專利名稱：β－D－二氧戊環核苷的制藥用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于治療乙型肝炎病毒(也叫作“HBV”)方法領域，包括施用有效量的一種或多種本文公開的活性化合物或一種這些化合物的藥用可接受衍生物或前藥。
背景技術：
HBV是僅次于煙草的人體癌癥病因。HBV誘發癌癥的機理雖然尚不清楚，但是人們假定它直接引發腫瘤發展，或者通過感染涉及的慢性炎癥、肝硬變和細胞再生而間接引起腫瘤發展。
HBV在世界范圍內已達到流行病程度。經過2至6月宿主不知道的感染潛伏期之后，HBV感染能夠導致急性肝炎和肝損傷，引起腹痛、黃疸和某些酶在血液中的升高的濃度。HBV能夠造成暴發性肝炎，一種快速進行性和常常是致命的大面積肝受破壞的疾病。
患急性肝炎的病人一般能復原。但是，在一些患者血液中，長期或無限期地存在高水平的病毒抗原，造成慢性感染。慢性感染能導致慢性持久性肝炎。被慢性持久性HBV感染的病人，在發展中國家最普遍。截止到1991年中，僅在亞洲就有大約二億二千五百萬HBV的慢性攜帶者，而世界上幾乎達三億。慢性持久性肝炎能造成疲勞、肝硬變和肝細胞癌(一種主要的肝癌)。
在西方工業化國家中，高HBV感染危險的人群，包括與HBV攜帶者或與其血樣接觸的那些人。HBV的流行病學，事實上與獲得性免疫缺陷綜合征的情況很相似，這說明了為什么HBV感染在愛滋病或HIV有關的感染病病人中普遍的原因。然而，HBV與HIV相比更具接觸性。
為了使病人對HBV免疫研制出了人血漿源疫苗，已經通過遺傳工程生產了一些疫苗。雖然發現這種疫苗有效，但是其生產因從慢性攜帶者取人血漿受限制而且提純操作既貴又長而帶來麻煩。此外，由不同的血漿制備的每批疫苗還必須在黑猩猩上試驗來保證安全，而且這種疫苗無助于已經感染上此病毒的病人。
每天用α-干擾素(一種遺傳工程法得到的蛋白質)治療也證明是有前途的方法。但是迄今為止，尚無有效抑制所說病毒在人體內復制的已經藥劑。
鑒于HBV已達到世界性流行病程度，以及對被感染的病人具有嚴重的和悲慘的影響，一直迫切需要提供新而有效并且對宿主低毒性的藥劑來治療受此病毒感染的人。
發明內容
因此，本發明的另一目的在于提供一種用于治療被HBV感染的病人和其他宿主的方法和組合物。
在一種優選的方案中，本發明是一種治療受HBV感染的病人的方法，其中包括施用HBV治療有效量的、對映體純的式(I)所示的β-D-二氧戊環基嘌呤核苷或其藥物可接受的鹽或衍生物 其中R是OH、Cl、NH2或H，X是選自氫、酰基、一磷酸酯基、二磷酸酯基和三磷酸酯基，而且選擇性地輔以藥物可接受載體或稀釋劑。其中R是Cl的所說化合物是(-)-(2R，4R)-2-氨基-6-氯-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]嘌呤。其中R是羥基的所說化合物是(-)-(2R，4R)-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]鳥嘌呤。其中R是氨基的該化合物是(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]腺嘌呤。其中R是氫的該化合物是(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]嘌呤。這些化合物的絕對構型尚未經結晶學測定。這些名稱是根據與制造該化合物所用母糖的構型進行結構比較得出的。
在另一實施方案中，給病人施用有效量的β-L二氧戊環基嘌呤核苷對映體或者所說的-β-L-和β-D-二氧戊環基嘌呤核苷的外消旋混合物。
所公開的β-二氧戊環嘌呤核苷或其藥物可接受的衍生物或鹽，或者含這些化合物的藥物可接受制劑，可以用于預防和治療HBV感染和其它有關的癥狀，如抗HBV抗體陽性和HBV陽性病狀、由HBV引起的慢性肝炎、肝硬變、急性肝炎、暴發性肝炎、慢性持久性肝炎和疲勞。這些化合物或制劑也可以用于預防性地阻止或延遲抗HBV抗體或HBV-抗原陽性或者接觸過HBV的個體中臨床疾病的發展。
按另一方案，本發明包括一種治療HBV感染病人的方法，其中包括施用HBV治療有效量的專門公開的對映體純β-D-二氧戊環基嘌呤核苷的一種前藥。本文使用的“前藥”，指專門公開的核苷的一種藥物可接受的衍生物，用藥時在體內轉化成所說的核苷，或者其自身的活性。該活性化合物的藥物可接受的鹽(或叫作“生理可接受的鹽”)以及5′和N6酰化或烷基化的衍生物(也叫作“生理或藥物可接受的衍生物”)是非限定性實例。在一種方案中，所說的酰基是一種羧酸酯，其中所說酯基的非羰基部分選自直鏈、支鏈或環狀的C1-C20烷基、烷氧烷基(包括甲氧甲基)、芳烷基(包括芐基)、芳氧烷基(如苯氧甲基)、芳基(包括未取代的或被鹵素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基任意取代的苯基)、二羧酸(如丁二酸)、磺酸酯(如烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)、和一、二及三磷酸酯。
