脂質、脂質復合物及其應用的制作方法

專利名稱：脂質、脂質復合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及陽離子脂質、包含其的組合物及其應用以及將化學化合物轉移到細胞中的方法。
分子生物學和分子醫學在很大程度上依賴于生物活性化合物向細胞內的引入。這些生物活性化合物典型地分別包括，特別是，DNA、RNA以及肽和蛋白質。典型地，要克服的屏障是脂雙層，其具有帶負電荷的外表面。在本領域，已經開發了許多技術來滲透細胞膜并且由此將生物活性化合物引入。然而，構思用于實驗室的一些方法不能用在醫學領域并且更特別地，不適合于藥物遞送。例如，本領域已知的電穿孔和沖擊法，如果應用的話，僅容許生物活性化合物的局部遞送。除此之外，所述脂雙層細胞膜還包括運送系統。因此，嘗試使用這種運送系統來將生物活性化合物遞送通過細胞膜。然而，由于這種遞送系統的特異性或交叉反應性，它們的應用通常不是可應用的方法。
本領域描述的將生物活性化合物轉移到細胞中的更通用的方法是使用病毒載體。然而，病毒載體僅能用于將基因有效地轉移到一些細胞類型中；但是它們不能用于將化學上合成的分子引入細胞。
一種備選的方法是使用所謂的脂質體(Bangham，J.Mol.Biol.13，238-252)。脂質體是在兩親性脂質在水中締合后產生的小泡。脂質體典型地包括磷脂的同心排列的雙分子層。取決于層數，可將脂質體分類為小的單層脂質體、多層脂質體和大的多層脂質體。已經證明脂質體是有效的遞送試劑，因為它們容許親水性化合物結合到水性中間層中，而將疏水性化合物結合到脂質層中。本領域眾所周知的是，脂質制劑的組合物以及制備它們的方法對于得到的脂質聚集體的結構和大小具有影響，并且因此影響脂質體。還已知脂質體結合陽離子脂質。
除了作為脂質體的成分之外，陽離子脂質還引起了相當多的關注，因為它們可以象這樣用于生物聚合體的細胞遞送。使用陽離子脂質，由于靜電相互作用，可以將任何陰離子化合物基本上以定量方式進行包封。此外，認為陽離子脂質與帶負電荷的細胞膜相互作用，啟動細胞膜轉運。已經發現，如此與生物活性化合物一起使用含有陽離子脂質的脂質體制劑或使用陽離子脂質需要探索式方法，每種制劑應用有限，因為通常在缺乏血清的情況下，其典型地可以將質粒遞送到一些但是不是所有的細胞類型中。
已經證實脂質和由它們轉運的生物活性化合物的電荷和/或質量比率是遞送不同類型的所述生物活性化合物的極其重要的因素。例如，已經顯示適合于包括5,000到10,000個堿基大小的質粒遞送的脂質制劑，通常對于遞送寡核苷酸諸如典型地包括約10到約50個堿基的合成的核酶或反義分子是無效的。此外，最近已經顯示指出反義寡核苷酸和核酶的優選遞送條件甚至在相同的細胞類型中也是不同的。
美國專利6,395,713公開了基于陽離子脂質的組合物和將這些組合物用于將生物活性化合物轉移到細胞中的應用，所述組合物由親脂性基團、接頭和頭部基團組成。
本發明待解決的問題是提供將生物活性化合物引入細胞，優選地動物細胞的方式。本發明待解決的另一個問題是提供核酸的遞送試劑，特別是小核酸諸如siRNA，siNA和RNAi或適體和spiegelmers。
這些問題通過后附的獨立權利要求的主題得以解決。優選的實施方案可以從其后附的附屬權利要求獲得。
在第一個方面，本發明待解決的問題通過按照式(I)的化合物得以解決， 其中R1和R2各自并且獨立地選自包含烷基的組；n是介于1和4之間的任何整數；R3是選自包含賴氨酰、鳥氨酰、2，4-二氨基丁酰、組氨酰的組的酰基和按照式(II)的酰基部分，
其中m是1-3之間的任何整數且Y-是藥用陰離子。
在一個實施方案中，R1和R2各自并且獨立地選自包括十二烷基、十四烷基、十六烷基和油基的組。
在一個實施方案中，R1是十二烷基且R2是十四烷基；或R1是十六烷基，且R2是油基。
在一個實施方案中，m是1或2。
在一個實施方案中，所述化合物是陽離子脂質，優選地與陰離子Y-締合(association)。
在一個實施方案中，Y-選自包括鹵化物、乙酸鹽(酯)和三氟乙酸鹽(酯)的組。
在一個實施方案中，所述化合物選自包括下列各項的組-β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物 -β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十二烷基-N-十四烷基-酰胺三鹽酸化物
和-ε-精氨酰-賴氨酸-N-十二烷基-N-十四烷基-酰胺三鹽酸化物 在第二個方面，本發明待解決的問題通過包括作為脂質成分的按照第一個方面的化合物和載體的組合物得以解決。
在一個實施方案中，所述組合物包括另一種組分。
在第三個方面，本發明待解決的問題通過藥物組合物得以解決，所述藥物組合物包括按照第一個方面的化合物和藥物活性化合物和優選地藥用載體。
在第二個和第三個方面的一個實施方案中，藥物活性化合物和/或另一種組分選自包括下列各項的組肽、蛋白質、寡核苷酸、多核苷酸和核酸。
在第二和第三個方面的實施方案中，所述蛋白質是抗體，優選地是單克隆抗體。
在第二和第三個方面的實施方案中，所述核酸選自包括DNA，RNA，PNA和LNA的組。
在第二和第三個方面的實施方案中，所述核酸是功能性核酸，其中優選地，所述功能性核酸選自包括下列各項的組RNAi，siRNA，siNA，反義核酸，核酶，適體和spiegelmers。
在第二和第三個方面的實施方案中，所述組合物還包括至少一種輔助脂質組分，其中優選地所述輔助脂質組分選自包括磷脂和類固醇的組。
