毛發生長補劑的制作方法

專利名稱：毛發生長補劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種真皮乳頭細胞生長促進劑、一種毛發生長刺激劑和一種毛發生長補劑。更具體而言，涉及含有WNT-5A功能抑制劑作為活性成分的一種真皮乳頭細胞生長促進劑、一種毛發生長刺激劑和一種毛發生長補劑。而且，本發明也涉及一種根據抑制WNT-5A功能的效果篩選真皮乳頭細胞生長促進劑的方法。
背景技術：
人的毛囊由上皮和間充質真皮細胞(如角質細胞、真皮乳頭細胞、成纖維細胞和皮脂細胞)組成，毛發生長周期(毛發周期)通過這些細胞之間的相互作用控制。毛囊角質細胞的增殖/分化(角質化)形成毛干。真皮乳頭調節這些毛囊角質細胞的增殖、分化和凋亡，在毛發周期的控制中起關鍵作用。因此在開發毛發生長刺激劑/毛發生長補劑的過程中，重要的是研究對真皮乳頭細胞的作用。然而，調節真皮乳頭細胞的增殖能力和毛發周期控制能力的分子機制迄今為止還幾乎沒有闡明。
WNT-5A是一種分泌型糖蛋白，屬于WNT家族。WNT家族包括約20種分子，從線蟲到哺乳動物它們都是保守的。眾所周知，這些WNT是重要的細胞間信號分子，它們調節胎兒期的體軸形成和器官形成(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，14，59-88(1998)；Genes & Dev.11，3286-3305(1997))。人類有10種WNT受體，它們是Frizzled七通道(seven-pass)跨膜受體(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，14，59-88(1998)，Genes & Dev.，11，3286-3305(1997))。根據WNT-Frizzled鍵的組合，存在3種信號傳導途徑(即WNT/β-連環蛋白途徑、PCP途徑和WNT/Ca2+途徑)(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，14，59-88(1998))。
近年來，已經闡明WNT/β-連環蛋白途徑是形成毛囊的基礎(Genes & Dev.，8，2691-2703(1994)；Cell，95，605-614(1998)；Dev.Biol.，207，133-149(1999)；Genes & Dev.，14，1181-1185(2000)；Cell，105，533-545(2001))。1988年，構建了一種在皮膚中具有穩定的β-連環蛋白轉基因小鼠。據報道，該小鼠顯示新生毛囊形態發生增強，并且導致多毛癥(Cell，95，605-614(1998))。2000年報道，WNT/β-連環蛋白信號在保持真皮乳頭的毛發誘導活性中起重要作用(Genes &Dev.，14，1181-1185(2000))。
然而，已經闡明，來自WNT-5A的信號傳導不是由WNT/β-連環蛋白途徑介導，而是由Ca2+途徑介導(Dev.Biol.，182，114-120(1997)；Curr.Biol.，9，695-698(1999))，迄今為止還沒有關于WNT-5A與毛囊形態發生之間的關系的報道。
另外也有報道，向早期非洲爪蟾(Xenopus laevis)胚胎內注射非洲爪蟾WNT-5A mRNA以及人Frizzled 5 mRNA可誘導胚軸的復制(Science，275，1652-1654(1997))，而注射WNT-1或WNT-8 mRNA誘導的軸復制被WNT-5A抑制(J.Cell Biol.，133，1123-1137(1996))，非洲爪蟾WNT-5A與大鼠Frizzled 2結合，并且通過Ca2+途徑激活CamK II(Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II)和PKC(蛋白激酶II)(Curr.Biol.，9，695-698(1999))。然而，它們的生理學意義還不清楚，迄今為止還沒有關于WNT-5A與毛發生長刺激/毛發生長促進之間的關系的報道。

發明內容
本發明目的在于提供一種使用調節真皮乳頭細胞增殖的分子的篩選方法，基于新功能的一種真皮乳頭細胞生長促進劑和一種毛發生長刺激劑和一種毛發生長補劑。
為了達到這些目的，本發明人進行了深入的研究。結果發現，WNT-5A在真皮乳頭細胞中高表達，并且WNT-5A與真皮乳頭細胞的增殖能力有關。基于這些發現的隨后研究進一步發現，抑制WNT-5A的功能能夠顯著促進真皮乳頭細胞的生長，并且能夠增大毛囊的毛球部分，從而完成本發明。
在一個實施方案中，本發明提供一種真皮乳頭細胞生長促進劑，其含有一種具有抑制WNT-5A功能之活性的化合物。
在另一個實施方案中，本發明提供一種真皮乳頭細胞生長促進劑，其含有一種具有抑制WNT-5A生成之活性的化合物。
在另一個實施方案中，本發明提供由下列通式(I)代表的化合物 其中R1和R2相同或不同，各自代表氫原子、C1-6烷基或C2-6烷酰基；X代表氫原子或鹵素原子；R3a和R3b相同或不同，各代表氫原子或羥基；和R4、R5、R6、R7、R8和R9相同或不同，各自代表氫原子、羥基、鹵素原子或C2-6烷酰氧基，或者其相鄰基團一起形成π鍵或醚鍵，或者R5和R8或R5和R9一起形成醚鍵。
在另一個實施方案中，本發明提供一種真皮乳頭細胞生長促進劑，其含有由下列通式(II)代表的化合物 其中R1和R2相同或不同，各自代表氫原子、C1-6烷基或C2-6烷酰基；
X代表氫原子或鹵素原子；R3c和R3d相同或不同，各自代表氫原子、羥基或C1-6烷氧基，或者R3c和R3d一起形成氧代基、肟基或C1-6烷氧基亞氨基；和R4、R5、R6、R7、R8和R9相同或不同，各自代表氫原子、羥基、鹵素原子或C2-6烷酰氧基，或者其相鄰基團一起形成π鍵或醚鍵，或者R5和R8或R5和R9一起形成醚鍵。
在另一個實施方案中，本發明提供一種真皮乳頭細胞生長促進劑，其含有由下列通式(IX)代表的化合物 其中R1a和R2a相同或不同，各自代表氫原子、C1-6烷基或C2-6烷酰基、(CH2)pCO-Y-R10代表的基團(其中Y代表氧原子或硫原子；R10代表氫原子、C1-6烷基或取代的或未取代的芳基；p＝0或1)，(CH2)qR11代表的基團(其中R11代表取代的或未取代的環烷基，或取代的或未取代的C2-10雜環；q＝0或1)，或COR12代表的基團(其中R12代表取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的C2-10雜環)；X代表氫原子或鹵素原子；R3e和R3f相同或不同，各自代表氫原子、羥基、C1-6烷氧基或C1-6烷酰氧基，或者R3e和R3f一起形成氧代基、肟基或C1-6烷氧基亞氨基；和R4a、R5a、R6a、R7a、R8a和R9a相同或不同，各自代表氫原子、羥基、鹵素原子或Z-R13代表的基團(其中Z代表氧原子或硫原子；R13代表C1-6烷基、C1-6烷酰基或取代的或未取代的芳基)，或其相鄰基團一起形成π鍵或醚鍵，或R5a和R8a或R5a和R9a一起形成醚鍵；和R6b代表氫原子，或者與R3e或R3f一起形成醚鍵。
在另一個實施方案中，本發明提供一種毛發生長刺激劑或毛發生長補劑，其含有上述真皮乳頭細胞生長促進劑作為活性成分。
在另一個實施方案中，本發明提供一種篩選真皮乳頭細胞生長促進劑的方法，包括選擇抑制WNT-5A功能的物質。
在另一個實施方案中，本發明提供一種選擇抑制WNT-5A功能的物質的方法，即篩選真皮乳頭細胞生長促進劑的方法，該方法包括下列步驟(a)-(c)(a)在已經添加待測化合物的培養基中培養表達人WNT-5A的細胞的步驟；(b)裂解步驟(a)中培養的表達人WNT-5A的細胞，提取RNA，并且測定WNT-5A mRNA含量的步驟；和(c)比較步驟(b)中測定的WNT-5A mRNA含量的步驟。
附圖簡述

圖1是顯示WNT-5A mRNA在真皮乳頭細胞中表達的電泳圖。
圖2是顯示待測化合物致使真皮乳頭細胞中WNT-5A mRNA含量減少的電泳圖。
圖3顯示待測化合物具有促進真皮乳頭細胞生長的活性。
圖4是顯示猴皮膚器官培養物中WNT-5A mRNA含量減少的電泳圖。
圖5顯示猴皮膚器官培養物中毛發生長終期和初期毛囊的PCNA染色結果。
圖6是顯示化合物7增大猴皮膚器官培養物中毛球直徑的直方圖。
圖7是顯示化合物3增大猴皮膚器官培養物中毛球直徑的直方圖。
圖8顯示在殘尾獼猴毛發生長試驗中施用待測化合物之前及6個月之后的皮膚照片。
本發明最佳實施方式以下更詳細地描述本發明。
<抑制WNT-5A功能的化合物>
本發明使用的術語“抑制WNT-5A功能的化合物”(下文有時稱為“WNT-5A功能抑制劑”)指抑制WNT-5A與WNT-5A受體結合的化合物，或抑制WNT-5A生成的化合物，優選抑制WNT-5A生成的化合物。
已經證實，WNT-5A是屬于WNT家族的一種分泌型糖蛋白，在人、小鼠、大鼠、非洲爪蟾等中表達。出于用作藥物的考慮，優選抑制人WNT-5A(SEQ ID NO1)功能的化合物。
抑制WNT-5A與WNT-5A受體結合的化合物指作用于WNT-5A或WNT-5A受體，抑制WNT-5A與WNT-5A受體的結合，從而調節WNT-5A的信號傳導，優選調節Ca2+途徑信號傳導的化合物。其實例包括WNT-5A受體拮抗劑。WNT-5A受體的具體實例包括人Frizzled 5(SEQ ID NO4)和大鼠Frizzled 2(SEQ ID NO6)。盡管這種化合物可以是肽或非肽，但是優選非肽抑制劑，因為它具有作用時間較長的優點。該化合物可以用標記的WNT-5A和WNT-5A受體篩選系統選擇，優選IC50值為30μM或更低，更優選IC50值為10μM或更低。
抑制WNT-5A生成的化合物指抑制WNT-5A基因表達的化合物。盡管這種化合物可以是肽或非肽的，但是優選非肽抑制劑，因為它具有作用時間較長的優點。該化合物可以用WNT-5A蛋白(SEQID NO1)含量或WNT-5A mRNA(SEQ ID NO2)含量的減少作為指標進行選擇，根據Hartley等人(Drug Metabolism and Disposition，28(5)，608-616(2000)；下述試驗實施例4)的方法，通過核酸探針測定的該化合物IC50值優選為30μM或更低，更優選IC50值為10μM或更低。
特別優選通式(I)、(II)和(IX)代表的化合物。
在通式(I)、(II)和(IX)代表的化合物中，C1-6烷基指含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，其實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、2-乙基丙基、己基等。
C1-6烷酰基指含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷酰基，其實例包括乙酰基、丙酰基、丁酰基、叔丁酰基等。
C1-6烷氧基指含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，其實例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、異戊氧基、新異戊氧基、叔戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、1，2-二甲基丙氧基、己氧基、異己氧基等。
C1-6烷氧基亞氨基指含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基亞氨基，其實例包括N-甲氧基亞氨酸、N-乙氧基亞氨基、N-丙氧基亞氨基、N-異丙氧基亞氨基、N-丁氧基亞氨基、N-異丁氧基亞氨基、N-戊氧基亞氨基、N-己氧基亞氨基等。
C1-6烷酰氧基指含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷酰氧基，其實例包括乙酰氧基、丙酰氧基、新戊酰氧基等。
C3-10環烷基指含有3-10個碳原子的環烷基，其實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環壬基等。
取代的C3-10環烷基的實例包括氫原子被至少一個選自下列的基團取代的環烷基鹵素原子、取代的或未取代的C1-10烷基、羥基、C1-5羥烷基、羧基、巰基、吲哚基、C1-5烷硫基、氨基、酰氨基和C1-5烷氧基。
芳基的實例包括苯基、萘基、蒽基等。
取代芳基的實例包括氫原子被至少一個選自下列的基團取代的芳基取代的或未取代的C1-10烷基、羥基、C1-5羥烷基、羧基、巰基、吲唑基、吲哚基、C1-5烷硫基、氰基、硝基、氨基、酰胺基(amido)、乙酰氨基和C1-5烷氧基。
C2-10雜環的實例包括呋喃、吡咯、噻吩、噁唑、異噁唑、噻唑、咪唑、吡唑、吡喃、吡啶、哌啶、噠嗪、嘧啶、吡嗪、喹啉等。
取代的C2-10雜環的實例包括氫原子被至少一個選自下列的基團取代的雜環鹵素原子、取代或未取代的C1-10烷基、羥基、C1-5羥烷基、羧基、巰基、吲唑基、吲哚基、C1-5烷硫基、氰基、硝基、氨基、酰胺基(amido)和C1-5烷氧基。
醚鍵指-O-，通式-(CH2)m-O-(CH2)n-(其中m和n均代表一個1-3的整數，通式中的亞烷基可以被烷基取代)，或者通式-O-(CH2)m-O-(其中m是一個1-3的整數，通式中的亞烷基可以被烷基取代)。