本文所用術語“烷基”，具體包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基、正戊基、叔戊基、環戊基和環己基。本文所用術語“酰基”，具體包括(但不限于)乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、3-甲基丁酰基、丁二酸單酯基、3-氯苯甲酸基、苯甲酰、乙酰、新戊酰、甲磺酸酯基、丙酰、戊酰、己酰、辛酰、癸酰、月桂酰、肉豆蔻酰、棕櫚酰、硬脂酰和油酰基。所說的核苷，了可以像下列參考文獻所公開的那樣以5′醚脂形式提供，這些文獻引入本文作為參考Kucera L.S.N.Iyer，E.Leake，A.Raben，Modest E.J.，D.L.W.和C.Piantadosi在<AIDS Res HumRetroviruses>，6491-501(1990)上發表的文章“抑制傳染性HIV-1產生和誘導缺陷病毒形成的新膜-內活性醚脂類似物”；Piantadosi，C.，J.Marasco C.J.，S.L.Morris-Natschke，K.L.Meyer，F.Gumus，J.R.Surles，K.S.Ishaq，L.S.Kucera，N，Iyer，C.A.Wallen，S.Piantadosi和E.J.Modest在<J.Med.Chem.>341408-1414(1991)上發表的文章“抗HIV活性的新醚脂核苷共軛物的合成及評價”；Hostetler，K.Y.，D.D.Richman，D.A.Carson，L.M.Stuhmiller，G.M.T.van Wijk和H.van den在<Antimicrob Agents Chemother>362025-2029(1992)上發表的文章“利用3’-脫氧胸苷的一種脂前藥-3’-脫氧胸苷二磷酸酯二肉豆蔻酰甘油，顯著提高在CEM和HT4-6C細胞中I型人免疫缺陷病毒復制的抑制作用”；Hostetler，K.Y.，L.M.Stuhmiller，H.B.Lenting，H.van denBosch和D.D.Richman在<J.Biol Chem.>2656112-7(1990)上發表的文章“疊氮基胸苷和其他抗病毒核苷的磷脂類似物的合成及抗反轉錄病毒活性”。
該β-二氧戊環基嘌呤核苷可以通過與適當的酯化劑(如酰鹵或酐)反應轉化成藥物可接受的酯。該核苷或其藥物可接受的衍生物可以按傳統方式，例如用適當的堿處理轉化成其藥物可接受的鹽。所說的酯或鹽例如通過水解可以轉化為所說的母體核苷。
此活性化合物可以以藥物可接受鹽形式提供。本文所用術語“藥物可接受鹽或配合物”，指保留母體化合物所需生物活性并且顯示出最小(若有的話)不希望之毒理作用的那些核苷的鹽或配合物。這種鹽的非限定性實例有(a)與無機酸(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等)形成的酸加成鹽，和與有機酸(如乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、馬來酸、抗壞血酸、苯甲酸、丹寧酸、雙羥萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸和聚半乳糖醛酸)形成的鹽(b)與陽離子(鈉、鉀、鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘等等)形成的堿加成鹽，或與由N，N-二芐亞乙基二胺、銨或乙二胺形成的有機陽離子形成的堿加成鹽；或(c)(a)和(b)的混合物，如丹寧酸鋅鹽等等。
該活性化合物的改變，特別是在N6和51-O鄰位上的改變，能夠影響該活性物質的生物有效度和代謝速度，因而控制活性物質的輸送。
該活性化合物或其藥物可接受衍生物或鹽，也可以與不損害所需作用的其他活性物質或者與補充所需作用的物質如抗生素、抗真菌劑、抗炎藥或其他抗病毒藥(包括抗HBV或抗HIV劑)混合。