在第二個和第三個方面的優選實施方案中，所述輔助脂質組分選自包括下列各項的組1，2-二植烷酰(diphytanoyl)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和1，2-二油基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。
在第二個和第三個方面的實施方案中，輔助脂質成分的含量從所述組合物的總脂質含量的約20mol％到約80mol％。
在第二個和第三個方面的優選實施方案中，所述輔助脂質成分的含量從約35mol％到約65mol％。
在第二個和第三個方面的實施方案中，所述脂質是β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，所述輔助脂質是1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。
在第二和第三個方面的優選實施方案中，所述脂質是所述組合物的總脂質含量的50mol％，所述輔助脂質是所述組合物的總脂質含量的50mol％。
在第二和第三個方面的實施方案中，所述組合物包含至少兩種輔助脂質。
在第二和第三個方面的優選實施方案中，至少一種輔助脂質包括選自包括下列各項的組的部分PEG部分、HEG部分、聚羥基乙基淀粉(polyHES)部分和聚丙烯部分，其中這樣的部分優選地提供約500-10000Da的分子量，更優選地約2000-5000Da的分子量。
在第二和第三個方面的優選實施方案中，包括PEG部分的輔助脂質選自包括下列各項的組1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，1，2-二烷基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺；和神經酰胺-PEG。
在第二和第三個方面的更優選實施方案中，所述PEG部分具有約500Da到10000Da的分子量，優選地約2,000到5,000Da的分子量，更優選地2,000Da的分子量。
在第二個和第三個方面的更優選實施方案中，所述組合物包括作為脂質組分的β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，作為第一輔助脂質的1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和作為第二輔助脂質的1，2-二硬脂酰(disteroyl)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG2000。
在第二和第三個方面的更優選實施方案中，所述第二輔助脂質的含量是約0,05mol％到4,9mol％，優選地約1到3mol％。
在第二和第三方面的更優選的實施方案中，脂質的含量是45mol％到50mol％，第一輔助脂質的含量是45到50mol％，并且在存在PEG化的第二輔助脂質的情況下，所述第二輔助脂質的含量是約0,1mol％到約5mol％，優選地約1-4mol％，且更優選地約2％，其中所述脂質、所述脂質、所述第一輔助脂質和所述第二輔助脂質的含量的總和是100mol％，并且其中所述第一輔助脂質和所述第二輔助脂質的總和是50mol％。
在第二和第三個方面的優選實施方案中，所述組合物包含下列a)50mol％的β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，48mol％的1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺；和2mol％1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG2000.
或b)50mol％的β-L-精氨酰-2，3-L-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，49mol％1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺；和1mol％N(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，優選其鈉鹽。
在第二和第三個方面的優選實施方案中，功能性核酸是雙鏈核糖核酸，其中所述組合物還包括核酸，優選地功能性核酸，其更優選地是雙鏈核糖核酸，并且最優選地是選自包括下列各項的組的核酸RNAi、siRNA、siNA、反義核酸和核酶，其中優選地RNAi與陽離子脂質的摩爾比率是約0-0.075，優選地約0.02-0.05并且甚至更優選地0.037。
在第二和第三個方面的優選實施方案中，所述化合物和/或輔助脂質組分作為在水性介質中的分散體存在。
在第二和第三個方面的優選實施方案中，所述化合物和/或輔助脂質組分作為在水混溶性溶劑中的溶液存在，其中優選地所述溶劑選自包括乙醇和叔丁醇的組。
在第二和第三個方面的優選實施方案中，所述功能性核酸是雙鏈核糖核酸，優選地選自包括RNAi、siRNA、siNA、反義核酸和核酶的組的核酸，并且其中優選地RNAi與陽離子脂質的摩爾比率是從約0-0.075，優選地從約0.02-0.05，并且甚至更優選地0.037。