形成π鍵或醚鍵的相鄰基團組合的實例包括(R4與R5)、(R5與R6)、(R6與R7)、(R7與R8)和(R8與R9)(同樣適用于通式(IX)中的R4a-R9a)。
在通式(IX)代表的化合物中，優選通式(I)代表的化合物，更優選如R3a是氫原子、R3b是羥基的化合物。出于化合物穩定性的考慮，優選通式(IIa)、(IIb)和(IIc)代表的化合物。
其中(R4和R5)和(R6和R7)均形成一個π鍵的通式(II)化合物 (其中R1、R2、R3c、R3d、R8、R9和X具有與上述相同的含義)。
其中(R4和R5)形成一個π鍵、R6和R7各代表一個氫原子的通式(II)化合物
(其中R1、R2、R3c、R3d、R8、R9和X具有與上述相同的含義)。
其中R4、R5、R6和R7各代表一個氫原子的通式(II)化合物 (其中R1、R2、R3c、R3d、R8、R9和X具有與上述相同的含義)。
在通式(IX)代表的化合物中，優選R3e和R6b一起形成醚鍵且(R3f和R4a)和(R5a和R6a)均形成一個π鍵的化合物(例如化合物77等)，因為它們有效抑制真皮乳頭細胞中WNT-5A mRNA的表達，并且促進真皮乳頭細胞的生長。
在通式(IX)代表的化合物中，優選R1a和R2a均代表(CH2)pCO-Y-R10(其中Y代表氧原子或硫原子；R10代表氫原子、C1-6烷基或取代或未取代的芳基；p為0或1)的化合物(例如化合物52等)，以及R1a和R2a均代表COR12(其中R12代表取代或未取代的芳基，或取代或未取代的雜環)的化合物(例如化合物58等)，因為它們有效抑制真皮乳頭細胞中WNT-5A mRNA的表達，并且促進真皮乳頭細胞的生長。
也優選R7a代表Z-R13(其中Z代表氧原子或硫原子；R13代表C2-6烷酰基或取代或未取代的芳基)的化合物(例如化合物53等)，因為它們有效抑制真皮乳頭細胞中WNT-5A mRNA的表達，并且促進真皮乳頭細胞的生長。
通式(II)代表的化合物能夠通過例如下列生產方法組合生產。
反應式1 (其中R1、R2、R3c、R3d、R8、R9和X具有與上述相同的含義)。
在催化劑(如披鈀碳)存在下，通式(III)代表的化合物在有機溶劑(例如乙酸乙酯、四氫呋喃、二乙醚、乙醇、甲醇等)中進行氫化反應，產生通式(IV)或(IV′)代表的化合物或這些化合物的混合物。通式(IV)和(IV′)的化合物能夠用常規分離方法(如柱層析法)分離純化。
反應式2
(其中R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8、R9和X具有與上述相同的含義)。
在-20-100℃、優選0-20℃下，在有機溶劑(例如四氫呋喃、二乙醚、乙醇、甲醇等)中，通式(V)代表的化合物與還原劑(如硼氫化鉀、硼氫化鈉或硼氫化鋰，必要時同時存在一種鹽，如LiCl、MgCl2、CeCl3、CaCl2或NiCl)反應，產生通式(VI)代表的化合物。通式(VI)代表的化合物可以用常用分離方法(如柱層析法)分離純化。
反應式3 (其中R1、R2、R3c、R3d、R4、R5、R6、R7和X具有與上述相同的含義)。
通式(VII)代表的化合物用酸或堿在適當的有機溶劑(例如四氫呋喃、二乙醚、乙醇、甲醇等)中處理，產生通式(VIII)代表的化合物。
通式(IX)代表的化合物(1、60-78)的生產基本按照生產發酵產品常用的方法，在含有各種養分的培養基中培養Pochoniachalamydosporia var.chlamydosporia TF-0480株。
主要使用液體培養基作為培養基，該培養基含有碳源、氮源和無機鹽，任選地還有維生素、前體和消泡劑，pH調節為7左右。碳源包括葡萄糖、糊精、甘油、淀粉等，它們可以單獨使用或者混合使用。氮源包括肉膏、燕麥粉、酵母提取物、豆粉、聚胨、玉米漿、尿素、銨鹽等，它們可以單獨使用或者混合使用。無機鹽包括磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、碳酸鈣等，它們可以單獨使用或者混合使用。能夠使用的消泡劑包括Adekanol或硅氧烷化合物。需氧培養法適于作為培養方法，如振蕩培養和通氣攪拌培養。培養在pH4-10和25-35℃下進行2-5天，優選在25-28℃下進行3天。
這樣培養產生的化合物1和60-78可以用收集發酵產物常用的方法分離。例如，使用下列方法是有效的。即，在培養完成后，通過離心或過濾獲得培養濾液。然后用聚苯乙烯樹脂如DIAION HP-20(商品名，Mitsubishi Chemical生產)吸附，用有機溶劑(如低級醇或丙酮)洗脫。細胞用有機溶劑(如低級醇或丙酮)抽提。然后將細胞提取物和來自吸附樹脂的洗脫物合并在一起，在減壓下濃縮。為了抽提，向剩余的水相中加入有機溶劑如乙酸乙酯、氯仿或正丁醇，將提取物濃縮。將獲得的殘余物再溶解于有機溶劑如苯、乙酸乙酯、丙酮、甲醇或氯仿中，然后進行硅膠柱層析、凝膠過濾柱層析、填充ODS的反相分配柱層析以及高效液相層析，從而純化并分離本發明的化合物。
產生本發明活性成分的菌株是由本發明人從土壤中新分離的一種新菌株。該微生物被命名為“Pochonia chlamydosporia var.chlamydosporia TF-0480”，已被獨立行政法人產業技術綜合研究所國際專利生物保藏中心保藏，保藏號為“FERM BP-8332”。
該菌株的微生物特性如下。
1)在培養基上的生長該微生物在各種瓊脂平板培養基中生長良好，在檢測的培養基中良好或適當地形成孢子。表1總結了在各種培養基上26℃培養2周后形成的菌落的特征。顏色用A.Kornerup等人，Dizionario deicolori，Musterschmidt(1978)提出的色碼表示。
表1

*-1馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(E-MF21，Eiken Chemical Co.，Ltd.生產)。
*-21/2稀釋的燕麥粉瓊脂培養基(Difco生產，用1/2稀釋的Bacto燕麥粉瓊脂制成，添加瓊脂使瓊脂終濃度為2％)。
*-3玉米粉瓊脂培養基(Difco生產，玉米粉瓊脂)。
*-4麥芽膏瓊脂培養基(Nakase，T.，第六版，第617頁，JapanCollection of Microorganisms，the Institute of Physical and ChemicalResearch，Saitama，1995)*-5Sabouraud瓊脂培養基(Eiken Chemical Co.，Ltd.生產，E-MF03)*-6Miura瓊脂培養基(Miura，K.和M.Kudo，Trans.Mycol.Soc.Japan，11，116-118(1970))2)形態學在光學顯微鏡下觀察該菌株在玉米粉瓊脂平板上26℃培養14天后形成的菌落。結果觀察到瓶梗分生孢子(phialo-conidia)的形成。形成分生孢子的單細胞(瓶梗)或2-4個輪生瓶梗直接在菌絲上形成。分生孢子梗與營養菌絲沒有明顯區別。在瓶梗的前沿形成大量分生孢子，形成粘性物質。瓶梗呈逐漸變細的圓柱形，表面光滑、無色。其長度為13-15μm，在基底處厚0.8-1.7μm，在末端厚0.5-0.8μm。分生孢子呈橢圓形或半球形(極少)，大部分都有略微突出的基底。分生孢子的表面光滑、無色，大小為2.2-5.0×1.8-2.8μm。在培養基表面或者在培養基上萌發的短菌絲末端形成具有網狀壁的單個淡黃色多細胞厚垣孢子(磚格厚垣孢子)。在培養基中也形成少量磚格厚垣孢子。這些磚格厚垣孢子的大小為14-20×12-22μm。將培養時間延長到一個月或更長后，未見有性型。
3)生理學性質(1)生長溫度范圍和最佳溫度在pH6.0的Sabouraud液體培養基中，該菌株在15-31℃下生長，最佳溫度為25-27℃。
(2)生長pH范圍和最佳pH值在26℃的YpSs液體培養基中，該菌株在pH3-10下生長，最佳pH為5-7。
4)需氧/厭氧需氧根據上述形態學特征和培養特性，將該菌株的特征與下列文獻報道的各種已知的種相比較(1)K.H.Domsch等人，《土壤真菌概述》(Compendium of soil fungi)，第一卷，IHW-Verlag(1980)，(2)G.L.Barron，《來自土壤的絲孢菌屬》(The Genera ofHyphoomycetes from soil)，Williams & Wilkins(1968)等。結果，該菌株非常類似于已知分類名為Verticillium chlamydosporia或Diheterospora chlamydosporia的不完全種，因此似乎屬于同一個種。在(3)R.Zare，W.Gams和H.C.Evans，A revision of Verticilliumsection Prostrata.V.The genus Pochonia，with notes on Rotiferophthora，73，1-2，p51-86(2001)中，對這個種進行了分子系統的重新檢查，認為它屬于Pochonia屬，該屬是合適的屬。而且，提出形成非連接輪枝孢菌屬型分生孢子的種(本發明的菌株形成這種分生孢子)稱為變種Pochonia chlamydosporia var.chlamydosporia。
根據這些事實，該菌株被命名為“Pochonia chlamydosporia var.chlamydosporia TF-0480”。
<真皮乳頭細胞生長促進劑>
本發明使用的術語“真皮乳頭細胞生長促進劑”指具有增加真皮乳頭細胞數量作用的藥物或試劑。
根據抑制WNT-5A功能的作用來表征本發明真皮乳頭細胞生長促進劑。由于WNT-5A抑制作為WNT/β-連環蛋白途徑激活劑的WNT-1類分子(WNT-1、WNT-8等)的功能，所以通過調節WNT-5A的功能或調節WNT-5A的表達可以控制真皮乳頭細胞的生長。因此，只要具有極佳的抑制WNT-5A功能的作用，甚至結構完全不同的化合物(例如化合物24、化合物79、化合物7等)都有極佳的促進真皮乳頭細胞生長的作用。
化合物24 化合物79 化合物7細胞的生長可以用本領域技術人員公知的方法測量。測量方法的實例包括使用適當的顯色底物計數活細胞和[3H]-胸苷攝入法。優選使用四唑鹽作為顯色底物，如MTT、MTS和XTT和AlamarBlue。
<毛發生長刺激劑/毛發生長補劑>
本發明使用的術語“毛發生長刺激劑或毛發生長補劑”指誘導毛發生長、促進毛發生長、預防脫毛癥等的產品。如果使用本發明的毛發生長刺激劑和毛發生長補劑作為藥物，使用目的包括改善或預防斑禿和男性型脫毛癥。
通過抑制WNT-5A功能促進真皮乳頭細胞生長來實現本發明毛發生長刺激劑和毛發生長補劑的作用。根據這種作用機制，在脫毛部位的真皮乳頭中受到抑制的細胞生長能力得到提高，形成發育良好的真皮乳頭組織。因此，對于現有毛發生長刺激劑和毛發生長補劑幾乎沒有效果的癥狀，預計本發明的毛發生長刺激劑/毛發生長補劑有效。
而且也預計，將本發明的毛發生長刺激劑和毛發生長補劑與具有不同功能的其它毛發生長刺激劑和毛發生長補劑組合能夠獲得協同作用。
本發明的毛發生長刺激劑和毛發生長補劑可以根據單個化合物以各種劑量和各種劑型施用。
如果通過敷劑(洗劑、軟膏劑、凝膠等)施用通式(IX)代表的化合物，例如，可以以0.0001-10％重量、優選0.001-5％重量、更優選0.001-1％重量的劑量施用，但是劑量根據毛發生長補劑的類型和劑型而不同。如果成年男性口服(粉劑、片劑或膠囊劑)通式(IX)代表的化合物，每日劑量優選為1-100mg/kg。
盡管對本發明的毛發生長刺激劑和毛發生長補劑的劑型沒有具體限制，但是在外敷的情況下，優選以水溶性組合物的形式提供含有WNT-5A生成抑制劑(例如通式(IX)代表的化合物)作為活性成分的毛發生長刺激劑/毛發生長補劑。只要不損害本發明的效果，這種水溶性組合物能夠用生產藥品、準藥品或化妝品中常用的各種添加劑(濕潤劑、增稠劑、防腐劑、抗氧化劑、芳香劑、著色劑等)生產。本發明的毛發生長刺激劑和毛發生長補劑可以是護發組合物，如生發油、發油、摩絲(hair moose)或凝膠或軟膏。
如果以液體制劑使用本發明的毛發生長刺激劑和毛發生長補劑，這種制劑可以是將WNT-5A生成抑制劑(例如通式(IX)代表的化合物)溶解于純水、適當緩沖液(如磷酸緩沖液)、生理鹽溶液(如生理鹽水、林格氏溶液或無蛋白質人工血清)、與常用表面活性劑等適當組合的乙醇或甘油中制成的水溶液、非水溶液、懸液、脂質體或乳狀劑，隨后滅菌。它作為液體制劑對頭皮局部施用。該液體制劑局部直接施用于頭皮。此外，也可以用噴嘴施用，如噴霧。
如果以半固體制劑使用本發明的毛發生長刺激劑和毛發生長補劑，將WNT-5A生成抑制劑(例如通式(IX)代表的化合物)與脂肪、油、羊毛脂、凡士林、石蠟、蠟、石膏、樹脂、塑料、丙三醇、高級醇、甘油、水、乳化劑、懸浮劑等混合，制成能夠局部施用的外用制劑(軟膏、乳膏等)。
如果以固體制劑使用本發明的毛發生長刺激劑和毛發生長補劑，將WNT-5A生成抑制劑(例如通式(IX)代表的化合物)與適當的添加劑混合，制成外用制劑，如粉劑或粉末。此外，也可以制備固體制劑，在使用前將其溶解或懸浮于溶劑中，施用于頭皮。
如果口服使用，優選將WNT-5A生成抑制劑(例如通式(IX)代表的化合物)與藥物可接受載體(填充劑、粘合劑、崩解劑、香料、矯正劑、乳化劑等)、稀釋劑、溶解助劑等混合，獲得的藥用組合物用常規方法加工，制成片劑、膠囊、顆粒劑、粉劑、糖漿劑、懸液、溶液等。