在本發明的一種方案中，將一種或多種所說活性化合物與一種或多種其他抗HBV劑交替施用，以提供有效的抗HBV治療。可以用于交替治療的抗HBV劑的實例包括(但不限于)2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫戊環(oxathiolane)(“FTC”，見WO 92/14743)的(-)對映體或外消旋混合物、其生理可接受的衍生物或鹽；2-羥甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫戊環(oxathiolane)(也叫作“BCH-189”，或3TC，見EPA 0382526)的(-)對映體或外消旋混合物、其生理可接受的衍生物或鹽，2′-氟-5-碘-阿糖尿嘧啶(FIAU)的對映體或外消旋混合物；2′-氟-5-乙基阿糖尿嘧啶(FEAU)的對映體或外消旋混合物；carbovir或干擾素。
可以采用任何交替方法治療病人。交替法的非限定性實例，包括在1-6周施用有效量的一種藥劑后，再于1-6周內施用有效量的第二種抗HBV藥。此交替方案可以包括不處置期。
按另一方案，該活性化合物或其衍生物或鹽可以與另一種抗HBV藥(包括上列的那些)合并給藥。一般而言，在變替治療，將每種抗HBV藥的有效劑量依次給藥；而在合并治療時，將兩或多種抗HBV劑按減少的劑量同時給藥。所說的劑量取決于藥物的吸收、失活和分泌速度以及本領域技術人員公知的其他因素。應注意，劑量的大小也隨所患病癥的嚴重程度而變化。還應當知道，對于具體患者、具體劑量制度和計劃來說，按照個體的需要和根據給藥人和監督服藥人的專業判斷，隨時調整給藥劑量。
圖1是說明各種對映體純β-D-二氧戊環基嘌呤核苷的制備方法。
本文所用術語“對映體純”指這樣一種核苷組成，即其中至少含約95％(優選97％)的該核苷單一對映體。
本文所公開的發明是治療人或其他宿主動物HBV感染的方法和組合物，其中包括施用選擇性地處于藥物可接受載體中的有效量的一種或多種上面所說的化合物或其生理可接受的衍生物(包括5′和/或N6烷基化或酰化衍生物)或生理可接受的鹽。本發明的化合物或具有抗HBV活性或被代謝為一種或多種顯示抗反轉錄病毒活性的化合物。
I.對映體純二氧戊環核苷的制備對映體純β-D-二氧戊環核苷可以按下面詳述的方式和按PCT/US91/09124中所述的方式制備。方法包括由1，6-脫氫甘露糖(一種包含所說對映體純最終產物所需的全部立體化學特征的糖，在此糖的“1”位上(在后來形成的核苷中4’位上)具有正確的非對映體構型)出發，第一步制備(2R，4R)-和(2R，4S)-4-乙酰氧-2-(被保護氧甲基)二氧戊環。
此(2R，4R)和(2R，4S)-4-乙酰氧-2-(被保護氧甲基)二氧戊環，在SnCl4、其他路易斯酸或三甲基硅烷基triflate存在下，于有機溶劑如二氯乙烷、乙腈或二氯甲烷中與所需的雜環堿縮合，生成立體化學純的二氧戊環核苷。
制備對映體純二氧戊環核苷時，應當小心避免會使二氧戊環環裂開的強酸性條件。可能的情況下，應當在堿性或中性條件下完成反應；必須在酸性條件下反應時，反應時間應減至最短。
二氧戊環嘌呤核苷時的外消旋混合物，可以按EPA 0382526所述制備。用已知方法(包括流經所用的手性HPLC柱)可以從外消旋混合物中分離出β-L對映體。
圖1和實施例1說明了制備活性化合物的方法。原料化合物1按PCT/US91/09124中所述制備(該申請中化合物8)。2，6-二取代的嘌呤衍生物利用乙酸酯1和硅烷化的6-氯-2-氟嘌呤縮合法合成，生成2和3的混合物(α/β＝1/1.3)。再將開始形成的N7-異構體在室溫下攪拌過夜轉化成N9-異構體。利用以CH2Cl2-丙酮(19∶1)作展開劑的制備薄層色譜(TLC)將α，β-混合物分離成單個異構體2和3的方法，得到了分析樣品。但是，為了制備最終產物10-15，在DME中用NH3處理2和3的混合物(Robins，M.J.，Vznanski，B.，在<Can.J.Chem.>1981，2608上的文章“核酸相關化合物34。用亞硝酸叔丁酯的非水重氮作用。在嘌呤核苷的C-2上引入氟、氯和溴”)，得到10-13的混合物，再將其分離成單個異構體4(24％)、5(18.6％)、6(25.8％)和7(16％)。該鳥嘌呤8和2，6-二氨基9衍生物分別用2-疏基乙醇-甲醇鈉和氨乙醇液處理4的方法制備。用四正丁基氟化銨處理相應的5′-硅烷化的核苷得到了高產率的游離核苷10-15。α-異構體12和13用與β-異構體相似的操作制備。
具體實施例方式
實施例1對映體純β-D-二氧戊環基嘌呤核苷的制備(2R，4R)和(2R，4S)-9-[[2-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧]甲基]-1，3-二氧戊環-4-基]-6-氯-2-氟嘌呤(2和3)。