在第二和第三個方面的優選實施方案中，所述組合物包含核酸，其中核酸主鏈磷酸酯與陽離子脂質氮原子的電荷比率是約從1∶1,5-7，優選地1∶4。
在第二和第三個方面的優選實施方案中，在分散體中的所述顆粒的大小是約120nm。
在第二和第三個方面的優選實施方案中，所述分散體是包含1到100μM siRNA的貯存分散體，其中優選地所述貯存分散體在體內或體外稀釋1∶100到1∶10000，更優選地1∶1000。
在第四個方面，本發明待解決的問題通過將按照第一個方面的化合物或按照第二個或第三個方面的組合物用于制備藥物而得以解決，所述藥物優選地用于治療癌癥和/或心血管相關的疾病。
在第四個方面的實施方案中，所述藥物用于治療癌癥，其中優選地所述癌癥選自包括實體和非實體腫瘤的組，并且其中更優選地所述實體瘤選自包括下列各項的組胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌和肝細胞癌。
在第四個方面的實施方案中，所述癌癥涉及選自包括血管發生和新血管發生的組的過程。
在第四個方面的實施方案中，所述藥物用于將核酸施用到細胞中，所述細胞選自包括下列各項的組內皮細胞、上皮細胞和腫瘤細胞，優選地所述細胞是內皮細胞。
在第四個方面的實施方案中，所述內皮細胞是血管系統的內皮細胞。
在第四個方面的實施方案中，所述血管系統是來自新血管發生、優選地腫瘤相關的新血管發生的血管系統。
在第四個方面的實施方案中，血管系統選自包括下列各項的組肝血管系統、心臟血管系統、腎臟血管系統、胰腺血管系統和肺血管系統。
在第四個方面的實施方案中，所述藥物用于系統施用。
在第四個方面的實施方案中，所述藥物用于局部施用。
在第四個方面的實施方案中，所述藥物用于治療心血管相關疾病，其中所述心血管疾病選自包括下列各項的組冠心病、心臟衰竭、高血壓、血栓形成、心肌梗塞、缺血性心臟病諸如心絞痛和動脈窄狹(arteriosklerosis)。
在第四個方面的實施方案中，所述藥物用于治療血管發生相關疾病。優選地，這種血管發生與下列器官和疾病相關，其中認為血管發生是導致這樣的疾病的主要原因，并且因此容許使用按照本發明的組合物(CarmelietP.，Nature Medicine 9，653-660(2003))。
血管 血管畸形，迪喬治綜合征，HHT，海綿狀血管瘤，動脈硬化(artherosclerosis)，移植性小動脈病，高血壓，糖尿病，再狹窄脂肪組織 肥胖癥皮膚 銀屑病，肉贅，變應性皮炎，瘢痕疙瘩，膿性肉芽腫，發庖性疾病，在AIDS患者中的卡波西肉瘤，禿頭，皮膚紫癜，毛細管擴張，靜脈湖形成眼睛 持續增生性玻璃體綜合征，糖尿病性視網膜病，早產兒視網膜病，脈絡膜新血管形成肺 原發性肺高血壓，哮喘，鼻息肉，新生兒呼吸窘迫，肺纖維化，肺氣腫腸 炎性腸和牙周病，腹水，腹膜粘連生殖系統 子宮內膜異位，子宮出血，卵巢囊腫，卵巢超刺激，先兆子癇骨，關節 關節炎，滑膜炎，骨髓炎，骨贅形成，骨質疏松，受損的骨折愈合神經系統 阿爾茨海默病，肌萎縮性側索硬化，糖尿病性神經病，中風胃腸道 胃或口腔潰瘍，局限性回腸炎腎 腎病在第五個方面，本發明待解決的問題通過將按照第一個方面的化合物和/或按照第二和/或第三個方面的組合物用于制備診斷試劑的應用得以解決。
在第六個方面，本發明待解決的問題通過將按照第一個方面的化合物或按照第二和/或第三個方面的組合物作為轉移試劑的應用而得以解決。
在第六個方面的實施方案中，所述轉移試劑將藥物活性成分和/或另一種成分轉移到細胞中，優選地哺乳動物細胞和更優選地人細胞中。
在第六個方面的實施方案中，所述細胞是內皮細胞，優選地血管相關的內皮細胞。
在第七個方面，本發明待解決的問題通過將藥物活性化合物和/或另一種成分轉移到細胞中或穿過膜，優選地細胞膜的方法而得以解決，所述方法包括下列步驟-提供細胞或膜；-提供按照第一個方面的任一的化合物；-提供藥物活性化合物和/或另一種成分；和-使細胞或膜與藥物活性化合物和/或另一種組分，以及按照第一個方面的化合物接觸。
在第八個方面，本發明待解決的問題通過將藥物活性化合物和/或另一種組分轉移到細胞中或穿過膜，優選地細胞膜的方法而得以解決，所述方法提供下列步驟-提供細胞或膜；-提供按照第二或第三個方面的組合物；和-使細胞或膜與按照第二或第三個方面的組合物接觸。
在第七或第八個方面的實施方案中，所述藥物活性化合物包括作為另外的步驟的-在細胞中和/或越過(beyond)膜檢測藥物活性化合物和/或另一種組分。
在第九個方面中，本發明待解決的問題通過合成N-十六烷基-油胺的方法而得以解決，所述方法包括下列步驟-提供油酸；-提供十六烷基胺；-使油酸和十六烷基胺反應以形成N-十六烷基-油酰酰胺；和-將N-十六烷基-油酰酰胺還原成N-十六烷基-油胺，其中所述油酸是至少90％，更優選地95％和最優選地99％純的，其中所述百分比是油酸和不同于油酸的任何脂肪酸的摩爾比率。
在第九個方面的實施方案中，所述油酸和十六烷基胺在室溫反應。
在第九個方面的實施方案中，所述油酸在將其與十六烷基胺反應之前進行預處理，其中所述預處理包括將油酸與氯甲酸乙酯，優選地在無水二氯甲烷或無水四氫呋喃中進行反應。
在第九個方面的實施方案中，所述反應在0℃，優選地在惰性氣體下進行反應。
在第九個方面的實施方案中，所述反應物還與酸清除劑反應，其中所述酸清除劑優選地選自包括三乙胺、二異丙基乙胺和吡啶的組。
在第九個方面的實施方案中，氯甲酸乙酯、油酸、三乙胺和十六烷基胺的摩爾比率是約1-1.05∶1∶1∶1-3∶1-1.10。
