一種組織勻漿法分離活細胞構建細胞庫的方法
【專利摘要】本發明公開了一種組織勻漿法分離胎兒附屬物組織細胞構建細胞庫的方法，目的在于構建細胞庫時步驟簡單、省時、易于質控和規范化。本發明由下述步驟組成：(1)胎兒附屬物組織的清洗；(2)組織的勻漿前處理；(3)組織勻漿處理分離細胞(團)；(4)勻漿后組織的過濾處理和細胞(團)的收集；(5)細胞(團)檢測；(6)凍存分離的細胞(團)，構建細胞庫。與現有方法相比，本發明方法具有操作簡單、用時短、不引入外源試劑、易于標準化和質量控制以及細胞獲得量大等優點，為提高胎兒附屬物細胞庫的構建效率，獲得高質量用于治療的干細胞具有重要的意義。
【專利說明】一種組織勻漿法分離活細胞構建細胞庫的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及胎兒附屬物組織細胞庫的構建方法，更具體地說是一種從胎兒附屬物組織分離細胞構建細胞(團)庫的物理方法。
【背景技術】
[0002]胎兒附屬物組織主要由胎盤小葉、胎盤底座、基蛻膜、羊膜和臍帶組織構成。起源于胚胎發育期胚外中胚層的胎盤是由間質、血管及滋養細胞組成，是胎兒最早期的造血器官，含有大量的間質成分。最新的研究表明胎盤中含有間充質干細胞、胎盤亞全能干細胞和豐富的造血干細胞，從胎盤中分離培養出這些多能干細胞將為實驗研究和臨床應用開辟一個嶄新而豐富的來源。
[0003]胎盤亞全能干細胞來源于胎盤組織，自胚胎形成的第5到7天開始出現，能分化形成200多種人體組織器官細胞，但不能形成一個完整的人體。具備多能干細胞的許多生物學特征，該細胞體外可向脂肪細胞、成骨細胞、神經細胞、肝上皮樣細胞等定向分化。
[0004]胎盤造血干細胞是存在于胎盤組織中的一群原始造血細胞，是血細胞(紅細胞、白細胞、血小板等)的始祖，是高度未分化細胞，也可以說它是一切血細胞(其中大多數是免疫細胞)的原始細胞。胎盤組織中造血干細胞的含量是臍帶血中造血干細胞含量的5-10倍，足可供小孩自用幾次，或提供給1-2個成人患者的治療。同時有效解決了移植時骨髓或動員后外周血來源不足，臍帶血數量不夠等技術難題，將有望取代骨髓、動員后外周血和臍帶血用于造血干細胞移植。
[0005]基蛻膜是母親妊娠時胚泡的滋養層細胞一經與子宮內膜接觸，引起其附近的內膜間質細胞肥大增殖形成的組織。基蛻膜形成胎盤隔將叢密絨毛膜分隔成若干個絨毛小葉，其中含有母親源的基蛻膜干細胞。
[0006]羊膜(amnion)是覆蓋在羊膜腔內表面的一層薄膜，從細胞滋養層演化而來，是人類兩層胎膜的內層，其厚度為0.02~0.05mm，是人體中最厚的基底膜，由羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cell, HAEC)、基底膜、實質層、纖維母細胞層、海綿層5層結構組成。人羊膜上皮細胞位于羊膜的最內層，羊膜上皮細胞在受精后第8天從外胚葉發育而來，使其可能維持原腸胚形成前期胚胎干細胞的可塑性，在治療中樞神經障礙方面具有獨特的應用價值:1996年，Sakuragawa等最先發現培養的人羊膜上皮細胞表達神經元和神經膠質細胞的標志。隨后的研究表明，培養的人羊膜上皮細胞能合成和釋放神經遞質如乙酰膽堿，兒茶酚胺和多巴胺。人羊膜上皮細胞移植治療大鼠帕金森病(PD)的實驗表明其在體內不僅能存活并表達絡氨酸羥化酶(TH)活性，而且可以逆轉病情和防止神經元死亡。人羊膜上皮細胞對于靈長類的脊髓損傷同樣具有良好的治療效果。
[0007]臍帶是胎兒和母體連接的紐帶。臍帶內有三根血管通過，一根靜脈和二根動脈，起著溝通母子間血液循環的作用。足月胎兒的臍帶長約30~70厘米。臍帶華通氏膠(Wharton’ s Jelly)中的干細胞主要是臍帶間充質干細胞。
[0008]間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一種多能干細胞,在胚胎發育中來源于中胚層。在機體正常的組織損傷修復過程中，MSC是一種重要的參與組織再生的細胞。在組織損傷引起的特殊信號作用下，MSC遷移到受損部位，在局部聚集增殖，依據不同的損傷信號沿著不同途徑分化。MSC易于分離擴增，體外倍增能力旺盛，即使擴增I億倍仍能保持其多向分化能力。因此，MSC是一種實用的組織修復種子細胞。
