片段 1 nl
熱穩定性DNA連接酶 1 ^
質粒模板(pHsh-x;%4) 1 pl (30 ng/^il)
10mMMnCl2 0.4^1
10xPCR buffer 2 |ul
10 mM NAD+ (sigma公司) 1
ddH20 13.2 (il
T叫DNA聚合酶(TaKaRa) 0.4 pi ( 0.5 U )
(3) PCR擴增程序為95°C， 5min; (94°C， lmin,72。C， 1.5min和60。C， 2min) X20循環;60。C延伸10min。
(4) PCR產物轉化￡.co// JM109感受態細胞，涂布在含有氨節青霉素和2.5% 羧甲基纖維素的LB平板上，置于4(TC溫箱中培養。生長的菌落釋放纖維素酶， 對培養基中羧甲基纖維素進行降解；酶活性的強弱體現于菌落周圍凹陷圈的大小
(圖5)。
(5) 以pHsh-Ce/S轉化子作對照，從凹陷圈明顯增大的菌落挑取細胞接種， 提取質粒進行分析和驗證。確認正突變后命名為pHsh-ce/S-ml。
實施例3:海棲熱袍菌纖維素酶基因"仿的2級隨機突變和篩選 以實施例2中得到的含1級正突變基因的質粒pHsh-"W-ml為模板，重復實施 例2中的步驟(2)至(5)，所不同的是步驟(2)中換以帶有卡那霉素抗性基因 的線性質粒片段為引物；步驟(4)中的培養基平板換為含有卡那霉素而不是氨 芐青霉素LB平板。正突變得到確認后命名為pHsh-ceW-m2。
權利要求
1. 一種原位構建基因突變文庫的方法，(1)將需要突變的目標基因克隆到表達載體的多克隆位點中構建成重組質粒，并將重組質粒導入大腸桿菌，確認目標基因在大腸桿菌中得到表達；(2)以重組質粒為模板，用選擇標記不同于重組質粒的載體片斷作引物，加入極耐熱性DNA連接酶、Taq DNA聚合酶和PCR緩沖液；(3)在全自動PCR儀中進行易錯PCR和連接反應；(4)用PCR產物轉化大腸桿菌感受態細胞，并在與引物所帶的選擇標記相應的抗性平板上，選擇性地培養含突變基因的轉化子，獲取含正突變基因的重組質粒。
2. 根據權利要求1所說的原位構建基因突變文庫的方法，其特征在于，步 驟(1)中所說的表達載體是從pUC18/19改建產生的載體。
3. 根據權利要求2所說的原位構建基因突變文庫的方法，其特征在于，所 說的表達載體是從pUC18/19改建產生的載體，是pHsh系列載體。
4. 根據權利要求1或3所說的原位構建基因突變文庫的方法，其特征在于， 步驟(1)中所說的極耐熱性DNA連接酶是海棲熱袍菌熱穩定性DNA連接酶。
5. —種應用權利要求1的方法構建基因突變文庫的試劑盒，其特征在于， 該試劑盒含有(1) 一種帶有抗性基因的表達載體；(2) 極耐熱性DNA連接酶；(3) 與表達載體相應的帶有不同抗性基因的線性載體片段。
6. 根據權利要求5所說的原位構建基因突變文庫的方法，其特征在于，(1) 中所說的表達載體是從pUC18/19改建產生的載體。
7. 根據權利要求6所說的原位構建基因突變文庫的方法，其特征在于，所 說的表達載體是從pUC18/19改建產生的載體，是pHsh系列載體。
全文摘要
本發明為基因定向進化提供一種快速、通用的原位構建基因突變文庫的新方法，以及應用該方法構建基因突變文庫的試劑盒。該方法具有以下特點(1)極耐熱性DNA連接酶在PCR過程中介導環狀質粒的擴增；(2)在小型表達載體中對目標基因或部分目標基因進行原位易錯PCR；(3)以不同的篩選標記將隨機突變基因與原始模板分離；(4)一套試劑適用于各種目標基因，并且便于對篩選到的正突變基因再次構建突變文庫，通過篩選獲得多級累加的正突變。試劑盒EvoGen Kit為用該方法構建基因突變文庫提供了所需要的各種試劑。
文檔編號C40B50/06GK101532181SQ20091002592
公開日2009年9月16日 申請日期2009年3月13日 優先權日2009年3月13日
發明者樂易林, 裴建軍, 邵蔚藍 申請人:南京師范大學