在第九個方面的實施方案中，使用LiAlH4來進行N-十六烷基-油酰酰胺向N-十六烷基-油胺的還原。
在第九個方面的實施方案中，在油酸與十六烷基胺反應后，洗滌所述反應物，并將其進行沉淀，將由此獲得的沉淀物任選地進行再結晶。
在第十個方面中，本發明待解決的問題通過將按照第一個方面的化合物或按照第二或第三個方面的組合物用于系統給藥，優選地向脊椎動物的系統給藥的應用而得以解決。
在第十個方面的實施方案中，所述脊椎動物是哺乳動物，更優選地選自包括下列各項的組的哺乳動物小鼠、大鼠、豚鼠、貓、狗、猴和人。
如

圖1所述，按照本發明的化合物可以被視為包括由R1-N-R2部分形成的親脂性基團、由C(O)-CH(NH3+)(CH2)n-NH部分形成的接頭基團和由R3部分形成的頭部基團。本發明人出人意料地發現在接頭基團顯示正電荷的這種化合物特別適合于將生物活性化合物轉移到細胞膜上并且優選地轉移到細胞中，更優選地動物細胞中。此外，本發明人已經令人驚奇地發現由按照本發明的化合物介導的轉移將是特別有效的，如果所述生物活性化合物是核酸、更優選地是siRNA和siNA的話。
優選地用于本文時，術語烷基指包含8-20個碳原子，優選地12-18個碳原子的飽和脂族原子團，或包含8-30個碳原子、分別包含至少一個雙鍵和三鍵的單或多不飽和脂族烴原子團。因此，在優選的實施方案中，術語烷基還包括烯烴基和炔烴基。烷基指支鏈和非支鏈，即非線性或直鏈烷基基團。優選的直鏈烷基基團包含8-30個碳原子。更優選的直鏈烷基基團包含12-18個碳原子。優先的支鏈烷基基團包含8-30個碳原子，其中8-30個碳原子的數目指形成這樣的支鏈烷基基團的主鏈的碳原子的數目。支鏈烷基基團的主鏈包含至少一個烷基基團作為主鏈的分支，其中所述烷基基團如本文所定義，更優選地，所述烷基基團包含短鏈烷基基團，更優選地包含1-6個，更優選的1-3個和最優選的1個碳原子。更優選的是在主鏈中包含12-18個碳原子的支鏈烷基基團，其中支鏈烷基基團如前述定義。特別優選的烷基基團是植烷基基團。
在備選的實施方案中，烷基是如上定義的不飽和的支鏈或非支鏈烷基基團。更優選地，這種不飽和的非脂族烴原子團包含1，2或3或4個雙鍵，其中具有一個雙鍵的原子團是特別優選的。最優選的是C181δ9的油基，即具有18個碳原子的脂族烴原子團，其中在位置9，存在順式構型的雙鍵，而不是連接9位置碳原子到10位置碳原子的單鍵。
用于本文時，n是1-4之間的整數，這意味著n可以是1，2，3和4。用于本文時，m是介于1-3之間的任何整數，這意味著m可以是1，2，和3。
要理解的是，按照本發明的化合物優選地是陽離子脂質。更優選地，存在于按照本發明的化合物中的NH或NH2基團的任一個以質子化的形式存在。典型地，按照本發明的化合物的任何正電荷通過陰離子的存在進行抵消。這種陰離子可以是單價或多價陰離子。優選的陰離子是鹵化物，乙酸鹽和三氟乙酸鹽。用于本文的鹵化物優選地是氟化物、氯化物、碘化物和溴化物。最優選的是氯化物。在陽離子脂質和待轉移到細胞中的生物活性化合物締合后，所述鹵化物陰離子被生物活性化合物所取代，所述生物活性化合物優選地顯示一個或多個負電荷，盡管必需承認生物活性化合物的總電荷不一定是負的。
要承認的是，按照式(I)的任何化合物包括至少兩個不對稱碳原子。在本發明中的是，本文公開的這種化合物的任何可能的對映異構體，即特別是R-R；S-S；R-S和S-R對映異構體。
按照本發明的化合物可以形成組合物或組合物的部分，其中這種組合物包括載體。在這種也被稱為脂質組合物的這種組合物中，按照本發明的化合物也被稱為脂質成分。這種載體優選地是液體載體。優選的液體載體是水性載體和非水性載體。優選的水性載體是水，水性緩沖系統，更優選地是具有生理緩沖強度和生理鹽濃度的緩沖系統。優選的非水性載體是溶劑，優選地是有機溶劑諸如乙醇、叔丁醇。不希望被任何理論所束縛，原則上可以使用任何水混溶性有機溶劑。要承認的是，所述組合物，更具體地脂質組合物可以因此作為脂質體存在或形成脂質體。
按照本發明的組合物可以包括一種或多種輔助脂質，其在本文也被稱為輔助脂質成分。所述輔助脂質成分優選地選自包括磷脂和類固醇的組。磷脂優選地是磷酸的二酯和單酯。磷脂的優選的成員是磷酸甘油酯和鞘脂類。用于本文時，類固醇是基于部分氫化環戊[a]菲的天然存在和合成的化合物。優選地，類固醇包含21-30個碳原子。特別優選的類固醇是膽固醇。
特別優選的輔助脂質是1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)和1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
按照本發明的特別優選的組合物包括β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物[#6]，β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十二烷基-N-十四烷基-酰胺三鹽酸化物[#11]或ε-精氨酰-賴氨酸-N-十二烷基-N-十四烷基-酰胺三鹽酸化物[#15]以及DphyPE，其中DphyPE的含量優選地是80mol％，65mol％，50mol％和35mol％，其中術語mol％指所述組合物的總脂質含量的百分比，即所述組合物的脂質含量包括按照本發明的陽離子脂質和任何另外的脂質，包括，但不限于，任何輔助脂質。