[0009]MSC具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內或體外環境下具有分化為:上皮干細胞、神經干細胞、肝干細胞，肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、基質細胞等多種細胞的能力。可以用來修復受損或病變的組織器官，治療心、腦血管疾病、神經系統疾病、肝臟疾病、骨組織病、角膜損傷、燒傷燙傷、肌病等多種疾病；并且，MSC具有免疫調節作用，通過負性免疫調節功能，抑制機體亢進的免疫反應，使機體免疫功能恢復平衡，從而可以用來治療造血干細胞移植之后的免疫排斥反應以及克隆氏病、紅斑狼瘡，硬皮病等自身免疫系統疾病；MSC還是人體微環境的重要組成部分，移植間充質干細胞可以改變造血微環境，重建免疫系統，促進造血功能恢復，與造血干細胞共移植能顯著提高白血病和難治性貧血等的治療效果。
[0010]胎兒附屬物細胞庫的構建，將原來作為醫療廢棄物直接處理掉的新生兒的臍帶和胎盤組織通過處理，提取其中豐富的干細胞資源，并通過成熟的深低溫冷凍技術使之在休眠狀態下長時間儲存，作為一種寶貴的生物資源儲備，將來，可以應用于許多自體重大疾病的治療；同時，也可以用于異體的移植與治療；還可以通過再研發和處理，開發成干細胞藥物，造福全社會。
[0011]胎兒附屬物細胞庫構建包括細胞的組織分離，純化，冷凍保存，病原微生物的檢測以及質量控制等方面。本專利所涉及的胎兒附屬物細胞庫構建方法是其中組織中細胞分離的方法，尤其是細胞從實體組織中分離的技術。從組織中分離細胞構建細胞庫的方法目前有化學酶解法和細胞團培養法。其中化學酶解法是廣為采用的主要方法。
[0012]化學酶解法是利用消化酶將活體細胞從組織中分離的方法。具體分離過程先將組織剪切成約1-1.5mm3的小塊，再采用膠原酶或膠原酶和胰酶組合使用進行細胞團消化，并利用血清等酶消化終止液終止消化，最后過濾清洗獲取細胞。例如授權號CN101608174B《一種人臍帶間充質干細胞庫的構建方法》的專利，間充質干細胞的分離就是采用膠原酶消化的方法。授權號CN100344757C《人胎盤、臍帶間充質干細胞庫及其構建方法》的專利，建庫的間充質干細胞采用的方法為膠原酶和胰酶依次消化法。化學酶解法具有以下特點:1)由于需要使用大量的化學酶和消化終止液，實驗成本較高；2)由于不同的操作方法和人員情況，每次獲得的細胞產量差異較大。3)由于采用的消化方法不同，整個消化酶解的時間長短不一，從30分鐘到幾小時都有。
[0013]細胞團培養法是一種物理和培養相結合將細胞從組織中分離的方法，也是構建細胞庫可選用的一種方法。具體分離過程先將組織剪切成約1-1.5mm3的小塊，接種到培養皿中培養分離細胞。例如授權號CN102010850B《一種臍帶組織間充質干細胞爬片分離的方法》的專利，臍帶組織間充質干細胞的分離就是采用的細胞團培養法。該方法具有以下特點:1)僅需要將組織剪切成1-1.5mm3的細胞團和簡單的培養，操作比較簡單；2)細胞團的培養需要幾天的時間才能實現細胞的分離，耗時較長；3)細胞的長期培養，污染的可能性比較大。
[0014]由此可見，目前構建細胞庫的實體組織細胞分離方法操作流程比較繁瑣，耗時長，完全依賴于人工操作，對技術員的操作技能要求高。另外，化學酶解法又引入了動物來源的外源性試劑，會加大公共細胞庫的干細胞藥物治療的風險性。
[0015]在本發明基于細胞庫構建中保證細胞分離方法簡單、省時、易于質控和規范化的原則，采用組織勻漿方法分離胎兒附屬物組織，獲得大量用于建庫的細胞，以滿足科研、醫藥和臨床等領域對細胞庫資源的需求。
【發明內容】
[0016]本發明的目的是提供一種組織勻漿分離胎兒附屬物細胞(團)建立細胞庫的方法。
[0017]本發明優選使用的組織細胞處理器PlacentaPiX)是發明人為本發明設計的一種儀器，該儀器包含控制裝置和勻漿容器兩部分，如圖1所示，控制裝置包括機身(1)，勻漿容器放置孔(2)，旋轉頭(3)，卡槽(4)，散熱孔(5);勻漿容器包括杯體(6)，杯蓋(7)，密封圈
