熒光探針雜交法檢測人egfr基因突變試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物技術和醫學領域，具體涉及一種使用雜交探針檢測EGFR基因突變位點的試劑盒。本發明創造性的使用taqman探針、PNA探針與一種多重PCR方法結合來檢測EGFR突變，所有的操作在一管內完成，操作簡單，不需要開蓋操作，避免了污染的發生。使用TM值來判斷是否發生突變。并且提供了特殊的固體形式儲存方式，大大方便了運輸和儲存。此試劑盒主要用于診斷非小細胞肺癌患者是否適宜用易瑞沙/特羅凱等分子靶向藥物。
【專利說明】熒光探針雜交法檢測人EGFR基因突變試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和醫學領域，具體涉及一種使用雜交探針檢測EGFR基因突 變位點的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 非小細胞肺癌（NSCLC)在世界范圍內相當普遍，是造成男女個體因癌癥死亡的最 重要的原因，化學療法對于治療NSCLC顯得無能為力，大約有85%的病人療效不顯著，在此 情況下，分子靶向藥物作為新的療法受到關注。表皮生長因子受體（EGFR)是一種酪氨酸蛋 白激酶，在許多腫瘤中過表達和（或）發生突變，通過信號轉導控制腫瘤生長，并與新生血 管生成、腫瘤的侵襲和轉移等有密切的關系。在非小細胞肺癌中，EGFR往往過量表達，然而， EGFR的表達多少并不能成為預測藥物反應的一個有效指標，研究證實EGFR的突變對于藥 物反應十分重要，不同外顯子的突變將導致構象變化，改變和增強蛋白的活性，同樣增強對 TKI的敏感性，易瑞沙和特羅凱作為分子靶向治療藥物被美國FDA批準使用，對109T15%的 病人有顯著療效。KI通過與ATP競爭結合EGFR胞內酪氨酸激酶區，阻止酪氨酸殘基磷酸 化，從而阻止EGFR信號通路的傳導，最終達到抑制腫瘤增殖、轉移、血管生成等一系列腫瘤 細胞生物活動。通過檢測肺腺癌患者EGFR的突變情況，以及與臨床特征之間的關系，可以 篩選最合適的病人進行有針對性的靶向治療提供依據，以避免不合理用藥。
[0003]目前普遍應用的EGFR基因突變檢測方法為限制小片段長度多態性分析法（RFLP 法）和DNA直接測序，Taqman水解探針檢測等。RFLP法是將PCR與限制性酶切相結合的 方法。但是該方法存在以下缺點：RFLP實驗操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，存在第一輪 酶切不完全導致的假陽性，非閉管操作，易于污染，難以滿足臨床檢測要求。DNA直接測序 的原理是：該方法存在以下缺點檢測周期較長，花費昂貴，非閉管操作，難以避免交叉污染， 通量不高。DNA直接測序的靈敏度較低，雜合突變、GC富集區的存在等問題使得很難通過 一次測序獲得精確的數據，需要多次重復測序才可能避免假陽性等，因此直接測序方法難 適用于臨床檢測。
[0004]Taqman水解探針法使用擴增阻滯突變系統（amplificationrefractory mutationsystem,ARMS)與突光探針結合來檢測突變，理論上根據PCR擴增時使用的Taq DNA不能修正引物3'端堿基錯配，只要引物3'端與模板1個堿基不配對，便無法擴增出特 異性產物。針對這種特性設計引物，使得突變型得到擴增，野生型無法擴增，從而放大了突 變型信號，便于檢測。利用ARMS引物對突變靶序列進行PCR擴增，Taqman探針對擴增產 物進行特異性位點檢測，在Real-timePCR基礎上鑒定特定突變。該方法存在缺陷：ARMS 技術引物最后一個堿基不匹配并不能完全阻滯野生型DNA的擴增，所以這種方法存在假陽 性的風險，而且taqman結合arms檢測EGFR需要分管操作，這樣待測dna需要達到一定的 量，而且操作麻煩。