在本發明中的是，按照本發明的組合物優選地包括按照本發明的化合物和/或本文公開的一種或多種輔助脂質，其中按照本發明的化合物的任一，即所述陽離子脂質和/或輔助脂質成分作為在水性介質中的分散體存在。備選地，按照本發明的化合物，即陽離子脂質和/或輔助脂質成分作為在水混溶性溶劑中的溶液存在。作為水性介質，優選地使用本文公開的水性載體的任一種。優選的水混溶性溶劑是以任何比率與水形成均相的任何溶劑。優選的溶劑是乙醇和叔丁醇。要承認的是，所述組合物，更特別地所述脂質組合物可以因此作為脂質體存在或形成脂質體。
要承認的是在其各種實施方案中的按照本發明的組合物還可以用作藥物組合物。在后一種情形中，所述藥物組合物包括藥物活性化合物和任選地藥用載體。這種藥用載體可以，優選地選自與按照本發明的組合物相關的，如上定義的載體的組。本領域技術人員將理解的是，如本文所述的任何組合物，原則上，也被用作藥物組合物，假定其成分和其任何組合是藥用的。藥物組合物包括藥物活性化合物。這種藥物活性化合物可以是與按照本發明的組合物的另一種成分相同的，其優選地是任何生物活性化合物，更優選地是本文公開的任何生物活性化合物。另一種成分，藥物活性化合物和/或生物活性化合物優選地選自包括下列的組肽、蛋白質、寡核苷酸、多核苷酸和核酸。
優選地，任何這種生物活性化合物是帶負電荷的分子。盡管本發明人不希望被任何理論所束縛，術語帶負電荷的分子意為包括具有至少一個帶負電荷的基團的分子，所述帶負電荷的基團可以與按照本發明的陽離子脂質的帶正電荷的基團離子配對。原則上，在接頭部分的正電荷還可以對象這樣的脂質或在陽離子脂質和帶負電荷的分子，即生物活性化合物之間形成的任何復合物的總體結構具有某種影響。除此之外，與在美國專利6,395,713中公開的陽離子脂質比較，被引入的按照本發明的脂質的另外的正電荷應該促進這種脂質的增加的毒性，如由Xu Y，Szoka FC Jr.；Biochemistry；1996 May 07，35(18)5616-23所教導的。與本領域技術人員從這種現有技術的文獻中所預期的相反，按照本發明的化合物特別適合于本文公開的各種目的，并且特別地沒有任何增加的毒性。
優選地用于本文的肽是任何聚合物，所述聚合物由優選地通過肽鍵彼此共價連接的至少兩個氨基酸組成。更優選地，肽由2-10個氨基酸組成。肽的特別優選的實施方案是寡肽，其更優選地包括約10-約100個氨基酸。優選地用于本文的蛋白質是這樣的聚合物，所述聚合物由彼此共價連接的多個氨基酸組成。優選地，這種蛋白質包括約至少100個氨基酸或氨基酸殘基。
可以與陽離子脂質和按照本發明的組合物結合使用的優選蛋白質是任何抗體，優選地任何單克隆抗體。
特別優選的生物活性化合物，即藥物活性化合物和與按照本發明的化合物結合使用的這種另外的組分是核酸。這些核酸可以是DNA，RNA，PNA或其任何混合物的任一。更優選地，所述核酸是功能性核酸。優選地用于本文的功能性核酸是這樣的核酸，所述核酸不是分別編碼肽和蛋白質的核酸。優選的功能性核酸是本領域公知的siRNA，siNA，RNAi，反義-核酸，核酶，適體和spiegelmers。
siRNA是小的干擾RNA，如例如描述于國際專利申請PCT/EP03/08666。這些分子典型地由雙鏈RNA結構組成，其包括15-25個，優選地18-23個核苷酸對，所述核苷酸對彼此堿基配對，即彼此是基本上互補的，其典型地由Watson-Crick堿基配對所介導。該雙鏈RNA分子的一條鏈基本上與靶核酸，優選地mRNA互補，其中所述雙鏈RNA分子的第二條鏈基本上與所述靶核酸的一段序列相同。所述siRNA分子可以分別在每一側和每一段序列的兩側具有許多另外的寡核苷酸，然而，所述寡核苷酸不一定必須彼此堿基配對。
RNAi基本上與siRNA的設計相同，然而，與siRNA相比，該分子顯著更長。RNAi分子典型地分別包括50或更多的核苷酸和堿基對。
基于與siRNA和RNAi相同的作用模式具有活性的另一類功能性核酸是siNA。SiNA例如，描述于國際專利申請PCT/EP03/074654。更具體地，siNA對應于siRNA，其中所述siNA分子不包括任何核糖核苷酸。
優選地用于本文時，反義核酸是基于與靶RNA，優選地mRNA堿基互補性雜交由此激活RNA酶H的寡核苷酸。RNA酶H通過磷酸二酯和硫代磷酸酯(phosphothioate)-偶聯的DNA被激活。然而，磷酸二酯偶聯的DNA迅速被細胞核酸酶所降解，除了硫代磷酸酯-偶聯的DNA之外。因此，反義多核苷酸僅在作為DNA-RNA雜交復合物時是有效的。反義核酸的優選長度范圍是16-23個核苷酸。這種反義寡核苷酸的實例描述，特別是在美國專利5,849,902和美國專利5,989,912中。
另一組功能性核酸是核酶，其是催化活性核酸，優選地由基本上包括兩個部分的RNA組成。第一個部分顯示催化活性，而第二個部分負責與靶核酸的特異性相互作用。在典型地通過在兩條雜交鏈上的堿基的基本上互補的序列的雜交和Watson-Crick堿基配對進行靶核酸和核酶的所述部分相互作用后，催化活性部分可以變得有活性，這意味著在核酶的催化活性是磷酸二酯酶活性的情形中，其在分子內或分子間裂解靶核酸。核酶，應用和設計原則是本領域技術人員已知的，并且例如描述于Doherty和Doudna(Annu.Ref.Biophys.Biomolstruct.2000；30457-75)。