這些制劑能夠用常用的配制技術生產。
<篩選方法>
本發明還涉及一種篩選真皮乳頭細胞生長促進劑的方法，包括選擇抑制WNT-5A功能的化合物。
選擇抑制WNT-5A功能的化合物(在下文中有時被稱為“WNT-5A功能抑制劑”)指，例如，選擇(即篩選)WNT-5A生成抑制劑，或者選擇WNT-5A受體拮抗劑。
任何材料都可以作為本發明篩選方法的試驗材料。也就是說，對試驗材料的種類沒有限制，它們可以是低分子量化合物、天然提取物中所含的化合物或合成肽。也可以是化合物文庫或組合文庫。化合物文庫可以用本領域技術人員公知的方法構建。此外，也可以使用商品化化合物文庫。出于用作藥物的考慮，進行篩選的化合物優選分子量為3000或更低。出于能夠敷用/口服的考慮，優選分子量為600或更低的低分子量化合物。
(1)篩選WNT-5A受體拮抗劑的方法在篩選WNT-5A受體拮抗劑的方法中，通過使用標記的WNT-5A蛋白質和WNT-5A受體，檢測或測量該標記物，能夠檢查WNT-5A蛋白質與WNT-5A受體之間是否成鍵。標記物的實例包括放射性同位素(32P、33P、131I、125I、3H、14C、35S等)、酶(堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶等)、熒光物質(異硫氰酸熒光素等)等。它們可以作為商品獲得，也可以用已知的方法進行標記。
體外測定系統的一個具體實例是在無細胞系統中進行。更具體而言，WNT-5A蛋白質和WNT-5A受體之一與支持體連接，添加二者中未連接的另一種蛋白質和試驗材料。在溫育后，洗滌反應混合物，檢測或測量另一種蛋白質與支持體連接蛋白質的結合。
連接蛋白質的支持體的實例包括不可溶多糖，如瓊脂糖、葡聚糖和纖維素；合成樹脂，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅氧烷；等等。更具體而言，可以使用商品化的珠子和用這些材料制成的平板。
(2)篩選抑制WNT-5A生成的化合物的方法可以用WNT-5A mRNA的量或WNT-5A蛋白質的量作為指標，篩選抑制WNT-5A生成的化合物。也可以將一種報道基因與WNT-5A基因的啟動區結合，并檢測其表達量。優選使用SEQ ID NO3代表的序列作為WNT-5A基因的啟動子。
報道基因的實例包括GFP(綠色熒光蛋白)基因、GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)基因、LUC(螢光素酶)基因和CAT(氯霉素乙酰轉移酶)基因。
當用WNT-5A mRNA的表達量作為指標時，使用表達人WNT-5A的細胞，并加入試驗材料。在孵箱中37℃、5％CO2-95％空氣下培養數小時后，裂解細胞，提取RNA。然后通過例如RT-PCR測定WNT-5A mRNA的量。這樣能夠找到具有減少WNT-5A mRNA量之活性的材料。對PCR中使用的引物沒有具體限制，只要它們是WNT-5A mRNA特異的，可以根據WNT-5A mRNA序列設計。優選的實例包括正向引物AATGTCTTCC AAGTTCTTCC TAGTGGC(SEQ ID NO8)和反向引物GATGTCGGAA TTGATACTGG CA(SEQID NO9)。
當使用WNT-5A蛋白質含量作為指標時，可以使用表達人WNT-5A的細胞，并向其中加入試驗材料。在孵箱中37℃、5％CO2-95％空氣下培養數小時后，利用培養基裂解細胞，提取蛋白質。然后通過ELISA(酶聯免疫吸附測定)等方法測定WNT-5A蛋白質的含量。這樣能夠找到具有減少WNT-5A mRNA表達量之活性的物質。
下面，參照試驗實施例詳細描述本發明；但是，本發明不限于這些實施例。
實施例1(化合物3和4)將根赤殼菌素(化合物110.8g)溶解于乙酸乙酯(140ml)中，加入5％披鈀碳(濕型)(255mg)，隨后進行氫置換(1atm)，在室溫下攪拌3小時。過濾披鈀碳后，在減壓下餾出濾液。獲得的殘余物通過硅膠層析法純化，用正己烷∶乙酸乙酯(2∶1)洗脫，獲得目的化合物4(3.43g)，或者用正己烷∶乙酸乙酯(3∶2)洗脫，產生目的化合物3(4.14g)。
實施例2(化合物7和8)將化合物3(602.5mg)溶解于甲醇(13ml)中，加入七水合氯化鈰(III)(2.14g)，隨后在室溫下攪拌30分鐘。然后在冰冷卻下向溶液中緩慢加入硼氫化鈉(180mg)，隨后在室溫下攪拌5分鐘。向反應溶液中加入飽和磷酸氫二鈉(40ml)后，用水(40ml)稀釋混合物，在減壓下餾出有機溶劑。殘留的水層用乙酸乙酯抽提(300ml×2)。獲得的乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。然后，通過硅膠制備的薄層層析(20cm×20cm，厚度為1.0mm，用氯仿∶甲醇＝93∶7展開，用乙酸乙酯洗脫)粗純化殘余物。然后將獲得的粗純化產物通過高效液相層析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶35洗脫)純化，產生目的化合物(化合物7144.9mg，化合物813.8mg)。
實施例3(化合物9和10)將化合物4(26.5mg)溶解于甲醇(5ml)中，加入七水合氯化鈰(III)(100mg)，隨后在室溫下攪拌30分鐘。然后在冰冷卻下向溶液中緩慢加入硼氫化鈉(60mg)，隨后在室溫下攪拌30分鐘。向反應溶液中加入飽和磷酸氫二鈉(12ml)后，用水(20ml)稀釋混合物，在減壓下餾出有機溶劑。殘留的水層用乙酸乙酯抽提(30ml×2)。獲得的乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。然后，通過硅膠制備的薄層層析(20cm×20cm，厚度為0.25mm，用氯仿∶甲醇＝94∶6展開，用乙酸乙酯洗脫)純化殘余物，產生目的化合物(化合物95.7mg，化合物108.8mg)。
實施例4(化合物5)將根赤殼菌素(91.5mg)溶解于甲醇(5ml)中，加入七水合氯化鈰(III)(88mg)，隨后在室溫下攪拌10分鐘。然后在冰冷卻下向溶液中緩慢加入硼氫化鈉(60mg)，隨后在室溫下攪拌30分鐘。向反應溶液中加入飽和磷酸氫二鈉(20ml)后，用水(20ml)稀釋混合物，在減壓下餾出有機溶劑。殘留的水層用乙酸乙酯抽提(50ml×3)。獲得的乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。然后，通過硅膠制備的薄層層析(20cm×20cm，厚度為0.5mm，用氯仿∶甲醇＝9∶1展開，用乙酸乙酯洗脫)純化殘余物，產生目的化合物5(27.2mg)。
實施例5(化合物2)
將根赤殼菌素(15.3mg)溶解于吡啶(1.5ml)中，加入乙酸酐(4ml)，隨后在室溫下攪拌6.5小時。向反應溶液中加入冰水(20ml)后，用乙酸乙酯(20ml)抽提混合物。乙酸乙酯層用水洗滌(20ml×2)，在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。然后，通過硅膠制備的薄層層析(20cm×20cm，厚度為0.5mm，用氯仿∶甲醇＝95∶5展開，用乙酸乙酯洗脫)純化殘余物，產生目的化合物2(18.5mg)。
實施例6(化合物11)將根赤殼菌素(19.0mg)溶解于二甲基亞砜(1ml)中，加入碳酸鉀(3mg)和甲基碘(4ml)，隨后在室溫下攪拌6.5小時。向反應溶液中加水(20ml)后，用乙酸乙酯(20ml)抽提混合物。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。然后，通過硅膠制備的薄層層析(20cm×20cm，厚度為0.5mm，用氯仿∶甲醇＝95∶5展開，用乙酸乙酯洗脫)純化殘余物，產生目的化合物11(15.3mg)。
實施例7(化合物16、17、19和23)將根赤殼菌素(930mg)溶解于1，4-二噁烷(14ml)中，加入1N鹽酸(12ml)，隨后在室溫下攪拌2小時。用水(40ml)稀釋后，用乙酸乙酯(100ml)抽提混合物。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。然后，通過硅膠制備性薄層層析(20cm×20cm，厚度為1.0mm，用氯仿∶甲醇∶正已烷＝5∶1∶5展開，用乙酸乙酯洗脫)粗純化殘余物。獲得的粗純化產物然后通過高效液相層析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝70∶30-40∶60進行梯度洗脫)純化，產生目的化合物(化合物1611.4mg，化合物1719.4mg，化合物1932.6mg，化合物23103.7mg)。
實施例8(化合物12和13)
將根赤殼菌素(232.6mg)溶解于1，4-二噁烷(4ml)中，加入1N鹽酸(1ml)，隨后在室溫下攪拌30分鐘。用1N氫氧化鈉中和后，在減壓下餾出溶劑。然后用20ml甲醇溶解該濃縮物。獲得的溶液通過棉塞過濾，在減壓下餾出甲醇。獲得的殘余物然后通過高效液相層析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶3洗脫)純化，產生目的化合物(化合物1242.6mg，化合物1310.4mg)。
實施例9(化合物18)在冰冷卻下向5ml二甲基甲酰胺中滴入1ml磷酰氯，在室溫下攪拌混合物30分鐘。在冰冷卻下將獲得的溶液緩慢加入根赤殼菌素(98.5mg)的二甲基甲酰胺溶液(4ml)中，隨后在室溫下攪拌24小時。然后用乙酸乙酯(100ml)稀釋反應溶液，用水洗滌(100ml×3)。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，在減壓下餾出乙酸乙酯。然后，通過硅膠制備性薄層層析(20cm×20cm，厚度為0.5mm，用氯仿∶甲醇＝94∶6展開，用乙酸乙酯洗脫)純化獲得的殘余物，產生目的化合物(化合物1861.8mg)。
實施例10(化合物14和15)將根赤殼菌素(378mg)溶解于1，4-二噁烷(4ml)中，加入1N鹽酸(1ml)，隨后在室溫下攪拌20分鐘。用1N氫氧化鈉中和后，在減壓下餾出溶劑。然后用20ml甲醇溶解該濃縮物。獲得的溶液通過棉塞過濾，在減壓下餾出甲醇。然后通過高效液相層析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝70∶30洗脫)純化獲得的殘余物，同時產生目的化合物(化合物1410.7mg，化合物159.9mg)以及化合物12(40.6mg)。
實施例11(化合物20、21和22)將化合物3(96.3mg)溶解于1，4-二噁烷(2ml)中，加入1N鹽酸(2.5ml)，隨后在室溫下攪拌16小時。用1N氫氧化鈉中和后，在減壓下餾出溶劑。然后用20ml甲醇溶解該濃縮物。獲得的溶液通過棉塞過濾，在減壓下餾出甲醇。然后通過高效液相層析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝45∶55洗脫)純化獲得的殘余物，產生目的化合物(化合物209.3mg，化合物2122.0mg，化合物2226.2mg)。
實施例12(化合物25和26)將化合物7(34mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(2ml)中，加入氫氧化鉀(3mg)和碘甲烷(500μl)，隨后在室溫下攪拌4.5小時。向反應溶液中加水(20ml)后，混合物用乙酸乙酯(20ml)抽提。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。將獲得的殘余物溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(38∶62)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化，獲得兩個級分。每個級分都在減壓下濃縮，產生化合物25(6.4mg，39min)和化合物26(14.5mg，29min)。
實施例13(化合物27)將化合物7(55mg)溶解于吡啶(1ml)中，加入乙酸酐(3ml)，隨后在室溫下攪拌17小時。向反應溶液中加水(50ml)后，混合物用乙酸乙酯(50ml)抽提。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。將獲得的殘余物溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(60∶40)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化。將獲得的級分在減壓下濃縮，產生化合物27(64.7mg，18min)。
實施例14(化合物28和29)將化合物8(131mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(2ml)中，加入氫氧化鉀(3mg)和碘甲烷(2ml)，隨后在室溫下攪拌7小時。向反應溶液中加水(40ml)后，混合物用乙酸乙酯(40ml)抽提。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。將獲得的殘余物溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(38∶62)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化。獲得兩個級分，分別在減壓下濃縮，產生化合物28(14.2mg，52min)和化合物29(31.7mg，37min)。