2-氟-6-氯嘌呤(4.05克，23.47mmol)和硫酸銨(催化量)于940ml六甲基二硅氮烷中回流2小時。無水條件下濃縮形成的溶液，產生硅烷化的2-氟-6-氯嘌呤白色固體。向由硅烷化的2-氟-6-氯嘌呤(5.69克，23.69mmol)和化合物1(7.84克，19.57mmol)在無水二氯甲烷(175ml)中的冷卻(0℃)和攪拌的溶液中，加入TMSOTf(4.41ml，23.44mmol)。反應混合物溫熱至室溫攪拌16小時，在此期間內最初形成的N7縮合產物全部轉化成N9異構體。用飽和NaHCO3溶液使反應混合物驟冷，并于室溫下再攪拌20分鐘，然后減壓蒸干。殘渣溶于乙酸乙酯(200ml)中，用水和鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，蒸發得到固體殘渣，用硅膠柱色譜提純(20％乙酸乙酯的己烷液洗脫)得到β-異頭物8和α-異頭物9的混合物(β∶α＝1.3∶1)，為白色晶狀固體(6.30克，62.8％)。分析樣品用使用CH2Cl2-丙酮(19∶1)作展開劑的制備TLC法純化，得出經NMR測定為2(Rf＝0.50)和3(Rf＝0.55)的物質UV(甲醇)μmax269.0nm。
(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[[2-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧]甲基]-1，3-二氧戊環-4-基]-6-氯嘌呤(4)，(-)-(2R，4R)-9-[[2-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧]甲基]-1，3-二氧戊環-4-基]-2-氟腺嘌呤(5)，㈩-(2R，4S)氨基-9-[[2-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧]甲基]-1，3-二氧戊環-4-基]-6-氯-嘌呤(6)和((+)-(2R，4S)-9-[[2-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧]甲基]-1，3-二氧戊環-4-基]-2-氟腺嘌呤(7)。
在2和3(6.25克，12.18mmol)于DME(125ml)中攪拌下的溶液中通入干燥NH3氣過夜。減壓蒸發溶劑，殘余物在硅膠柱上色譜分離四種化合物(20-30％乙酸乙酯的CH2Cl2溶液洗脫)。4(Rf-0.35，1.49克，24％)是白色晶形固體，UV(甲醇)λmax 309.5nm，對(C25H28ClN5O3Si)作了C、H、Cl、N元素分析。5(Rf＝0.21，1.12克，18.6％)，是無色針狀物質，UV(甲醇)λmax 261.0，268.0(sh)nm，對(C25H28FN5O3Si)作了C、H、F、N元素分析。6(Rf＝0.43，1.60克，25.76％)，是白色晶狀固體，UV(甲醇)λmax 261.0，269.0(sh)nm，對(C25H28FN5O3Si)作了C、H、F、N元素分析。7(Rf＝0.12，0.96克，16％)是微晶固體，UV(甲醇)λmax 261.0，269.0(sh)nm，對(C25H28FN5O3Si)作了C、H、F、N元素分析。
(-)-(2R，4R)-2-氨基-6-氯-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]嘌呤(10)。
用1M四正丁基氟化銨-THF(1.1ml，1.1mmol)處理4(0.46克，0.91mmol)在THF(20ml)中的溶液，得到晶狀固體10(RF＝0.50，0.21克，84％)，該固體用甲醇重結晶UV(H2O)λmax 307.0(ε8370)(pH7)，307.5(ε8590)(pH2)，307.0(ε8800)(pH11)，對(C9H10ClN5O3)作了C、H、Cl、N元素分析。
(-)-(2R，4R)-2-氟-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]腺嘌呤(11)。
用1M四正丁基氟化銨-THF(1.35ml，1.35mmol)處理5(0.56克，1.12mmol)在THF(20ml)中的溶液，得出白色晶狀固體22(0.24克，85％)，該固體用甲醇重結晶UV(H2O)λmax260.8nm(ε17010)，268.5(sh)nm(ε13510)(pH7)，261.0(ε16390)，268.5(sh)(ε13300)(pH2)，260.8(ε16700)，268.5(sh)(ε13200)(pH11)。對(C9H10FN5O3)作了C、H、F、N元素分析。
(-)-(2R，4R)-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]鳥嘌呤(14)。