另一組功能性核酸是適體。適體是D-核酸，其是單鏈或雙鏈的并且與靶分子特異性相互作用。適體的制備或選擇例如描述于歐洲專利EP 0 533838中。與RNAi，siRNA，siNA，反義-核苷酸和核酶相反，適體不降解任何靶mRNA，但是與靶化合物諸如蛋白質的二級和三級結構特異性相互作用。在與靶相互作用后，所述靶典型地顯示在生物學活性中的變化。適體的長度典型地在少到15個到多到80個核苷酸的范圍內，并且優選地在約20-約50個核苷酸的范圍內。
另一組功能性核酸是spiegelmers，如例如描述在國際專利申請WO98/08856中。Spiegelmers是類似于適體的分子。然而，與適體相反，spiegelmers完全或大部分由L-核苷酸，而不是D-核苷酸組成。另外，特別是關于spiegelmers的可能的長度，將與適體相關的概括應用于spiegelmers。
如前所提及，本發明人已經令人驚訝地發現按照本發明的化合物和包括這種化合物的各自的組合物在將RNAi，更特別地siRNA和siNA轉移到細胞中可以是特別有效的。要注意的是，盡管不希望被任何理論所束縛，由于包含在按照本發明的脂質組合物中的輔助脂質的特別mol比例，所述輔助脂質可以是無PEG的輔助脂質或特別是包含PEG的輔助脂質，更具體地如果這種輔助脂質的任一種的含量包含在本文具體指出的濃度范圍內，可以意識到令人驚訝的效果。與此相關，特別值得注意的是如果按照本發明的組合物包含包括PEG部分的輔助脂質，使用這種包含PEG-衍生的輔助脂質的組合物的任何遞送或轉染作用在遞送核酸，特別是RNAi分子，最具體地siRNA，siNA，反義核苷酸和核酶中是特別有效的。本發明人已經令人驚奇地發現這一原因是包含超過約4％的含PEG的輔助脂質的脂質體是不具有活性的，而具有少于4％(優選地少于3％)的脂質體才介導功能性遞送。基本上，本發明人已經發現在按照本發明的脂質組合物中的PEG的特定量適合于分別提供有效的轉染和遞送。
在另一個方面，本發明人已經令人驚奇地發現優選地以脂質復合物(lipoplexes)或脂質體形式存在的按照本發明的脂質組合物優選地顯示總的陽離子電荷并且因此顯示額外的至少一個正電荷。更優選地，所述脂質組合物顯示約1∶1.3到1∶5的電荷比率負∶正。因此，本發明由此在另一個方面涉及任何脂質組合物，所述脂質組合物包括至少一種陽離子脂質和核酸，優選地RNAi，siRNA或siNA或具有約1∶1.3到1∶5的電荷比率負∶正的本文所述的任何其它功能性核酸。所述陽離子脂質優選地是本文所述的任何陽離子脂質。所述脂質組合物在優選的實施方案中包括本文所述的任何輔助脂質或復制脂質組合。在優選的實施方案中，包含核酸的按照本發明的組合物形成脂質復合物。在優選的實施方案中，用于本文的術語脂質復合物指由陽離子脂質、中性輔助脂質和核酸組成的組合物。
本發明人還已經發現具體地，siRNA和陽離子脂質的摩爾比率可以對于按照本發明的脂質組合物的成功應用是至關緊要的，尤其是考慮到以上關于包含核酸的脂質制劑的陽離子總電荷的所述時。不希望被任何理論所束縛，似乎具體地本文公開的1mol的陽離子脂質可以提供最多三個正電荷/分子，而本文公開的核酸和更具體地siRNA分子提供最多40個負電荷/分子。為了達到按照本發明的包含siRNA的脂質制劑的總的正電荷，摩爾比率可以在0到最多0.075的范圍內。優選的摩爾比率(ration)范圍在約0.02-0.05的范圍內，并且甚至更優選的是約0.037的摩爾比率范圍。
本發明人的另一個令人驚奇的發現是按照本發明的組合物顯示特別有用的特性，如果所述組合物包含核酸，優選地siRNA分子或siNA分子，并且核酸主鏈磷酸酯與陽離子脂質氮原子的電荷比率是約1∶1,5-7，更優選地1∶4的話。用于本文時，術語核酸主鏈磷酸酯指由形成這種核酸的單個核苷酸提供的核酸的磷酸酯部分。用于本文時，術語陽離子脂質氮原子指由優選地包括總共三個正電荷的陽離子脂質提供的那些氮原子。所述三個陽離子由兩個伯氨基基團和胍基團所提供。出于確定由核酸主鏈磷酸酯所提供的電荷的目的，作出下列假設在兩個核苷之間的每個磷酸酯提供一個負電荷并且3’末端磷酸酯，如果存在，提供兩個負電荷。出于確定由陽離子脂質氮原子提供的電荷和由磷酸酯原子提供的電荷的比率的目的，假設存在如上所述的電荷，盡管不得不承認在體外和/或體內應用下觀察到的特定的情形下，有效的電荷比率可以不同于上面具體指出的。
上面定義的電荷比率提供核酸穿過磷脂雙層膜諸如細胞質膜的有效轉移。
提供其遞送特性的按照本發明的組合物的另一特征是其大小分布。優選地，作為分散體存在的按照本發明的組合物的大小分布是約120nm。大小優選地通過準彈性光散射進行確定，如在實施例部分中更詳細描述的。
本發明人已經令人驚奇地發現按照本發明的組合物特別適合于遞送核酸、優選地功能性核酸諸如siRNA和siNA分子到細胞中。如在實施例中更詳細概述的，按照本發明的組合物在將所述核酸遞送到內皮細胞、上皮細胞和癌細胞的細胞內空間中是非常具有活性的。似乎存在增加更多的特異性從而使所述遞送在血管系統的內皮細胞中是特別有效的，盡管使用按照本發明的組合物也可以感染其它的內皮細胞。針對血管系統，更具體地作為如由腫瘤所誘導的新血管發生的結果的血管系統的內皮細胞，發生特別有效的轉染。可以研究的其它血管系統是腎、心臟、肺、肝和胰腺的血管系統。
要承認的是，按照本發明的組合物還在其是特別溫和或非毒性的范圍內是有利的。這種毒性的缺乏明顯地比現有技術中的組合物更為有利，因為通過避免副作用因此增加患者順應性和具體的施用形式諸如大丸劑給藥，其明顯有利于使用這種組合物的任何治療的醫用益處。如可從本文的實施例部分中所見，后者從動物研究中是顯而易見的。