實施例15(化合物30)將化合物8(72mg)溶解于吡啶(2ml)中，加入乙酸酐(2ml)，隨后在室溫下攪拌17小時。向反應溶液中加水(50ml)后，混合物用乙酸乙酯(50ml)抽提。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。將獲得的殘余物溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(53∶47)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化。將獲得的級分在減壓下濃縮，產生化合物30(45.5mg，30min)。
實施例16(化合物31)將根赤殼菌素(10.8g)溶解于乙酸乙酯(140ml)中，加入5％披鈀碳(濕型)(255mg)，隨后進行氫置換(1atm)，在室溫下攪拌3小時。在過濾披鈀碳后，將濾液在減壓下濃縮。獲得的殘余物通過硅膠層析[硅膠60(商品名，Merck生產)]純化，用正己烷∶乙酸乙酯(2∶1)洗脫，獲得化合物4(3.43g)，或者用正己烷∶乙酸乙酯(3∶2)洗脫，產生化合物3(4.14g)。將化合物3與化合物4之間級分(3.08g)的一部分(500mg)溶解于少量N，N-二甲基甲酰胺中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(38∶62)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化。獲得2個級分，分別在減壓下濃縮，產生化合物3(177.8mg)以及化合物31(20.7mg，23min)。
實施例17(化合物32、33和34)將根赤殼菌素(11.9g)溶解于乙酸乙酯(160ml)中，加入5％披鈀碳(濕型)(300mg)。用氫清洗(1atm)后，在室溫下攪拌混合物3小時。在過濾披鈀碳后，將濾液在減壓下濃縮。獲得的殘余物通過硅膠層析[硅膠60(商品名，Merck生產)]純化，用正己烷∶乙酸乙酯(2∶1)洗脫，獲得化合物4，或者用正己烷∶乙酸乙酯(3∶2)洗脫，產生化合物3。此外，用正己烷∶乙酸乙酯(1∶1)洗脫的級分也在減壓下濃縮，產生粗純化的產物(936mg)。將獲得的粗純化產物溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(34∶66)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化，獲得3個級分。每個級分都在減壓下濃縮，產生化合物32(17.4mg，17min)、化合物33(49.4mg，18min)和化合物34(347.4mg，21min)。
實施例18(化合物35)將根赤殼菌素(210mg)溶解于吡啶(4ml)中，在室溫下加入鹽酸羥胺(180mg)，隨后加熱至40℃，攪拌2.5小時。冷卻至室溫后，加水(100ml)，混合物用乙酸乙酯(80ml)抽提。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。使用氯仿-甲醇(90∶10)作為展開劑，通過制備性硅膠層析[硅膠60 F254(商品名，Merck生產)，厚0.5mm]純化所得殘余物。收集Rf值為0.65的級分，用乙酸乙酯抽提，然后在減壓下濃縮，產生化合物35(40.0mg)。
實施例19(化合物36、37、38和39)將根赤殼菌素(11.9g)溶解于乙酸乙酯(160ml)中，加入5％披鈀碳(濕型)(300mg)，隨后進行氫置換(1atm)，在室溫下攪拌3小時。在過濾披鈀碳后，濾液在減壓下濃縮。獲得的殘余物通過硅膠層析[硅膠60(商品名，Merck生產)]純化，用正己烷∶乙酸乙酯(2∶1)洗脫。將獲得的級分在減壓下濃縮，產生含有化合物4為主要成分的級分(1537mg)。將該級分溶解于甲醇(21ml)/四氫呋喃(7ml)中，加入七水合氯化鈰(III)(2130mg)，隨后在室溫下攪拌30分鐘。然后在冰冷卻下向溶液中緩慢加入硼氫化鈉(790mg)，隨后在室溫下攪拌10分鐘。反應溶液用水(30ml)稀釋，通過添加1N鹽酸水溶液將pH值調節為中性，隨后進一步用水(30ml)稀釋。水層用乙酸乙酯抽提(100ml×2)。獲得的乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯，產生一種膠狀物質(1.46g)。將獲得的物質溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶劑混合物中，用正己烷濕潤制備的硅膠[硅膠60(商品名，Merck生產)]柱(400ml)吸附。然后用正己烷-乙酸乙酯的溶劑混合物連續洗脫。用正己烷-乙酸乙酯(2∶1)洗脫化合物4后，殘余物用正己烷-乙酸乙酯(3∶2)洗脫，通過在減壓下濃縮產生級分(1)(190mg)和級分(2)(398mg)。將級分(1)溶解于少量四氫呋喃中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(35∶65)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化，獲得三個級分。每個級分都在減壓下濃縮，產生化合物9(87.2mg)以及化合物36(11.3mg，20min)和化合物38(10.1mg，25min)。將級分(2)溶解于少量四氫呋喃中，在與級分(1)相同的條件下，通過制備性高效液相層析純化，獲得兩個級分。每個級分都在減壓下濃縮，產生化合物37(19.8mg，25min)和化合物39(23.2mg，27min)。
實施例20(化合物40和41)
將化合物7(61mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，加入氫氧化鉀(5mg)和1-溴丁烷(1ml)，隨后在室溫下攪拌3.5小時。向反應溶液中加水(20ml)后，混合物用乙酸乙酯(30ml)抽提。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。將獲得的殘余物溶解于少量丙酮中，使用(60∶40)到(90∶10)梯度的乙腈-水(pH3.5，乙酸)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化，獲得兩個級分。每個級分都在減壓下濃縮，產生化合物40(25.6mg，33min)和化合物41(21.4mg，40min)。
實施例21(化合物42和43)將化合物7(67mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，加入氫氧化鉀(5mg)和1-溴己烷(1ml)，隨后在室溫下攪拌3.5小時。向反應溶液中加水(20ml)后，混合物用乙酸乙酯(30ml)抽提。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。將獲得的殘余物溶解于少量丙酮中，使用(60∶40)到(90∶10)梯度的乙腈-水(pH3.5，乙酸)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化，獲得兩個級分。每個級分都在減壓下濃縮，產生化合物42(24.9mg，38min)和化合物43(32.9mg，53min)。
實施例22(化合物44)將化合物7(62mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，加入氫氧化鉀(5mg)和1-溴丙烷(1ml)，隨后在室溫下攪拌1.5小時。向反應溶液中加水(20ml)后，混合物用乙酸乙酯(30ml)抽提。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。將獲得的殘余物溶解于少量丙酮中，使用(45∶55)到(85∶15)梯度的乙腈-水(pH3.5，乙酸)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化。將獲得的級分在減壓下濃縮，產生化合物44(453mg，38min)。
實施例23(化合物45)將化合物7(64mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，加入氫氧化鉀(5mg)和2-(溴甲基)環己烷(2ml)，隨后在室溫下攪拌7小時。向反應溶液中加水(20ml)后，混合物用乙酸乙酯(30ml)抽提。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。將獲得的殘余物溶解于少量丙酮中，使用(65∶35)到(85∶15)梯度的乙腈-水(pH3.5，乙酸)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化。獲得的級分在減壓下濃縮，產生化合物45(24.7mg，70min)。
實施例24(化合物46)將化合物7(200mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，加入氫溴酸(5ml)，隨后在110℃下攪拌6小時。向反應溶液中加入乙酸乙酯(150ml)后，用碳酸氫鈉洗滌混合物(150ml×2)。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯。將獲得的殘余物溶解于少量甲醇中，使用(38∶62)到(50∶50)梯度的乙腈-水(pH3.5，乙酸)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化。將獲得的級分在減壓下濃縮，產生化合物46(17.0mg，18min)。
實施例25(化合物47)將化合物62(154mg)溶解于乙酸乙酯(5ml)中，加入5％披鈀碳(濕型)(30mg)，隨后進行氫置換(1atm)，并在室溫下攪拌90分鐘。在過濾披鈀碳后，在減壓下餾出濾液，獲得化合物47(134.8mg)。
實施例26(化合物48)將化合物61(211mg)溶解于乙酸乙酯(11ml)中，加入5％披鈀碳(濕型)(42mg)，隨后進行氫置換(1atm)，在室溫下攪拌90分鐘。在過濾披鈀碳后，在減壓下餾出濾液。用氯仿-甲醇(95∶5)作為展開劑，通過制備性薄層層析[硅膠60 F254(商品名，Merck生產)，20cm×20cm，厚度為0.5mm]純化所得殘余物(184mg)。收集Rf值為0.5的部分，用乙酸乙酯抽提，然后在減壓下濃縮，產生化合物48(159.7mg)。
實施例27(化合物49和50)將化合物61(233mg)溶解于甲醇(10ml)/四氫呋喃(2ml)中，加入七水合氯化鈰(III)(754mg)，隨后在室溫下攪拌30分鐘。然后在冰冷卻下向溶液中緩慢加入硼氫化鈉(236mg)，隨后在室溫下攪拌5分鐘。用水(30ml)稀釋反應溶液后，加入1N鹽酸水溶液(3ml)，將pH值調節為中性，進一步用水(30ml)稀釋該混合物。水層用乙酸乙酯抽提(100ml×2)。獲得的乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯，獲得白色粉末(267mg)。然后將獲得的粉末溶解于少量水中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(45∶55)作為流動相，通過制備的高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化，獲得兩個級分。每個級分均在減壓下濃縮，產生化合物49(49.3mg，19min)和化合物50(184.6mg，21min)。
實施例28(化合物51)將化合物62(191mg)溶解于甲醇(10ml)/四氫呋喃(4ml)中，加入七水合氯化鈰(III)(641mg)，隨后在室溫下攪拌30分鐘。然后在冰冷卻下向溶液中緩慢加入硼氫化鈉(216mg)，隨后在室溫下攪拌10分鐘。用水(30ml)稀釋反應溶液后，加入1N鹽酸水溶液(3ml)，將pH值調節為中性，進一步用水(30ml)稀釋該混合物。水層用乙酸乙酯抽提(100ml×2)。獲得的乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥，然后在減壓下餾出乙酸乙酯，獲得無色油狀物質(182mg)。然后將獲得的油狀物溶解于少量甲醇中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(30∶70)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化。將獲得的級分在減壓下濃縮，產生化合物51(137.3mg，29min)。