水4(0.29克，0.57mmol)、巰基乙醇(0.51ml)和1.0M甲醇鈉-甲醇(11.5ml)在甲醇(20ml)中的混合物回流3小時。反應混合物冷卻并用冰醋酸中和，溶液蒸干后用CHCl3研制殘余物。過濾后將濾液蒸干，得到粗產物8(0.21克，75％)此物質不經提純直接進行脫硅烷處理，得到微晶狀固體化合物3(0.07克，61％)，該固體用甲醇重結晶UV(H2O)λmax252.0nm(ε8730)(pH7)，254.4(ε12130)，277.5(sh)(ε8070)(pH2)，264.3(ε10800)(pH11)，對(C9H11N5O4)作了C、H、N元素分析。
(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]腺嘌呤(15)。
在鋼彈中加入化合物4(0.28克，0.55mmol)和用NH3飽和的無水乙醇(20ml)，在90℃加熱6小時。冷卻后，真空蒸除溶劑得到化合物9(0.26克，95％)，然后按制備12所述同樣操作脫硅烷，得到白色微針狀化合物15(0.10克，75％)，從甲醇中重結晶UV(H2O)λmax 279.0nm(ε8040)(pH7)，290.0(ε7070)(pH2)，278.8(ε7580)(pH11)，對(C9H12N6O3)作了C、H、N元素分析。
(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]嘌呤，可以用各種還原劑包括披鈀炭和氫氣或者三丁基氫化錫和偶氮雙異丁腈還原化合物10的方法制備。
II二氧戊環核苷的抗HBV活性可以用各種實驗技術測量β-D-二氧戊環核苷抑制HBV的能力。本文所用的評價所公開化合物抑制HBV復制的能力的方法，詳細載于Korba和Gerin在<Antiviral Res.>1955-70(1992)之中。僅僅為了說明而不是限制本發明，給出下列物質毒性和抗BV活性評價結果(-)-(2R，4R)-2-氨基-6-氯-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]嘌呤；(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]腺嘌呤；和(-)-(2R，4R)-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]鳥嘌呤。本文公開的其他化合物按相似的方式評價。
就細胞的兩個分開的傳代(每個傳代兩個培養物，共計四個培養物)完成了抗病毒評價。在所有試驗板的全部試孔中均同時同密度地接種。
由于在細胞內外HBV DNA諸水平的固有變化，與未處置細胞中這些HBV DNA型的平均水平相比，只有抑制作用大于3.0倍(對于HBV毒粒DNA)或2.5倍(對于HBV DNA復制中間體)的才認為滿足顯著性水準[P＜0.05](Korba和Gerin，<Antivira Res.>1955-70(1992)。使用了每一細胞DNA制劑中諸整合的HBV DNA水平(在這些實驗中其水平以每個細胞為基礎保持恒定)，計算細胞內的HBV DNA型的諸水平，借以消除印跡雜交分析(the blot hybridization assays)中固有的技術變化。
未處置細胞中細胞外HBV毒粒DNA的典型值，處于50-150pg/ml培養基(平均約76pg/ml)。在未處置細胞內HBV DNA復制中間產物為50-100pg/μg細胞DNA(平均值約74pg/μg細胞DNA)。一般來說，因用抗病毒化合物處置而產生的細胞內HBV DNA水平的抑制作用，與HBV毒粒DNA水平的抑制作用相比，較不顯著而且發生得較慢。
例如，在這些實驗中進行所說雜交分析的方法，得出大約1.0pg細胞內HBV DNA/μg細胞DNA相當于2-3基因組拷貝/細胞以及1.0pg細胞外HBV DNA/ml相當于3×55病毒顆粒/ml。
為了評定所觀察到的抗病毒作用是否緣于對細胞生活能力的一般作用，作了毒性分析，所用的方法基于中性紅染料的攝入，一種分析在各種病毒宿主體系、其中包括HSV(單純性皰疹病毒)和HIV中細胞生存能力的廣泛采用的標準方法。此方法的細節列表該毒性表的注中。
使用的試驗化合物呈在DMSO中的40mM貯存液態(于干冰上被冷凍的)。將試樣制成日分量并于-20℃下冷凍，以便使每單個劑量經受單一凍融循環。將該日試驗分量融化后，室溫下懸浮在培養基中后立即加到細胞培養物內。試驗了0.0和1μM所說化合物的抗病毒活性，并試驗了不高于300μM濃度下所說化合物的毒性。