[0005] Taqman探針一般作為水解探針使用，這樣在單個突變位點檢測中使用較為廣發， 但是涉及到多重突變檢測，則檢測位點個數受到通道限制。Taqmen探針作為雜交探針鮮見 有人提起，一般認為Taqman探針在自由狀態及結合到模板時不發光，僅在核酸酶水解探針 時才發光。而經過我們研究證實，taqman探針在自由狀態熒光值很低，而在結合到模板時， 由于雙鏈的螺旋結構而處于直線狀態，這樣激發基團和淬滅基團由于相距一定的距離，而 使激發基團發出的光不被完全淬滅，而這種特性使taqman探針可以作為雜交探針使用。
[0006] 多重不對稱PCR(multiplex asymmetric per, MAP)對多個祀點進行不對稱擴增， 擴增產物可以直接用于雜交而不需要經過單鏈分離過程，MAP包括特殊的引物設計方法，這 種引物設計使不同的引物具有較寬泛的退火溫度，這樣是多引物擴增時退火溫度歸一化， 極大的增加了多位點同時擴增的成功率。目前多重不對稱PCR用于熒光平臺未見專利報 道。
[0007] 肽核酸（P印tideNucleicAcid，PNA)是近十幾年發展起來的以中性酰胺鍵為骨 架的脫氧核糖核酸（^DeoxyribonucleicAcid，DNA)類似物，其結構介于多肽和DNA之間。 PNA可以特異性地與DNA或RNA雜交，形成穩定的復合體。PNA由于其自身的特點可以對 DNA復制、基因轉錄、翻譯等進行有針對的調控，同時作為雜交探針大大提高了遺傳學檢測 和醫療診斷的效率和靈敏度。由于PNA能夠與DNA和RNA特異性地結合，可以制備PNA探 針.與DNA探針相比，其雜交的穩定性和特異性大大增加。
【發明內容】
[0008] 本發明創造性的使用taqman探針、PNA探針與一種多重PCR方法結合來檢測EGFR 突變，所有的檢測過程不需要開蓋操作，避免了污染的發生。使用TM值來判斷突變，而且所 有的檢測在一管內完成，操作簡單。提供了特殊的固體形式儲存方式，大大方便了運輸和儲 存。
[0009]具體為： 1.優化了多重不對稱PCR(MAP)在熒光平臺的使用策略，MAP參見我們的申請專利 (201110448444. 8)，針對熒光平臺，我們對整個體系以下優化。增加了鎂離子濃度到6mM， 增加了焦磷酸酶來抑制PCR過程中產生的焦磷酸，增加了擴增策略來增強整個體系的擴增 能力。
[0010] 2.針對18號和21號外顯子突變序列設計Taqman探針，針對保守序列設計特殊 的MAP引物。對于18號外顯子，本試劑盒可以檢測G719S/A/C突變，所用通道設定為FAM 通道。對于21號外顯子，本試劑盒可以檢測L858R和L861Q的突變，所用通道為RED610通 道。對于這些點突變我們設定了Tm值的參考范圍。
[0011] 3.針對19號外顯子突變熱點多而且集中的特點，我們設計了特殊的PNA探針來 作為阻滯探針使用，在上游保守區域設計正向引物，在下游保守區域設計taqman探針和負 向引物，當模板為野生型時，其堿基完全匹配PNA探針，由于PNA不會被核酸外切酶水解， PNA探針阻滯PCR反應的進行，此時將不會有擴增產物，檢測不到信號；而發生突變時，探針 Tm值大大降低，PNA探針從模板鏈上解離，per反應正常進行，這樣，擴增出來的單鏈可以 使用Taqman雜交探針進行檢測，所用通道為FAM通道。本試劑盒可以檢測19號外顯子上 E746-I751上的任何缺失突變，根據有無溶解曲線來判斷是否發生了突變，但是不能區分具 體突變。
[0012] 4.針對20號外顯子，我們設計了保守的引物對和兩個探針來檢測突變位點，可以 檢測S768I和I790M突變，以及20號外顯子的插入突變，所用檢測通道為JOE波長通道。對 于上述突變類型我們設定了Tm值的參考范圍。