實施例29(化合物52)將根赤殼菌素(205mg)溶解于丙酮(10ml)中，加入S-氯乙酰基苯硫酚(330mg)和碳酸鉀(310mg)，隨后在室溫下攪拌1.5小時。然后向反應溶液中加水，隨后用乙酸乙酯抽提。用飽和氯化鈉水溶液洗滌并在無水硫酸鎂上干燥后，將提取物在減壓下干燥。然后通過硅膠柱層析(20g，乙酸乙酯∶正己烷＝1∶2)粗純化殘余物。獲得的粗純化產物然后通過高效液相層析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶35洗脫)純化，產生化合物52(105mg)。
實施例30(化合物53)將根赤殼菌素(406mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(6ml)中，加入三乙胺(57.6mg)和苯硫酚(260mg)，隨后在冰冷卻下攪拌過夜。然后向反應溶液中加入稀釋的鹽酸，隨后用乙酸乙酯抽提。用水及飽和氯化鈉水溶液連續洗滌并在無水硫酸鎂上干燥后，將提取物在減壓下干燥。然后將238mg所得殘余物通過高效液相層析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶35洗脫)純化，產生化合物53(46.0mg)。
實施例31(化合物54和55)將根赤殼菌素(378mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(6ml)中，在冰冷卻下加入三乙胺(56.4mg)和硫代乙酸(163mg)，隨后在冰冷卻下攪拌過夜。然后向反應溶液中加入稀釋的鹽酸，隨后用乙酸乙酯抽提。用水及飽和氯化鈉水溶液連續洗滌并在無水硫酸鎂上干燥后，將提取物在減壓下干燥。然后將238mg所得殘余物通過高效液相層析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶35洗脫)純化，產生化合物54(49.0mg)和化合物55(15.7mg)。
實施例32(化合物56)將根赤殼菌素(131mg)溶解于丙酮(10ml)中，加入溴乙酸甲酯(219mg)和碳酸鉀(183mg)，隨后在室溫下攪拌3小時。向反應溶液中加入稀釋的鹽酸，隨后用乙酸乙酯抽提。用飽和氯化鈉水溶液洗滌并在無水硫酸鎂上干燥后，減壓干燥提取物。然后將獲得的殘余物從乙酸乙酯中再結晶，產生化合物56(81.8mg)。
實施例33(化合物57)將化合物7(116mg)溶解于丙酮(10ml)中，加入溴乙酸甲酯(330mg)和碳酸鉀(276mg)，隨后在室溫下攪拌3天。向反應溶液中加入稀釋的鹽酸，隨后用乙酸乙酯抽提。用飽和氯化鈉水溶液洗滌并在無水硫酸鎂上干燥后，將提取物在減壓下干燥。然后將獲得的殘余物從乙酸乙酯中再結晶，產生化合物57(27.7mg)。
實施例34(化合物58)將根赤殼菌素(103mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(6ml)中，加入煙酸(190mg)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(270mg)和4-二甲基吡啶(37.7mg)，隨后在室溫下攪拌3.5小時。然后向反應溶液中加水，隨后用乙酸乙酯抽提。用飽和氯化鈉水溶液洗滌并在無水硫酸鎂上干燥后，將提取物在減壓下干燥。然后將獲得的殘余物從丙酮-水中再結晶，產生化合物58(94.5mg)。
實施例35(化合物59)將化合物56(312mg)溶解于甲醇(60ml)中，加入氫氧化鉀(206mg)-水(20ml)，隨后在室溫下攪拌15分鐘。然后向反應溶液中加入稀釋的鹽酸，隨后用乙酸乙酯抽提。用飽和氯化鈉水溶液洗滌并在無水硫酸鎂上干燥后，將提取物在減壓下干燥。然后通過高效液相層析(20φ×250mm，YMC-Pack Pro C18，用水(其中已加入乙酸，pH3.5)∶乙腈＝65∶35洗脫)純化所得殘余物，產生化合物59(10.6mg)。
實施例36(化合物60、61、62、63、68和70)在含有2.0％葡萄糖、4.0％甘露醇、2.0％燕麥粉、0.4％酵母提取物、0.001％七水合硫酸鐵(II)、0.001％七水合硫酸鋅(II)、0.001％四-五水合硫酸鎂(II)和0.0005％五水合硫酸銅(II)的無菌液體培養基中接種Pochonia chlamydosporia var.chlamydosporia TF-0480株，然后在26℃振搖培養72小時。使用一個50L的罐，在與種子培養中使用的培養基組成相同的無菌培養基中接種300ml種子培養基，然后在26℃通氣攪拌下培養144小時。培養完成后，離心培養物，從上清液中分離細胞。上清液吸附于1.5L HP-20(Mitsubishi Chemical生產)，用水洗滌，然后用3L甲醇洗脫。將洗脫物在減壓下濃縮，獲得的水層用乙酸乙酯抽提。乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上脫水，在減壓下濃縮，產生一種褐色糖漿狀物質(60g)。
將一部分(30g)培養提取物溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶劑混合物中，吸附于用正己烷濕潤制備的硅膠[硅膠60(商品名，Merck生產)]柱(1600ml)。然后用正己烷-乙酸乙酯混合物連續洗脫，獲得用正己烷-乙酸乙酯(4∶1)溶劑混合物洗脫的級分(130mg)、(2∶1)洗脫的級分(1)(1.88g)和級分(2)(780mg)以及(1∶2)洗脫的級分(3.56g)。將正己烷-乙酸乙酯(4∶1)洗脫的級分(130mg)溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(55∶45)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化，獲得兩個級分。每個級分都在減壓下濃縮，產生化合物63(23.5mg，20min)和化合物70(4.8mg，24min)。將正己烷-乙酸乙酯(2∶1)洗脫的級分(1.88g)從丙酮(30ml)中再結晶，產生化合物61(277mg)。用正己烷-丙酮(3∶2)作為展開劑，通過制備性薄層層析[硅膠60 F254(商品名，Merck生產)，20cm×20cm，厚1mm]純化洗脫的級分(2)(780mg)。收集Rf值為0.4的部分，用乙酸乙酯抽提，然后在減壓下濃縮，產生化合物60(80.3mg)。然后將正己烷-乙酸乙酯(1∶2)洗脫的級分(3.56g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶劑混合物中，吸附于用氯仿濕潤制備的硅膠[硅膠60(商品名，Merck生產)]柱(880ml)。然后用氯仿-甲醇溶劑混合物連續洗脫，獲得氯仿-甲醇(98∶2)洗脫的級分(926mg)。然后從丙醇-甲醇(1ml/3ml)中再結晶，產生化合物62(339mg)。用Sephadex LH-20(商品名，Amersham Pharmacia Biotech生產)(甲醇，900ml)柱層析，乙腈-水(pH3.5，乙酸)(30∶70)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化氯仿-甲醇(97∶3)洗脫的級分(1.42g)。將所得級分在減壓下濃縮，產生化合物68(4.5mg，21min)。
實施例37(化合物64、65、71、72和76)將實施例36獲得的部分培養提取物(30g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)溶劑混合物中，吸附于用氯仿濕潤制備的硅膠[硅膠60(商品名，Merck生產)]柱(700ml)。然后用氯仿-甲醇溶劑混合物連續洗脫。將氯仿-甲醇(93∶7)洗脫的級分分成兩份，即級分(1)(156mg)和級分(2)(164mg)。將級分(1)溶解于少量甲醇中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(30∶70)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化，獲得四個級分。每個級分都在減壓下濃縮，產生化合物64(35.4mg，21min)、化合物72(13.7mg，27min)、化合物71(6.6mg，29min)和化合物65(4.1mg，33min)。級分(2)在相同條件下通過制備性高效液相層析純化，收集獲得的級分，在減壓下濃縮，產生化合物71(3.7mg)以及化合物76(4.5mg，20min)。
實施例38(化合物69和74)將實施例36獲得的培養提取物(39.5g)溶解于正己烷中(300ml×2)。過濾形成的沉淀物，除去溶劑。將獲得的沉淀物(8.1g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶劑混合物中，吸附于用氯仿濕潤制備的硅膠[硅膠60(商品名，Merck生產)]柱(650ml)。然后用氯仿-甲醇的溶劑混合物連續洗脫，獲得用氯仿-甲醇(88∶12)洗脫的級分(318mg)。將該級分溶解于少量甲醇中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(30∶70)作為流動相，通過制備的高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化，獲得兩個級分。每個級分都在減壓下濃縮，產生化合物74(15.3mg，19min)和化合物69(8.0mg，38min)。
實施例39(化合物66)將實施例36獲得的培養提取物(39.5g)溶解于正己烷中(300ml×2)。過濾形成的沉淀物，除去溶劑。將獲得的沉淀物(8.1g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶劑混合物中，吸附于用氯仿濕潤制備的硅膠[硅膠60(商品名，Merck生產)]柱(650ml)。然后用氯仿-甲醇的溶劑混合物連續洗脫，獲得用氯仿-甲醇(100∶0)洗脫的級分(1.5mg)。然后過硅膠柱(620ml)，使用正己烷-乙酸乙酯的溶劑混合物，獲得用正己烷-乙酸乙酯(2∶1)洗脫的級分(321mg)。將獲得的級分溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(梯度為45∶55到70∶30)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化，產生化合物66(14.4mg，34min)。
實施例40(化合物73、77和78)將實施例36獲得的培養提取物(500g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶劑混合物中，吸附于用氯仿濕潤制備的硅膠[硅膠60(商品名，Merck生產)]柱(6000ml)。然后用氯仿-甲醇的溶劑混合物連續洗脫。獲得用氯仿-甲醇(95∶5)洗脫的級分(57g)。將該級分的一部分(18g)進一步過硅膠柱(800ml)，使用正己烷-乙酸乙酯的溶劑混合物。將正己烷-乙酸乙酯(2∶1)洗脫的級分分成兩份，即級分(1)(126mg)和級分(2)(985mg)。將級分(1)溶解于少量丙酮中，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(55∶45)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-PackPro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化。將獲得的級分在減壓下濃縮，產生化合物78(13.4mg，26min)。另一方面，使用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(45∶55)作為流動相，通過制備性高效液相層析純化級分(2)，獲得兩個級分。每個級分都在減壓下濃縮，產生化合物73(38.1mg，10min)和化合物77(67.2mg，26min)。
實施例41(化合物67和75)將實施例36獲得的培養提取物(500g)溶解于氯仿-甲醇(4∶1)的溶劑混合物中，吸附于用氯仿濕潤制備的硅膠[硅膠60(商品名，Merck生產)]柱(6000ml)。然后用氯仿-甲醇的溶劑混合物連續洗脫。獲得氯仿-甲醇(95∶5)洗脫的級分(57g)。將該級分的一部分(18g)進一步過硅膠柱(800ml)，使用正己烷-乙酸乙酯的溶劑混合物，獲得正己烷-乙酸乙酯(1∶2)洗脫的級分。將該級分溶解于少量丙酮中，用乙腈-水(pH3.5，乙酸)(40∶60)作為流動相，通過制備性高效液相層析[柱YMC-Pack Pro C18 AS-343(20φ×250mm)，檢測254nm的紫外線吸收，流速10ml/min]純化，獲得兩個級分。每個級分都在減壓下濃縮，產生化合物67(17.4mg，11min)以及一種半純樣品(23.9mg)。使用氯仿-甲醇(90∶10)作為展開劑，通過制備性薄層層析[硅膠60 F254(商品名，Merck生產)，20cm×20cm，厚0.5mm]純化這種半純樣品。收集Rf值為0.5的部分，用乙酸乙酯抽提，然后在減壓下濃縮，產生化合物75(4.3mg)。
表2顯示在上述實施例中合成并純化的化合物及其數據。





















試驗實施例1真皮乳頭細胞中WNT-5A mRNA的表達人真皮乳頭細胞購自Toyobo，在含有12％FBS的MEM(Invitrogen)中培養。根據Arase等人(J.Dermatol.Sci.，2，66-70(1991))的方法，從拔出的毛發中分離人毛囊細胞，使用KGM-2(SankoJunyaku)培養。