在表中使用了下列縮寫符號ACPD(-)-(2R，4R)-2-氨基-6-氯-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]嘌呤；DAPD(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]腺嘌呤；和Dioxolane-G(-)-(2R，4R)-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]鳥嘌呤。
實施例2化合物的毒性評價了ACPD、DAPD和Dioxolane-G的對映體在2.2.15細胞培養物(用肝炎毒粒轉化的HepG2細胞)中抑制病毒生長的能力。如表1所說的那樣，對在抗病毒評價中所用濃度下的全部試驗化合物，均未觀察到顯著性毒性(在未處置的細胞中所觀察到的該染料攝入量的抑制作用高于50％的)。該試驗化合物在100μM下對2.2.15細胞無毒。但是這些化合物在300μM下有中等毒性，而且與ddC相比此濃度下三種化合物的毒性較小。
在96孔平底組織培養板中作了毒性分析。毒性分析用細胞經培養后，按抗病毒評價中所用的同樣方案用試驗化合物處理。每種試驗化合物試驗了四種濃度，每種濃度用三份培養液。利用中性紅染料的攝入確定了相對毒性水平。采用510mM下內部化染料的吸收(A510)作定量分析。諸數值以與試驗化合物一樣保持在同樣的96孔培養板中的未處理細胞之9個獨立培養物的平均A510值(±標準偏差)的百分數表示。在培養板40上所說9個對照培養物中染料攝入的百分數為100±3。在這些試驗中一般觀察到在150-190μM 2′，3′-ddC下染料的攝入(與未處置細胞中所觀察到的水平相比)減少二倍(Korba和Gerin，<Antiviral Res.>1955-70，1992)。
表1試驗化合物在2.2.15細胞中的毒性分析在所指出的藥物濃度下中性紅染料的攝入(相當對照的％)培養板化合物 1000μM300μM100μM30μM402′，3′-ddC5±1 44±1 97±2 101±1在所指出的藥物濃度下中性紅染料的攝入(相當對照的％)培養板化合物 300μM 100μM 30μM 10μM40ACPD 63±199±1101±198±240DAPD 49±388±199±3 99±140Dioxolane-G 56±388±3101±2100±3
實施例3抗乙型肝炎病毒活性如表2中所示，在激發期間內，HBV毒粒DNA和細胞內HBV復制中間產物(HBV RI)的水平與未處置的細胞內保持恒定(處于正常變化范圍內)。而陽性處理對照，2′，3′-二脫氧胞嘧啶(2′，3′-ddC)，誘導了在所用濃度下HBV DNA復制的顯著抑制作用。過去的研究表明，9-12μM 2′，3′-ddC在此試驗體系中通常觀察到HBV RI的90％抑制作用(相對于未處置細胞中的平均水平)，(參見Korba和Gerin，<Antiviral Res.>1955-70，1992)。
三種試驗化合物都是HBV復制的有效抑制劑，與用2′，3′-ddC處置后所觀察到的情況相比，對HBV毒粒DNA和HBV RI的抑制作用與之相當或比之更高。
表2各種核苷對在2.2.15細胞中生產HBV的影響
表2(續)各種核苷對在2.2.15細胞中生產HBV的影響
*在第9天處置后作了24小時細胞內HBV DNA分析。使用了每種細胞DNA制劑中的DNA計算游離基因3.2kB HBV基因組(單)和HBV DNA復制中間產物[RI]的水平。
**“Zero”(零)表示不能檢出的HBV DNA水平，靈敏度下限為0.1pg(m)。
IV.藥物組合物的制備本文公開的化合物及其藥物可接受的鹽、前藥和衍生物，可以用于預防和治療HBV感染和其他有關癥狀，如抗HBV抗體陽性和HBV陽性癥狀、由HBV引起的慢性肝炎、肝硬變、急性肝炎、暴發性肝炎、慢性持久性肝炎和疲勞。這些化合物或制劑也可以預防性地用于阻止或延遲抗HBV抗體陽性或HBV抗原陽性或接觸過HBV的個體臨床疾病的蔓延。
患有任何種這樣癥狀的人，可以通過給病人施用有效量的下列選擇性處于藥物可接受載體或稀釋劑中的下列物質的方法加以治療(-)-(2R，4R)-2-氨基-6-氯-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]嘌呤、(-)-(2R，4R)-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基)鳥嘌呤、(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]腺嘌呤或(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環-4-基]嘌呤或其藥物可接受的衍生物或鹽。這些活性物質可以通過任何適當途徑給藥，如口服、非腸道、靜脈內、真皮內、皮下或局部以液體或固體形式給藥。