(8)，旋轉頭連接器(9)，固定軸(10)，刀頭(11)，卡頭(12)。
[0018]機身(I)側面設置有散熱孔(5)，機身(I)頂部為勻漿容器放置孔(2)，勻漿容器放置孔(2)內壁設有卡槽(4)，勻漿容器放置孔(2)底部為旋轉頭(3)，處理組織時，勻漿容器放置入勻漿容器放置孔(2)中，杯蓋(7)底部的旋轉頭連接器(9)下端與旋轉頭(3)接合，上端通過固定軸(10)與刀頭(11)連接，杯蓋(7)通過密封圈(8)與杯身(6)緊密接合，杯身(6)外側壁的卡頭(12)與卡槽⑷接合。
[0019]其中關鍵部件為特殊設計的刀頭(11)。刀頭(11)呈四葉刀刃，由上下層疊放置且互相垂直的刀片(13)和刀片(14)組成。刀片(13)分5段，包含4個彎折，兩端兩個彎折呈130-150度(優選138度)，中間兩個彎折呈140-160度(優選148度)；刀片(14)分3段，包含2個彎折，兩個彎 折呈110-130度(優選123度)；
[0020]工作時，將組織塊裝入杯身(6)，蓋上杯蓋(7)后，將勻漿容器放入勻漿容器放置孔(2)內，通過控制器-旋轉頭(3)-旋轉頭連接器(9)-固定軸(10)-刀頭(11)的一些列傳動。帶動刀頭(11)轉動，從而起到勻衆作用。
[0021 ] 雖然目前市場上已經有少量與本發明所用的組織細胞處理器PI acentaPro作用相似的儀器，如德國美天旎公司的gentleMACS標本處理器也能分離組織得到細胞懸液。但是第一，市面上已有的儀器的處理量都相對較小，一般只能處理5克以下的樣本，而PlacentaPro最多能處理400克的樣本，為建立細胞庫和大規模細胞培養奠定了很好的基礎；第二，市面上已有的儀器由于結構限制，只能處理易破碎的組織，如脾臟、肝臟、肺等，對于具有很強韌性的胎兒附屬物組織，如含有大量華通氏膠的臍帶也無能為力，而PlacentaPro由于結構的特殊性，能夠在不破壞細胞活性的情況下，將韌性大的組織，如胎兒附屬物組織進行勻漿，直接分離得到細胞/細胞團。
[0022]本發明的技術方案包括組織的清洗、勻漿前處理、組織勻漿處理、過濾回收及細胞庫構建的過程，具體步驟如下:
[0023](I)組織清洗:通過適量清洗液(例如含雙抗的PBS緩沖液)對獲得的胎兒附屬物組織進行沖洗，直到組織表面的殘留血液被沖洗干凈。
[0024](2)組織勻漿前處理:根據組織細胞處理器PlacentaPiO的勻漿容器的大小，將得到的組織剪成小塊，放入組織細胞處理器中，加入0.5-2倍質量的緩沖液(例如PBS緩沖液)并密封組織細胞處理器；[0025](3)組織勻漿處理:組織細胞處理器PlacentaPiO通過轉子帶動特殊刀頭的旋轉將組織切碎和勻漿，對組織進行細胞分離和提取；
[0026](4)組織過濾處理，細胞收集:將步驟(3)得到的組織碎片轉移至過濾裝置，對胎盤組織進行研磨，收集濾液，對濾液進行細胞清洗，離心收集細胞；對臍帶組織收集過濾器上的細胞團，清洗細胞團并收集。
[0027](5)分離的細胞(團)構建細胞庫:將步驟⑷分離的細胞(團)置液氮保存，按其ABO / Rh血型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構建出細胞庫。
[0028]根據本發明步驟⑴所述需要處理的樣品是胎兒附屬物組織，包括胎盤小葉和基蛻膜組織、胎盤底座組織、胎盤羊膜組織和臍帶組織。
[0029]根據本發明步驟(2)所述處理的組織樣品大小為:
[0030]胎盤小葉和基蛻膜30_120g，優選60_90g，加入的緩沖液或培養基的體積為20-110ml，優選 50-80ml ；
[0031 ] 臍帶5_30g，優選10_20g，加入的緩沖液或培養基的體積為10_45ml，優選15-30ml ；
[0032]胎盤底座100_300g，優選150_200g，加入的緩沖液或培養基的體積為100_300ml，優選 150-200ml;
[0033]胎盤羊膜5_25g，優選10_20g，加入的緩沖液或培養基的體積為10_40ml，優選15-25ml ；