將第5代真皮乳頭細胞和第2代毛囊細胞接種于一個10cm的培養皿中，使其密度為2×106細胞/孔，培養2夜。除去培養基后，用PBS(-)洗滌細胞，利用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA。用50ng總RNA、0.4μM WNT-5A或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)特異的引物[WNT-5A正向引物AATGTCTTCC AAGTTCTTCCTAGTGGC(SEQ ID NO8)，WNT-5A反向引物GATGTCGGAATTGATACTGG CA(SEQ ID NO9)，GAPDH正向引物ACCACAGTCC ATGCCATCAC(SEQ ID NO10)和GAPDH反向引物TCCACCACCC TGTTGCTGTA(SEQ ID NO11)]和SUPERSCRIPTOne-Step RT-PCT with PLATINUM Taq(Invitrogen)，按照SUPERSCRIPTOne-Step RT-PCT with PLATINUM Taq所附操作方案進行RT-PCR。簡言之，第一鏈的合成在總體積為25μl的反應體系中50℃下進行30分鐘。加熱到94℃2分鐘后，將所有cDNA片段均擴增23或20個循環，每個循環包括94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒。
每個反應溶液都在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。圖1顯示結果。
如果使用真皮乳頭細胞(DPC)來源的RNA，在使用WNT-5A特異性引物的23個循環的PCR中觀察到cDNA片段顯著擴增。如果使用毛囊細胞(HFC)來源的RNA，在相同條件下未見擴增產物。
試驗實施例2減少WNT-5A mRNA含量之活性的測定
人真皮乳頭細胞購自Toyobo，在含有12％FBS的MEM(Invitrogen)中培養。
將第5代真皮乳頭細胞接種于一個12孔板中，使其密度為1.6×105細胞/孔，培養過夜。然后將培養基替換為不添加化合物的培養基或含有化合物1、2、3、4、5、7、9或24的培養基，繼續培養24小時。在培養完成后，除去所有培養基，用PBS(-)洗滌細胞。然后使用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA。用50ng總RNA、0.4μM WNT-5A或GAPDH特異性引物[WNT-5A正向引物AATGTCTTCC AAGTTCTTCC TAGTGGC(SEQ ID NO8)，WNT-5A反向引物GATGTCGGAA TTGATACTGG CA(SEQ ID NO9)，GAPDH正向引物ACCACAGTCC ATGCCATCAC(SEQ ID NO10)和GAPDH反向引物TCCACCACCC TGTTGCTGTA(SEQ IDNO11)]和SUPERSCRIPTOne-Step RT-PCT with PLATINUM Taq(Invitrogen)，按照SUPERSCRIPTOne-Step RT-PCT with PLATINUMTaq所附操作方案進行RT-PCR。簡言之，第一鏈的合成在總體積為25μl的反應體系中50℃下進行30分鐘。加熱到94℃2分鐘后，將WNT-5A或GAPDH的cDNA片段擴增23或20個循環，每個循環包括94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒。
每個反應溶液都在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。圖2顯示結果。
在使用WNT-5A特異性引物的23個循環的PCR中，與使用不添加化合物的培養基的培養物相比，在含化合物的培養物中擴增的WNT-5A cDNA片段顯著減少。
另一方面，在使用GAPDH特異性引物的20個循環的PCR中，無論是否存在化合物，擴增的cDNA片段的量均未見改變。
試驗實施例3真皮乳頭細胞生長促進活性的檢測
人真皮乳頭細胞購自Toyobo，在含有12％FBS的MEM(Invitrogen)中培養。
將第5代真皮乳頭細胞接種于一個用于球體培養的96孔板中，使其密度為1.6×104細胞/孔，并培養過夜。然后將培養基替換為不添加化合物的培養基或含有化合物1、2、3、4、5、7、9或24的培養基，繼續培養72小時。培養完成后，用細胞計數試劑盒(WakoPure Chemicals)計數細胞。在完成培養前5小時，向每個培養基中各加入1/10培養基量的WST-1試劑，然后在培養完成時測量培養基的光密度(O.D.450nm/620nm)。在0.25-4×104細胞/孔范圍內，觀察到在細胞數與光密度之間正相關。
結果表明，具有減少WNT-5A mRNA含量之活性的化合物具有促進真皮乳頭細胞生長的活性(圖3)。在該圖中，每個數值代表6個孔(對照組)或3個孔(試驗組)的平均值。為了比較對照組與試驗組，使用Student’s t檢驗*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
上述試驗實施例表明，人真皮乳頭細胞中表達WNT-5A，本發明的化合物可減少真皮乳頭細胞中WNT-5A mRNA的含量，具有減少WNT-5A mRNA含量之活性的化合物具有促進真皮乳頭細胞生長的活性。
試驗實施例4減少WNT-5A mRNA含量的化合物(表2)的活性(通過QuantiGene法對mRNA定量)人真皮乳頭細胞購自Toyobo，在含有12％FBS的MEM(Invitrogen)中培養。
將第5代真皮乳頭細胞接種于一個96孔板中，使其密度為1×104細胞/孔，并培養過夜。然后將培養基替換為不添加化合物的培養基或含有這些化合物的培養基，繼續培養24小時。在培養完成后，使用QuantiGene High Volume試劑盒(Bayer Medical)，通過分支DNA(bDNA)信號擴增法(Drug Metabolism and Disposition，28(5)，608-616(2000))測定WNT-5A或GAPDH mRNA的含量。根據QuantiGene High Volume試劑盒所附的方案，利用裂解混合物裂解細胞，將裂解溶液加到捕獲板上。然后添加一組WNT-5A或GAPDH特異的探針，使之在53℃下反應20小時。用含有0.03％硫酸月桂酯的0.1×SSC洗板后，加入含有bDNA的擴增探針，使之在46℃下反應1小時。洗板后，加入堿性磷酸酶標記的標記探針，使之在46℃下反應1小時。洗板后，加入底物Lumi-Phos Plus，使之在46℃下反應30分鐘。然后用WALLAC 1420ARVOSX測量發光。
WNT-5A特異性探針組根據人WNT-5A mRNA編碼區序列設計。使用10種探針(SEQ ID NOs12-21)作為捕獲探針(CaptureExtenders，CEs)；使用31種探針(SEQ ID NOs22-52)作為標記探針(Label Extenders，LEs)；使用9種探針(SEQ ID NOs53-60)作為阻斷探針(Blockers)。
用人GAPDH的bDNA探針組(XenoTech LLC，B0960)作為GAPDH特異性探針組。
WNT-5A和GAPDH mRNAs的量表示為與不添加化合物的對照組相比的相對值(％)，計算mRNA量減半時的化合物濃度(IC50)作為相應化合物的WNT-5A mRNA減少活性的指標。
表3顯示化合物對WNT-5A和GADPH mRNA含量的影響。表中的每個數值是2個孔的平均值。這些化合物減少了真皮乳頭細胞中的WNT-5A mRNA含量。活性最高的化合物的IC50值為0.12μM。在每種化合物抑制WNT-5A mRNA的IC50濃度下測定的GAPDH mRNA含量未見減少。
表3IC50(μM)化合物編號 WNT-5A GAPDH10.20 28.2520.39 26.4133.16 57.9543.46 ＞3053.47 ＞3074.07 ＞12018 0.63 6.5824 4.74 21.0735 0.46 4.2938 6.42 ＞12052 0.12 13.4753 0.12 45.4554 2.37 ＞3055 0.74 ＞3058 0.50 79.9565 8.28 109.1668 10.69 50.6373 9.37 ＞12076 8.56 55.9477 8.13 ＞12079 0.90 38.16試驗實施例5化合物的真皮乳頭細胞生長促進活性(表2)人真皮乳頭細胞購自Toyobo，在含有12％FBS的MEM(Invitrogen)中培養。
將第5代真皮乳頭細胞接種于一個用于球形培養的96孔板中，使其密度為1.5×104細胞/孔，并培養過夜。然后將培養基替換為不添加化合物的培養基或含有該化合物的培養基，繼續培養72小時。在培養完成后，用細胞計數試劑盒(Wako Pure Chemicals)計數細胞。在完成培養前5小時，向每個培養基中添力1/10培養基量的WST-1試劑，然后在培養完成時測量培養基的光密度(O.D.450nm/620nm)。在0.25-4×104細胞/孔范圍內，觀察到在細胞數與光密度之間正相關。
表4顯示具有減少WNT-5A mRNA含量之活性的化合物對真皮乳頭細胞生長的影響。在該表中，每個數值代表6個孔(對照組)或3個孔(試驗組)的平均值。為了比較對照組與試驗組，使用Student’s t檢驗*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
具有減少WNT-5A mRNA含量之活性的每種化合物在16μM時都顯示顯著的促進真皮乳頭細胞生長的活性。具有減少WNT-5AmRNA含量之強活性(即IC50低于1μM)的化合物1、2、18、35、52、53和58在1μM時也顯示明顯的生長促進活性。
表4ΔO.D.450nm/620nm(對照的％)化合物編號 1 4 16(μM)1 132.9±11.6***183.7±12.1***144.7±13.0***2 142.6±10.1***167.3±8.5***241.0±25.3***3 92.9±1.6 92.9±9.9 244.2±33.4***4 97.4±24.4 148.2±4.9***180.2±6.9***5 110.2±45.0 174.7±29.2***236.4±26.4***7 82.6±3.9 169.7±10.4***194.8±12.7***18 115.6±9.0*147.1±11.3***210.9±25.9***24 108.2±6.9 104.3±10.5 119.7±3.7**35 160.8±3.5***181.6±3.7***158.6±18.3***38 103.5±2.6 89.6±7.3 124.9±5.1**52 124.5±1.0***143.2±9.5***197.0±5.4***53 126.6±14.3**149.5±12.8***184.4±3.6***54 80.0±2.4 97.1±5.6 135.0±0.9***55 89.0±1.8 126.9±7.2***175.6±9.8***58 123.3±1.8***150.4±9.4***217.4±14.5***65 92.1±6.7 87.6±8.7 141.0±5.3***73 91.7±5.7 81.2±7.8 205.6±9.2***76 80.0±5.6 77.1±7.0 120.7±6.3*77 81.6±4.4 86.3±5.0 180.8±21.7***79 87.5±9.9 98.6±3.6 120.0±4.1***p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001試驗實施例6猴皮膚器官培養物中WNT-5A mRNA的減少采集獼猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))(雄性，6歲)的背部皮膚，在立體顯微鏡下分成小片(5mm×8mm)。然后在William’s MediumE(Invitrogen)中培養每個皮膚組織片，該培養基中不添加化合物或添加化合物7或化合物3，并且含有10μg/ml胰島素(Sigma)和10ng/ml氫化可的松(Kurabo)。
在培養的第11天，從每個皮膚組織片上分離毛囊，用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA。使用200ng總RNA、0.4μM WNT-5A或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)特異的引物[WNT-5A正義AATGTCTTCC AAGTTCTTCC TAGTGGC(SEQ ID NO8)，WNT-5A反義GATGTCGGAA TTGATACTGG CA(SEQ ID NO9)，GAPDH正義ACCACAGTCC ATGCCATCAC(SEQ ID NO10)和GAPDH反義TCCACCACCC TGTTGCTGTA(SEQ ID NO11)]和SUPERSCRIPTOne-Step RT-PCT with PLATINUM Taq(Invitrogen)，按照SUPERSCRIPT One-Step RT-PCT with PLATINUM Taq所附的操作方案進行RT-PCR。簡言之，按照SUPERSCRIPT One-Step RT-PCT with PLATINUM Taq所附的操作方案，第一鏈的合成在總體積為25μl的反應體系中50℃下進行30分鐘。加熱到94℃2分鐘后，將WNT-5A或GAPDH的cDNA片段擴增40或30個循環，每個循環包括94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒。