將此活性物質包括在藥物可接受的載體或稀釋劑中，其量應足夠向病人輸送治療有效量的活性物質而不會在被治療的病人中產生嚴重的毒性作用。
治療上述疾病所需活性化合物的優選劑量，約為1-60(優選1-20)mg/kg受試者體重/天，更一般地講約為0.1-100mg/kg受試者體重/天。所說的藥物可接受衍生物的有效劑量范圍，可以根據應供給母體核苷的重量計算出來。若該衍生物本身具有活性，則可以用該衍生物重量按上述方式估計，或者用本領域技術人員公知的其他方式估計有效劑量。
所說的化合物便于以任何適當的劑型單位給藥，該單位劑型包括(但不限于)含7-3000(優選70-1400)mg活性成分/單位劑型的那些。50-1000mg的口服劑量便于使用。
理想的是，該活性成分應當施用到這樣一種程度，即，使得該活性化合物在血漿中的峰濃度達到約0.2-70(優選約1.0-10)μM。可以達到此目的方法，例如靜脈注射0.1-5％活性成分(選擇性地于生理鹽水中)的溶液或以活性成分大丸劑給藥。
活性化合物在藥物組合物中的濃度，取決于該藥物的吸收、失活和分泌速度以及本領域技術人員公知的其他諸因素。應當注意，劑量的大小也會隨欲處置病癥的嚴重程度而變化。此外，還應當知道，對于具體病人來說，具體的劑量制度應當隨時根據個體病人的需要和給藥或監督給藥人的職業判斷加以調整，而以，本文所述的濃度范圍僅僅是為了舉例說明，而不在于限制所要求組合物的范圍和實施。活性成分可以一次給藥，也可以將其分成一些較小的劑量按變化的時間間隔給藥。
活性化合物的優選給藥方式是口服。口服組合物一般包含惰性稀釋劑或可食用的載體。組合物可以包封在明膠膠囊中或壓成片劑。為了口服治療，可以將活性化合物與賦形劑混合后制成片劑、錠劑或膠囊使用。藥物可配伍的粘合劑和/或佐劑也可以作為組合物的部分成分被包含在其中。
所說的片劑、丸、膠囊和錠劑等等，可以含任何下列成分或具有類似性質的化合物粘合劑(如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠)；賦形劑(如淀粉或乳糖)、崩解劑(如藻酸、Primogel或玉米淀粉)；潤滑劑(如硬脂酸鎂或Sterotes)；助流劑(如膠體二氧化硅)；甜味劑(如蔗糖或糖精)或調味劑(如薄荷、水楊酸甲酯或橙香精)。單位劑型為膠囊時，除了上述類型的物質之外，還可以含如脂肪油等液體載體。此外，單位劑型還可以含有改變劑量單位之物理形狀的其他物質，如糖衣、蟲膠或其他腸內吸收劑。
所說的活性化合物或其藥物可接受的衍生物或鹽，可以作為酏劑、懸浮劑、糖漿、糯米紙囊劑、口香糖劑等的成分給藥。糖漿除含活性化合物之外可以含有作為甜味劑的蔗糖以及含有防腐劑、染料、著色劑和香料。
所說的活性化合物或其藥物可接受的衍生物或鹽，也可以與不損害其所需作用的其他活性物質，或者與補充所需作用的物質混合，例如與抗生素、殺真菌劑、抗炎劑或其他抗病毒劑(包括HBV、抗巨細胞病毒或抗HBV劑)混合。
非腸道、真皮內、皮下或局部施藥所用的溶液或懸浮液，可以包含下列成分無菌稀釋劑(如注射用水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑)；抗菌劑(如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯)；抗氧劑(如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)；螯合劑(如乙二胺四乙酸)，緩沖劑(如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽)和調節張力用的試劑(如氯化鈉或右旋糖)。非腸道制劑可以封入安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制的多劑小瓶中。
若靜脈給藥，優選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)。
在一種優選方案中，將活性化合物與保護該化合物使之不會從體內迅速消失的載體一起制成制劑，如控釋制劑，其中包括植入物和微膠囊化的給藥體系。可以使用可生物降解和生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這些制劑的制法對本領域技術人員來說是顯而易見的。這些材料可以在市場上買到由Alza公司和Nova藥物有限公司生產的產品。