[0034]根據本發明步驟(2)所述組織細胞處理器PlacentaPiO處理:
[0035]胎盤小葉和基蛻膜組織處理轉速為1000-2400rpm，優選地，1400-1800rpm ；
[0036]臍帶組織處理轉速為1500-3500rpm，優選地，2500_2800rpm ；
[0037]胎盤底座組織處理轉速為1500-2500rpm，優選地，2000rpm ；
[0038]胎盤羊膜組織處理轉速為2000-3000rpm，優選地，2300_2500rpm ；
[0039]根據本發明步驟(4)所述組織碎片過濾裝置為100-400目金屬過濾器，胎盤小葉和基蛻膜組織、胎盤底座組織過濾時優選200目的過濾器，臍帶組織、胎盤羊膜組織過濾時優選400目的過濾器。
[0040]本發明的有益效果為:本發明采用自主研制的組織細胞處理器PlacentaPiO對胎兒附屬物組織細胞進行分離的方法，具有操作簡單、用時短、無外源試劑加入、易于標準化和質量控制以及細胞獲得量大等優點，為提高細胞庫的構建效率，保障細胞庫優質的質量具有重要的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041]圖1組織細胞處理器PlacentaPro結構示意圖
[0042]圖2原代細胞培養形態
[0043]圖3臍帶組織處理得到的細胞團培養并傳至P3代的細胞培養形態圖
[0044]圖4臍帶組織處理得到的細胞團培養并傳至P3代的細胞流式圖
[0045]圖5胎盤羊膜組織處理后得到的細胞團的原代培養形態圖
【具體實施方式】[0046]實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0047]實施例1:采用組織勻漿法分離胎盤小葉細胞構建細胞庫
[0048]胎盤小葉組織勻漿的方法包括以下步驟:
[0049](I)胎盤組織清洗:胎盤組織是在生物安全柜內進行處理，根據胎盤大小使用適量含1%雙抗的PBS緩沖液對胎盤組織進行沖洗，至胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無血液凝塊；
[0050](2)胎盤小葉組織前期處理:使用手術剪從步驟(I)得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，把胎盤小葉轉移到培養皿上并剪成小塊，把60-90克的胎盤小葉組織塊放入組織細胞處理器PlacentaPro的勻漿容器中，加入50-80毫升的PBS并密封處理杯；
[0051](3)胎盤小葉組織勻漿處理:利用組織細胞處理器PlacentaPiO將步驟(2)得到的胎盤小葉組織塊通過組織切碎和勻漿的物理處理進行細胞分離和提取，攪拌速度為1400rpm-1800rpm之間，處理時間為5分鐘；
[0052](4)胎盤小葉組織過濾處理:將步驟(3)處理完畢后的胎盤小葉組織轉移到200目金屬過濾器上,對組織碎片進行研磨并利用另一個培養皿收集過濾完的液體,分成2次往金屬過濾器加入10-15ml的PBS清洗組織并繼續研磨。
[0053](5)細胞計數:用50ml離心管收集步驟(4)獲得的細胞懸液，以1400rpm /分鐘的速度離心10分鐘,去上清并加入PBS重懸細胞，抽取小量樣本進行細胞計數。
[0054]胎盤小葉組織細胞分離處理測試共分8組分別進行，每一組進行了兩個不同的測試設定，分別為(a) 1400rpm, 5分鐘和(b) 1800rpm, 5分鐘。胎盤組織來源于8個不同的供者，處理量在60克左右之間。實驗結果如表1所示。
[0055]
[0056]表1 (a)胎盤小葉組織勻漿處理細胞提取數據
【權利要求】