在本發明中的是，所述組合物和更具體地藥物組合物可以包括一種或多種前述生物活性化合物，所述生物活性化合物可以分別包含在按照本發明的組合物中作為藥物活性化合物和作為另外的組分。本領域技術人員要承認的是，這些化合物中的任一種，在原則上可以用作藥物活性化合物。這種藥物活性化合物典型地針對涉及疾病的病理機制的靶分子。由于各種生物活性化合物和由此的與本發明的任何方面相關使用的藥物活性化合物的一般設計原則和作用模式，實際上可以針對任何靶標。因此，按照本發明的化合物和包含其的各自組合物可以用于治療或預防任何疾病或疾病狀況，所述疾病或疾病狀況可以使用這種生物活性化合物進行處理、預防和/或治療。要承認的是，除了這些生物活性化合物之外，任何其它的生物活性化合物也可以是按照本發明的任何實施方案的組合物的部分。優選地，這種其它的生物活性化合物包括至少一個負電荷，優選地在這樣的條件下，所述條件是這種其它的生物活性化合物與按照本發明的化合物，更優選地作為陽離子脂質存在的按照本發明的化合物相互作用或復合。
用于本文時，生物活性化合物優選地是任何具有生物活性的化合物，其優選地顯示在生物系統上顯示任何生物、化學和/或物理作用。這種生物系統優選地是任何生化反應，任何細胞、優選地任何動物細胞，更優選地任何脊椎動物細胞和最優選地任何哺乳動物細胞，包括但不限于任何人細胞，任何組織，任何器官和任何生物。任何這樣的生物優選地選自包括下列各項的組小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、狗、猴和人。
也在本發明中的是按照本發明的組合物，更具體地按照本發明的任何藥物組合物的任一種可以包括任何其它的藥物活性化合物。
所述組合物，具體地按照本發明的藥物組合物可以用于各種形式的給藥，其中局部給藥和系統給藥是特別優選的。更為優選的是這樣的給藥途徑，所述給藥途徑選自包括下列各項的組肌內(intramascular)、經皮、皮下、靜脈內和肺給藥。優選地用于本文時，局部給藥意味著各個組合物以分別與細胞、組織和器官的接近空間關系進行施用，所述組合物和生物活性化合物分別施用于所述細胞、組織和器官。用于本文時，系統給藥意為這樣的給藥，所述給藥不同于局部給藥并且更優選地是向體液諸如血液和液體的給藥，其中所述體液將組合物分別向細胞、組織和器官進行轉運，所述組合物和生物活性化合物分別被遞送到所述細胞、組織和器官中。
用于本文時，穿過其細胞膜分別以按照本發明的化合物和組合物的方式來轉移生物活性化合物的細胞優選地是真核生物細胞，更優選地脊椎動物細胞和甚至更優選地哺乳動物細胞。最優選地所述細胞是人細胞。
可以分別使用按照本發明的化合物和組合物進行制備的任何藥物用于患者的治療和預防。優選地，這樣的患者是脊椎動物，更優選地是哺乳動物和甚至更優選地這種哺乳動物選自包括下列各項的組中小鼠、大鼠、狗、貓、豚鼠、兔、猴和人。在另一個方面中，按照本發明的化合物和組合物可以用作轉移劑，更優選地作為轉染劑。
優選地用于本文的轉移劑是任何適合于轉移化合物，更優選地生物活性化合物諸如藥物活性化合物穿過膜，優選地細胞膜和更優選地將這種化合物轉移到如本文前面所述的細胞中的任何試劑。優選地，所述細胞是內皮細胞，更優選地脊椎動物的內皮細胞和最優選的哺乳動物的內皮細胞，所述哺乳動物諸如小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、猴和人。
在另一個方面中，本發明涉及用生物活性化合物轉移，更具體地轉染細胞的方法。在第一個步驟中，其中步驟的順序不必受到限制，分別提供細胞和膜和細胞。在第二個步驟中，提供按照本發明的化合物以及生物活性化合物諸如藥物活性化合物。這種反應可以分別與細胞和膜接觸，并且由于按照本發明的化合物和組合物的生物物理性質，所述生物活性化合物將從膜的一側轉移到另一側，或在膜形成細胞的情形中，從細胞的外面到細胞內。在本發明中的是，在分別接觸細胞和膜之前，生物活性化合物和按照本發明的化合物，即陽離子脂質接觸，于是優選地形成復合物并且這種復合物分別與細胞和膜接觸。
在本發明的另一個方面中，用于分別轉移生物活性化合物和藥物活性化合物的方法包括分別提供細胞和膜的步驟，提供按照本發明的組合物和使組合物和細胞分別和膜接觸。在本發明中的是，所述組合物可以在分別接觸細胞和膜之前或在其過程中形成。
在用于轉移本文公開的生物活性化合物的任何方法的實施方案中，所述方法可以包括另外的步驟，優選地檢測所述生物活性化合物是否已經被轉移的步驟。這種檢測反應在很大程度上取決于按照所述方法轉移的生物活性化合物的種類并且對于本領域技術人員而言是顯而易見的。在本發明中的是該方法在本文所述的任何細胞、組織、器官和生物上進行。
本發明還通過參考下列圖和實施例來進一步舉例說明，本發明的其它特征、實施方案和優勢可以從所述圖和實施例中獲得。
更具體地，圖1顯示按照本發明的陽離子脂質的基本設計；