脂質體懸浮液(包括以被對病毒抗原的單克隆抗體侵染細胞為靶向的脂質體)也是優選的藥物可接受的載體。它們可以按本領域技術人員已知的方法，例如US-4522811中所述的方法(通過參照將其內容并入本文)制備。例如，脂質體制劑可按下述制備將適當脂(類)(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰膽堿、二十烷酰磷脂酰膽堿和膽甾醇)溶解在無機溶劑中后蒸發，在容器表面上留下干燥的脂的薄膜。然后將活性化合物或其單磷酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液注入此容器中。接首用手回旋此容器，使脂物質自該容器側壁上游離下來，分散此脂的聚集物制成脂質體懸浮液。
V.β-D-二氧戊環核苷磷酸鹽衍生物的制備β-D-二氧戊環核苷的單、二和磷酸鹽衍生物可按以下所述制備所說的單磷酸鹽可以按Imai等人在<J.Org.Chem.>34(6)，1547-1550(1969.6)上所述的操作方法制備。例如于0℃溫度下使大約100mgβ-D-二氧戊環核苷和大約280μl磷酰氯在大約8ml無水乙酸乙酯中攪拌下反應約4小時，用冰熄滅反應后，水相在活性炭柱上純化，用5％氫氧化銨在乙醇和水的1∶1混合物中的溶液洗脫。蒸發洗脫液得到(β-D-二氧戊環核苷)-5′-單磷酸銨。
二磷酸鹽可以按Davisson等人于<J.Org.Chem.>52(9)，1794-1801(1987)上的操作制備。β-D-二氧戊環核苷可以由相應的甲苯磺酸鹽制備，即例如通過使所說核苷和甲苯磺酰氯于吡啶中室溫下反應約24小時，并按通常方式處理產物(如洗滌、干燥和使之結晶)的方法制備。
三磷酸鹽可以按Hoard等人于<J.Am.Chem.Soc.>87(8)，1785-1788(1965)上所述的操作制備。例如按本領域技術人員已知的方法制備N-咪唑酰胺，并在DMF中用三丁基焦磷酸銨處理，用這種方法使β-D-二氧戊環核苷活化。此反應主要生成核苷的三磷酸鹽，其中含一些未反應的單和二磷酸鹽。用DEAE柱作陽離子交換色譜純化后，例如以四鈉鹽形式分離出該三磷酸鹽。
本發明參照其優選方案作了說明。由上述詳細說明本發明，本領域中技術人員顯然知道本發明即各種對映體純的β-D-二氧戊環核苷的變化和改進。因此全部這些變化和改進都應當被包括在權利要求書的范圍之內。
權利要求
1.治療有效量的式(I)所示的β-D-二氧戊環基核苷或其藥物上可接受的鹽，和藥物上可接受的載體在制造用于治療人或其它宿主動物的HBV感染的藥物組合物中的用途， 其中R選自OH、NH2、H或Cl，和X選自氫、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、3-甲基丁酰基、丁二酸單酯基、3-氯苯甲酸基、苯甲酰基、新戊酰基、甲磺酸酯基、戊酰基、己酰基、辛酰基、癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕櫚酰基、硬脂酰基、一磷酸酯基、二磷酸酯基和三磷酸酯基。
2.權利要求1的用途，其中R是NH2。
3.權利要求1的用途，其中R是OH。
4.權利要求1的用途，其中R是Cl。
5.權利要求1的用途，其中R是H。
6.權利要求1的用途，其中X是H。
7.權利要求1-6中任何一項的用途，其中所述載體是適合口服給藥的。
8.權利要求1-6中任何一項的用途，其中所述載體是片劑的形式。
9.權利要求1-6中任何一項的用途，其中所述載體是膠囊的形式。
10.權利要求1-6中任何一項的用途，其中所述載體是適合于非腸道給藥的。
11.權利要求1的用途，其中核苷的至少95％不含相應的β-L-對映體。
12.權利要求11的用途，其中R是NH2。
13.權利要求11的用途，其中R是OH。
14.權利要求11的用途，其中R是Cl。
15.權利要求11的用途，其中R是H。
16.權利要求11-15中任何一項的用途，其中X是H。
17.權利要求11-15中任何一項的用途，其中所述載體是適合口服給藥的。
18.權利要求11-15中任何一項的用途，其中所述載體是片劑的形式。
19.權利要求11-15中任何一項的用途，其中所述載體是膠囊的形式。
20.權利要求11-15中任何一項的用途，其中所述載體是適合于非腸道給藥的。
全文摘要
本發明涉及治療有效量的下式(I)所示的β－D－二氧戊環基核苷或其藥物上可接受的鹽，和藥物上可接受的載體在制造用于治療人或其它宿主動物的HBV感染的藥物組合物中的用途，式(I)中的R是OH、Cl、NH
文檔編號C07D411/04GK1679612SQ20051000803
公開日2005年10月12日 申請日期1993年10月28日 優先權日1992年10月28日
發明者R·F·辛納齊 申請人:埃莫里大學