1.一種組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構建細胞(團)庫的方法，其特征是由下述步驟組成: (1)對胎兒附屬物組織提供者進行ABO/ Rh血型檢測、HLA分型檢測、微生物免疫檢測、用含雙抗的緩沖液去除殘留血液； (2)組織勻漿前處理:將清洗后的組織剪成小塊，放入組織細胞處理裝置樣品室中，加入0.5-2倍質量的緩沖液或培養基，密封組織細胞處理裝置； (3)組織勻漿處理:運轉組織細胞處理裝置，在轉速為1000-3500rpm，處理時間為1_15分鐘的條件下，將組織切碎和勻漿，對組織進行細胞(團)的分離處理； (4)組織過濾處理:將步驟(3)得到的勻漿液通過100-400目的濾網過濾:對于胎盤小葉和基蛻膜組織、胎盤底座組織，對濾網上殘留的少許胎盤組織塊進行研磨，收集濾液；對于臍帶組織、胎盤羊膜組織，收集濾網上的細胞團。 (5)細胞(團)收集與清洗:對于細胞，用離心管收集步驟(4)得到的細胞懸液，以1400-1800rpm /分鐘的速度離心5_15分鐘，去上清并加入緩沖液重懸細胞；對于細胞團，用緩沖液清洗后直接收集細胞團。 (6)將步驟(5)分離的細胞(團)置液氮保存，按其ABO/ Rh分型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構建出細胞庫。
2.如權利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構建細胞(團)庫的方法，其特征在于，所述的步驟(I)中，胎兒附屬物組織包括胎盤小葉和基蛻膜、胎盤底座、胎盤羊膜和臍帶。
3.如權利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構建細胞(團)庫的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中.，所使用的組織細胞處理裝置為組織勻漿處理器，優選發明人研制的組織細胞處理器PlacentaPro。
4.如權利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構建細胞(團)庫的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，組織細胞處理裝置所處理的胎兒附屬物組織樣品的大小為5-300g，其中臍帶組織為5-30g，胎盤小葉和基蛻膜組織為30-120g，胎盤底座組織為100-300g，胎盤羊膜組織為5-25g。
5.如權利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構建細胞(團)庫的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中，胎盤小葉和基脫膜組織處理轉速優選1000-2400rpm ;臍帶組織處理轉速優選1500-3500rpm ;胎盤底座組織處理轉速優選1500_2500rpm ;胎盤羊膜組織處理轉速優選2000-3000rpm。
6.如權利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構建細胞(團)庫的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中，過濾胎盤小葉和基蛻膜組織、胎盤底座組織時，優選200目的金屬濾網；過濾臍帶組織、胎盤羊膜組織時，優選400目的金屬濾網。
7.如權利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構建細胞(團)庫的方法，其特征在于，所述的步驟(6)中，細胞庫可以是臍帶間充質干細胞庫、胎盤造血干細胞庫、胎盤亞全能細胞庫、基蛻膜干細胞庫和羊膜上皮細胞庫。
8.如權利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構建細胞(團)庫的方法，其特征在于，所述的步驟(6)中，質量控制包括了細胞來源的調查；細胞污染的檢測，如乙肝兩對半、丙肝、艾滋、巨細胞病毒、EB病毒和梅毒；遺傳病檢測；HLA-ABC / DR配型檢測；細胞活性的檢測。
【文檔編號】C40B50/06GK103469309SQ201310413590
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】許曉椿, 肖海蓉 申請人:博雅干細胞科技有限公司