每個反應溶液都在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，用Cyber Green(Takara)染色。圖4顯示結果。
在使用WNT-5A特異性引物的40個循環的PCR中，與不添加化合物的培養物相比，在添加化合物7或化合物3的培養物中擴增的WNT-5A cDNA片段顯著減少。
另一方面，在使用GAPDH特異性引物的30個循環的PCR中，無論是否存在化合物，擴增的cDNA片段的量均未見改變。
試驗實施例7猴皮膚器官培養物中增殖細胞核抗原(PCNA)陽性細胞的增多采集獼猴(食蟹猴)(雄性，6歲)的背部皮膚，在立體顯微鏡下分成小片(5mm×8mm)。然后在William’s Medium E(Invitrogen)中培養每個皮膚組織片，該培養基中不添加化合物或添加化合物7或化合物3，并且含有10μg/ml胰島素(Sigma)和10ng/ml氫化可的松(Kurabo)。
在培養的第30天，皮膚組織片均在室溫下用10％中性福爾馬林固定。制備石蠟包埋的切片。加入含有1％BSA的PBS后，在室溫下放置30分鐘，然后在0.1M檸檬酸緩沖液中煮沸。然后與抗PCNA抗體(Dako Japan，稀釋200倍)在4℃下反應過夜，然后與生物素化抗小鼠IgG抗體反應。進而與ABC標準試劑盒(載體)反應，用AEC物質(Sigma)顯色。
結果在毛囊和表皮基底層的細胞中觀察到陽性反應。在毛囊中，在毛發生長終期和生長期毛囊的真皮乳頭和真皮鞘中觀察到PCNA陽性細胞計數顯著增加(圖5)。
試驗實施例8猴皮膚器官培養物中毛球直徑的增大采集獼猴(食蟹猴)(雄性，6歲)的背部皮膚，在立體顯微鏡下分成小片(5mm×8mm)。然后在William’s Medium E(Invitrogen)中培養每個皮膚組織片，該培養基中不添加化合物或添加化合物7或化合物3，并且含有10μg/ml胰島素(Sigma)和10ng/ml氫化可的松(Kurabo)。
在培養的第30天，分離每個皮膚組織片中的所有毛囊，在立體顯微鏡下測量毛球的直徑。
圖6和圖7顯示結果。在這些圖中，每個數值代表每個皮膚組織切片中所有毛囊的毛球直徑的平均值±S.E.。為了比較對照組與試驗組，使用Student’s t檢驗*P＜0.05。
這些圖也是顯示毛球直徑分布的直方圖。將每個皮膚組織片中的所有毛囊分成如圖所示的毛球直徑組，每個組中的毛囊計數表示為相對于從組織片中分離的總毛囊計數的相對值(％)。圖6顯示在化合物7存在下培養后達到的效果。在化合物7存在下培養30天后，皮膚片中所含毛囊的平均毛球直徑顯著高于不添加化合物的對照組。如分布所示，在直徑140μm或更大但小于170μm的組中，不加化合物的對照組顯示最大毛囊計數，而在直徑170μm或更大但是小于200μm的組中，添加化合物7的組顯示最大毛囊計數。在不添加化合物的組中，毛球直徑為170μm或更大的毛囊的比例為57.6％，而在含有化合物7的組中該比例升高到82.4％。
另一方面，圖7顯示在化合物3存在下培養后達到的效果。與化合物7的情況類似，在化合物3存在下培養30天后，皮膚片中所含毛囊的平均毛球直徑顯著高于不添加化合物的對照組。如分布所示，在直徑140μm或更大但小于170μm的組中，不加化合物的對照組顯示最大毛囊計數，而在直徑200μm或更大但小于230μm的組中，添加化合物3的組顯示最大毛囊計數。在不添加化合物的組中，毛球直徑為170μm或更大的毛囊的比例為55.8％，而在含有化合物3的組中該比例升高到74.5％。
試驗實施例9殘尾獼猴毛發生長試驗向患有脫毛癥的殘尾獼猴(短尾猴(Macaca arctoides))(雄性，14歲)的前額施用1mL含有0.3％化合物7的洗劑，一天一次，每周5次，共6個月。在開始施用之前，前額的脫毛部位用文身標記。在開始施用之前和施用6個月之后對含文身的皮膚部分照相。
圖8提供在施用含有化合物7的洗劑之前和施用6個月之后的放大皮膚照片。在施用前，觀察到許多細毫毛。相反，在同一部位施用6個月后，毫毛減少，粗終毛增多。也就是說，可以認為施用6個月含有化合物7的洗劑明顯改善了殘尾獼猴前額的脫毛癥。
上述試驗實施例的結果表明，人真皮乳頭細胞表達WNT-5A，本發明的化合物減少人真皮乳頭細胞中WNT-5A mRNA的含量，具有減少WNT-5A mRNA含量之活性的化合物具有促進真皮乳頭細胞生長的活性。
這些結果還表明，本發明的化合物也使猴皮膚器官培養物中WNT-5A mRNA的含量減少，該化合物使毛發生長終期和生長期毛囊中PCNA染色陽性的增殖細胞顯著增多，而且該化合物使毛囊的毛球增大。
而且這些結果還表明，本發明的化合物具有改善殘尾獼猴(雄性型脫毛癥的動物模型)脫毛癥的作用。
也就是說，促進真皮乳頭細胞生長的化合物可以提高脫毛癥處毛囊的真皮乳頭中降低的細胞生長能力，因此有利于形成發育良好的真皮乳頭組織，從而促進毛發生長。
工業實用性WNT-5A功能抑制劑(例如，具有減少WNT-5A mRNA含量之活性的化合物或其藥物可接受的鹽)具有促進真皮乳頭細胞生長的活性，因此可以用作具有新型作用機制的毛發生長刺激劑/毛發生長補劑。
本發明提供了一種全新的概念，使用抑制WNT-5A功能的化合物作為改善或預防脫毛癥的藥物，篩選這種抑制WNT-5A功能的化合物用于開發新型毛發生長刺激劑/毛發生長補劑。
序列表<110>大正制藥株式會社<120>毛發生長制劑<130>P600<160>61<150>JP 2002-115529<151>2002-04-17<210>1<211>365<212>蛋白質<213>智人<400>1Met Ala Gly Ser Ala Met Ser Ser Lys Phe Phe Leu Val Ala Leu5 10 15Ala Ile Phe Phe Ser Phe Ala Gln Val Val Ile Glu Ala Asn Ser20 25 30Trp Trp Ser Leu Gly Met Asn Asn Pro Val Gln Met Ser Glu Val35 40 45Tyr Ile Ile Gly Ala Gln Pro Leu Cys Ser Gln Leu Ala Gly Leu50 55 60Ser Gln Gly Gln Lys Lys Leu Cys His Leu Tyr Gln Asp His Met65 70 75Gln Tyr Ile Gly Glu Gly Ala Lys Thr Gly Ile Lys Glu Cys Gln80 85 90Tyr Gln Phe Arg His Arg Arg Trp Asn Cys Ser Thr Val Asp Asn95 100 105Thr Ser Val Phe Gly Arg Val Met Gln Ile Gly Ser Arg Glu Thr110 115 120
Ala Phe Thr Tyr Ala Val Ser Ala Ala Gly Val Val Asn Ala Met125 130 135Ser Arg Ala Cys Arg Glu Gly Glu Leu Ser Thr Cys Gly Cys Ser140 145 150Arg Ala Ala Arg Pro Lys Asp Leu Pro Arg Asp Trp Leu Trp Gly155 160 165Gly Cys Gly Asp Asn Ile Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Ala Lys Glu170 175 180Phe Val Asp Ala Arg Glu Arg Glu Arg Ile His Ala Lys Gly Ser185 190 195Tyr Glu Ser Ala Arg Ile Leu Met Asn Leu His Asn Asn Glu Ala200 205 210Gly Arg Arg Thr Val Tyr Asn Leu Ala Asp Val Ala Cys Lys Cys215 220 225His Gly Val Ser Gly Ser Cys Ser Leu Lys Thr Cys Trp Leu Gln230 235 240Leu Ala Asp Phe Arg Lys Val Gly Asp Ala Leu Lys Glu Lys Tyr245 250 255Asp Ser Ala Ala Ala Met Arg Leu Asn Ser Arg Gly Lys Leu Val260 265 270Gln Val Asn Ser Arg Phe Asn Ser Pro Thr Thr Gln Asp Leu Val275 280 285Tyr Ile Asp Pro Ser Pro Asp Tyr Cys Val Arg Asn Glu Ser Thr290 295 300Gly Ser Leu Gly Thr Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu305 310 315Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asp320 325 330
Gln Phe Lys Thr Val Gln Thr Glu Arg Cys His Cys Lys Phe His335 340 345Trp Cys Cys Tyr Val Lys Cys Lys Lys Cys Thr Glu Ile Val Asp350 355 360Gln Phe Val Cys Lys365<210>2<211>4428<212>DNA<213>智人<400>2ttaaggaaat ccgggctgct cttccccatc tggaagtggc tttccccaca tcggctcgta 60aactgattat gaaacatacg atgttaattc ggagctgcat ttcccagctg ggcactctcg 120cgcgctggtc cccggggcct cgccccccac cccctgccct tccctcccgc gtcctgcccc 180catcctccac cccccgcgct ggccaccccg cctccttggc agcctctggc ggcagcgcgc 240tccactcgcc tcccgtgctc ctctcgccca tggaattaat tctggctcca cttgttgctc 300ggcccaggtt ggggagagga cggagggtgg ccgcagcggg ttcctgagtg aattacccag 360gagggactga gcacagcacc aactagagag gggtcagggg gtgcgggact cgagcgagca 420ggaaggaggc agcgcctggc accagggctt tgactcaaca gaattgagac acgtttgtaa 480tcgctggcgt gccccgcgca caggatccca gcgaaaatca gatttcctgg tgaggttgcg 540tgggtggatt aatttggaaa aagaaactgc ctatatcttg ccatcaaaaa actcacggag 600gagaagcgca gtcaatcaac agtaaactta agagaccccc gatgctcccc tggtttaact 660tgtatgcttg aaaattatct gagagggaat aaacatcttt tccttcttcc ctctccagaa 720gtccattgga atattaagcc caggagttgc tttggggatg gctggaagtg caatgtcttc 780caagttcttc ctagtggctt tggccatatt tttctccttc gcccaggttg taattgaagc 840caattcttgg tggtcgctag gtatgaataa ccctgttcag atgtcagaag tatatattat 900aggagcacag cctctctgca gccaactggc aggactttct caaggacaga agaaactgtg 960ccacttgtat caggaccaca tgcagtacat cggagaaggc gcgaagacag gcatcaaaga 1020