[0013] 5.所述試劑盒由PCR反應液和引物探針及質控品構成。PCR反應液包括Kcl、 tris-cl、dNTPs、焦磷酸酶、熱啟動聚合酶、MgC12、海藻糖構成。引物探針包括：Map引物對、Taqman探針、PNA探針等。質控品包括陰性質控品以及陽性質控品構成。各組分反應時終 濃度為： Kcl：40"60mM； Tris-cl: 500"700nM； dNTPs: 200"600mM； MAP引物對終濃度為每種150?350nM; 模板DNA0? 01 ?10ng/iiL; TaqDNA聚合酶 0? 01 ?1. 0U/iiL; MgC12終濃度為1. 5?6.OmM; Taqman探針每種終濃度為50?200nM; PNA探針濃度為l(T50nM; 海藻糖終濃度為l(T60mM; 6.此試劑盒提供了可供選擇的特殊的固體包裝形式，其內容包括： UNG酶、熱啟動聚合酶、焦磷酸酶、Tris-Hcl、KCl、dUTPs(AGCU)、MgC12、甘油、DMS0、海 藻糖、MAP引物、Taqman探針、Pna探針和粘合劑。
[0014] 為了達到上訴目的，其具體試劑盒方法為： 1、引物設計：引物設計使用發表在NCBI上EGFR核酸序列的保守區域設計P3段引物， 然后設計P2段和P1段引物，其中用字母n代替hypoxanthine堿基，hypoxanthine堿基可 以和四種堿基完美配對。EGFR引物表如下：
【權利要求】
1. 一種人類EGFR基因突變的檢測方法和試劑盒，其特征在于多重不對稱PCR擴增， PNA/LNA探針作為阻滯探針，熒光雜交探針溶解曲線判斷結果、以及包括固體形式存在的 lxPCR反應物（由引物混合物、tris-cl、Kcl、MgCl2、熱啟動聚合酶、UNG酶和凍干保護劑組 成)、其特殊之處在于： a :特殊的三段式引物，其三段式引物設計及后繼的擴增為獨創的MAP(多重單鏈PCR擴 增）技術，其序列為 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8 ; b :特殊的探針，所選取的4個探針具有良好的特異性和保守性，可以根據Tm值的變化 來判斷突變，分別為 SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20 ; c :特殊的存儲條件：本試劑盒為PCR反應物提供了固體形式的存儲方式； d:反應條件通過優化，大致分為兩個階段，其中第一階段為富集階段，本階段使用濃度 極低的3個引物和一個過量的正向引物，反應溫度一般為50°C左右，擴增階段低濃度引物 將被消耗完，隨后第二階段僅有負向引物工作，隨著擴增的進行，將產生大量的單鏈目的核 苷酸序列； e :特殊的阻滯探針，本試劑盒使用了特殊的PNA阻滯探針來屏蔽19號外顯子野生型基 因的表達，大大提商了診斷的準確性。
2. 權利要求1所述試劑盒，引物擴增策略為二輪擴增，分為雙鏈對稱擴增階段和單鏈 不對稱擴增階段。
3. 權利要求1中的試劑盒，其凍干保護劑成分由海藻糖，甘油和粘合劑組成。
4. 權利要求1中的試劑盒，其PCR產物的檢測方法為熒光探針雜交、斑點雜交，反向斑 點雜交、液相雜交平臺。
5. 權利1中所述的試劑盒，其用途用于檢測人類EGFR基因的突變。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328164SQ201310031100
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年7月22日 優先權日:2013年7月22日
【發明者】劉濤, 吳大治, 夏懿 申請人:上海星耀醫學科技發展有限公司, 上海復星醫藥（集團）股份有限公司