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ctcacctggt tcctggcagc cggtatgaag tggggccacg cggccatcga ggccaattcg 1200cagtacttcc acctggccgc ctgggcggtg ccggccgtca aaaccatcac catcctggcc 1260atgggccaga tcgacggcga cctgctgagc ggcgtgtgct tcgtgggcct caacaggctg 1320gacccgctgc gaggcttcgt gctggcgccg ctcttcgtgt acctgttcat cggcacatcc 1380ttcctgctgg cgggcttcgt gtcactcttc cgcatccgca ccatcatgaa gcacgacggc 1440accaagacgg agccgctgga gaggctcatg gtgcgtatcg gcgtcttctc cgtgctctac 1500accgtaccgg ccaccatcgt catcgcctgc tacttctatg agcaggcctt ccgcgagcac 1560tgggagcgct cgtgggtaag ccagcactgc aagagcctag ccatcccctg cccggcccac 1620tacacgcccc gcacgtcgcc cgacttcaca gtctacatga tcaaatacct catgacgctc 1680atcgtgggca tcacgtcggg cttctggatc tggtccggca agacgctgca ctcgtggagg 1740aagttctaca cgcgtctcac caacagccgg catggagaga ccaccgtgtg aagcggtctc 1800gctgctgggc gcccccctct cccaggtccg gactgcaacc gtgccctcct tcactcggga 1860ggggggtgca ccctacggac tcctatttta tttttttaaa taaagaacag tg 1912<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
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tttctaaaaa ccaaaaacca gaatttttta ggcataggac ccgtgtct 48<210>24<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
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ctaccaccct ctttcaactg gtttttaggc ataggacccg tgtct 45<210>31<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>設計作為探針的核苷酸<400>33aggtttgttt tgttttgttt tgtttttttt aggcatagga cccgtgtct 49<210>34<211>47<212>DNA
<213>人工序列<220>
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<223>設計作為探針的核苷酸<400>37
tctgtctgca aatggaatat ttgattttta ggcataggac ccgtgtct 48<210>38<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>38tcatgagcta ttagaatatg acggttttta ggcataggac ccgtgtct 48<210>39<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>39aattttttaa tttctgggga ctttttttta ggcataggac ccgtgtct 48<210>40<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>40aaatcaacat cttgacataa gagttttatt tttaggcata ggacccgtgt ct 52<210>41<211>46<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>41ggggtctttt tacaaatctg gatttttagg cataggaccc gtgtct 46<210>42<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>42agaaaataca ggatatttca tttatgtttt ttaggcatag gacccgtgtc t 51<210>43<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>43tactattata atttactaac caagtatccc tatttttagg cataggaccc gtgtct 56<210>44<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>44
ctgtgaatgg gattcatgta ttatttcttt ttaggcatag gacccgtgtc t 51<210>45<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>45gctgaatggc acgcaattac tttttaggca taggacccgt gtct 44<210>46<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>46aggttgtctg ctctggtgca gttttttagg cataggaccc gtgtct 46<210>47<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>47cacaacacgg aggaatcaga gagtttttag gcataggacc cgtgtct47<210>48<211>45<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>48gaaacgtggc cagcatcaca ttttttaggc ataggacccg tgtct 45<210>49<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>49tgtcctacaa ccaaagggga ctttttaggc ataggacccg tgtct 45<210>50<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>50gagctcctaa tgtttcattt cctttttagg cataggaccc gtgtct 46<210>51<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>51
agttttagga aacaaaaatc cctttttagg cataggaccc gtgtct 46<210>52<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>52gaaaactact gctcctcaaa ataaattttt aggcatagga cccgtgtct 49<210>53<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>53attcttgggg aaaaataaaa aata 24<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>54gttcccaccc ccattattgc 20<210>55<211>28<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>55caaaagaagt cttgtattac cttttcaa 28<210>56<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>56catatttgag aaaaagaaaa tgtatttct29<210>57<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>57aaaatgcaga aagcaagcta gca 23<210>58<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>58
caaaaaatct agtgtccaga atcattg 27<210>59<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>59tcaagccaac ctccccaaa 19<210>60<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>60ggatttcact gtttttcctc aaat 24<210>61<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計作為探針的核苷酸<400>61taagtagtga actgttttcc aagca2權利要求
1.一種真皮乳頭細胞生長促進劑，其含有具有抑制WNT-5A功能之活性的化合物。
2.根據權利要求1的真皮乳頭細胞生長促進劑，其中抑制WNT-5A功能的化合物是WNT-5A生成抑制劑。
3.由下列通式(I)代表的化合物 其中R1和R2相同或不同，各自代表氫原子、C1-6烷基或C2-6烷酰基；X代表氫原子或鹵素原子；R3a和R3b相同或不同，各自代表氫原子或羥基；和R4、R5、R6、R7、R8和R9相同或不同，各自代表氫原子、羥基、鹵素原子或C2-6烷酰氧基，或者其相鄰基團一起形成π鍵或醚鍵，或者R5和R8或R5和R9一起形成醚鍵。
4.一種真皮乳頭細胞生長促進劑，其含有由下列通式(III)代表的化合物 其中R1和R2相同或不同，各自代表氫原子、C1-6烷基或C2-6烷酰基；X代表氫原子或鹵素原子；R3c和R3d相同或不同，各自代表氫原子、羥基或C1-6烷氧基，或者R3c和R3d一起形成氧代基、肟基或C1-6烷氧基亞氨基；和R4、R5、R6、R7、R8和R9相同或不同，各自代表氫原子、羥基、鹵素原子或C2-6烷酰氧基，或者其相鄰基團一起形成π鍵或醚鍵，或者R5和R8或R5和R9一起形成醚鍵。
5.一種真皮乳頭細胞生長促進劑，其含有由下列通式(IX)代表的化合物 其中R1a和R2a相同或不同，各自代表氫原子、C1-6烷基或C2-6烷酰基、(CH2)pCO-Y-R10代表的基團，其中Y代表氧原子或硫原子；R10代表氫原子、C1-6烷基或取代的或未取代的芳基；p＝0或1，(CH2)qR11代表的基團，其中R11代表取代的或未取代的環烷基，或取代的或未取代的C2-10雜環；q＝0或1，或COR12代表的基團，其中R12代表取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的C2-10雜環；X代表氫原子或鹵素原子；R3e和R3f相同或不同，各自代表氫原子、羥基、C1-6烷氧基或C1-6烷酰氧基，或者R3e和R3f一起形成氧代基、肟基或C1-6烷氧基亞氨基；和R4a、R5a、R6a、R7a、R8a和R9a相同或不同，各自代表氫原子、羥基、鹵素原子或Z-R13代表的基團，其中Z代表氧原子或硫原子；R13代表C1-6烷基、C1-6烷酰基或取代的或未取代的芳基，或其相鄰基團一起形成π鍵或醚鍵，或R5a和R8a或R5a和R9a一起形成醚鍵；和R6b代表氫原子，或者與R3e或R3f一起形成醚鍵。
6.一種毛發生長刺激劑或毛發生長補劑，其含有根據權利要求1、2、4和5中任一項的真皮乳頭細胞生長促進劑作為活性成分。
7.一種刺激毛發生長或促進毛發生長的方法，包括對人施用藥物有效量的具有抑制WNT-5A功能之活性的化合物。
8.一種具有抑制WNT-5A功能之活性的化合物在制備毛發生長刺激劑或毛發生長補劑中的用途。
9.一種篩選真皮乳頭細胞生長促進劑的方法，該方法包括選擇抑制WNT-5A功能的化合物。
10.根據權利要求9的方法，其包括下列步驟(a)-(c)(a)在已經添加化合物的培養基中培養表達人WNT-5A的細胞的步驟；(b)裂解步驟(a)中培養的表達人WNT-5A的細胞，提取RNA，并且測定WNT-5A mRNA含量的步驟；和(c)比較步驟(b)中測定的WNT-5A mRNA含量的步驟。
全文摘要
一種毛乳頭細胞生長促進劑、毛發生長刺激劑和毛發生長補劑，其含有一種具有抑制WNT－5A功能之活性的化合物。
文檔編號C07D493/04GK1652743SQ0381132
公開日2005年8月10日 申請日期2003年4月17日 優先權日2002年4月17日
發明者池田明子, 筱永英樹, 藤本奈津子, 葛西陽子 申請人:大正制藥株式會社