圖2顯示N-油基-十六烷基胺的合成，所述N-油基-十六烷基胺是合成按照本發明的化合物的可能的原材料，其中這種合成是按照如在US 6,395,713中所述的現有技術中描述的合成；圖3描述N-油基-十六烷基胺的合成，其是按照本發明的重要的原材料；圖4-9描述β-精氨酰-2，3-氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十二烷基-N-十四烷基-酰胺三鹽酸化物和ε-精氨酰-賴氨酸-N-十二烷基-N-十四烷基-酰胺三鹽酸化物的合成；圖10描述備選的陽離子頭部基團的合成，其是合成按照本發明的陽離子脂質的備選成分；圖11描述β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物的備選合成路徑；圖12A和12B描述按照本發明的脂質制劑的大小分布和擠壓以及高壓均化的分別的影響；圖13描述暴露于冷凍保護劑和貯存于不同溫度的包含RNAi的脂質制劑的蛋白質印跡分析的結果；圖14描述關于不同的siRNA加載對脂質制劑的影響的蛋白質印跡分析的結果，所述脂質制劑在它們的輔助脂質上是不同的；圖15描述蛋白質印跡分析的結果和不同濃度的PEG-取代的脂質的影響；圖16描述用于產生RasV12-依賴型腫瘤小鼠模型的實驗設置及其在測試各種制劑中的應用；圖17A，17B和17C描述圖表，所述圖表顯示腫瘤體積作為使用不同制劑進行細胞攻擊后的天數的函數；圖18a描述裸的和脂質復合的PKN3特異性siRNA的作用的蛋白質印跡分析的結果；圖18b是顯示裸的和配制的siRNAs的細胞內分布的共焦顯微圖片；圖18c是描述肝中配制的脂質體和裸siRNAs的分布的落射熒光顯微圖片(上版)和共焦顯微圖片(下版)；
圖18d是用脂質體配制的siRNAs靶向的內皮細胞的落射和共焦熒光顯微照片；圖18e是不同腫瘤的內皮細胞的熒光顯微照片；圖19a是PTEN定向的siRNA對DNA合成的作用模式的圖示，并且顯示使用不同的siRNA種類的蛋白質印跡分析的結果和用所述不同的siRNA種類處理的HELA細胞的免疫熒光顯微照片；圖19b描述用不同的siRNA分子處理的內皮細胞的圖片和表示在肝內皮細胞中的BrdU測定的結果的圖表；圖19c描述用不同的siRNA分子處理的內皮細胞的圖片和表示在腫瘤內皮細胞中的BrdU測定的結果的圖表；圖20a描述確定有效的siRNA分子用于有效CD31的擊倒(knock-down)的蛋白質印跡分析的結果；圖20b是舉例說明在小鼠的不同器官中抗-CD31 siRNA對CD 31mRNA水平的作用的圖表；圖20c顯示使用抗CD31 siRNA分子確定CD31蛋白質擊倒在小鼠的不同器官中的功效的蛋白質印跡分析的結果；圖20d顯示通過直接免疫染色用抗-CD 31 siRNA分子處理的小鼠的石蠟腫瘤切片的CD 31蛋白質的體內擊倒的結果；圖21a描述研究抗-CD31 siRNA和抗-PTEN siRNA分子對CD31，CD34，PTEN和p-Akt擊倒的功效的蛋白質印跡分析的結果；圖21b是描述脂質復合物給藥的不同模式對測試動物的體重的影響作為時間的函數的圖表；圖21c表示這樣的圖表，所述圖表舉例說明不同的抗-CD31 siRNA處理方案對兩種不同的腫瘤異種移植物的體積的影響；和圖21d是這樣的圖表，所述圖表舉例說明對在抗-CD31處理方案下建立的PC-3異種移植物的生長的抑制。
實施例1根據現有技術合成N-油基-十六烷基胺N-油基-十六烷基胺是按照本發明的化合物的重要原材料。在原則上，N-油基-十六烷基胺可以如US 6,395,713中所述地那樣進行合成。各個反應方案顯示在圖2中。不過，原材料是由例如，Fluka提供的工業級的油基胺。通過氣相色譜進行這種原材料的分析顯示≥70％的純度，其中所述材料的30％由具有不同鏈長度的胺組成。其原因可能是這種材料是由植物來源獲得的。在100到120℃將兩種原材料反應30分鐘后，油基胺和1-溴代十六烷(十六烷基溴)結合形成N-油基-十六烷基胺。產率為大約83％。
實施例2合成按照本發明的N-十六烷基-油基胺關于按照本發明的化合物，本發明人認識到一種新的合成法(圖3)。這種新的反應方案是基于本發明人的發現，即大量的雜質影響基于這種原材料制備的轉移劑的質量。因此，該反應使用通過氣相色譜顯示具有≥99％純度的油酸并將這種油酸與氯甲酸乙酯、TEA和CH2Cl2接觸，并將由此獲得的混合羧酸-碳酸酐與通過氣相色譜顯示也具有≥99％純度的十六烷基胺(十六烷基胺)反應而起始。隨后將反應產物N-十六烷基-油酰基酰胺[#1]與LiAlH4(在THF中)反應，生成呈現為無色結晶固體的85％N-十六烷基-油基胺[#2]。
下面列出更加詳細的反應條件N-十六烷基-油酰基酰胺[#1]的合成于氬氣惰性氣體下，在按照Schlenk的250ml氮氣瓶里將2.62ml(27.5mmol)氯甲酸乙酯溶于30ml無水二氯甲烷中并冷卻到0℃。在20分鐘內在攪拌(steering)下逐滴加入在40ml無水二氯甲烷中的7.93ml(25mmol)油酸和4.16ml(30mmol)三乙胺溶液。在冰浴上攪拌30分鐘后，逐滴快速加入50ml CHCl3中的6.64g(27.5mmol)十六烷基胺溶液并將混合物于室溫下攪拌2小時。隨后，每次用40ml水將溶液洗滌三次，將有機相通過Na2SO4干燥并使用旋轉式蒸發儀去除溶劑。由100ml丙酮將殘余物再結晶。獲得對應于89％產率的無色固體11.25g(22.3mmol)。
N-十六烷基-油基胺[#2]的合成在氬氣惰性氣體下于250ml三頸燒瓶中提供在乙醚中的20ml 1MLiAlH4，所述燒瓶具有滴液漏斗和回流冷凝器，并且隨后在20分鐘內逐滴加入在80ml THF中的7.59g(15mmol)十六烷基油酰酰胺溶液。將混合物回流2.5小時，隨后加入另外5ml在乙醚中的1M LiAlH4并再回流2.5小時。在冰浴冷卻下使用6M NaOH分解多余的氫化物并濾去沉淀物。每次用40ml熱MtBE抽提沉淀物兩次，將合并的有機相通過Na2SO4進行干燥并使用旋轉式蒸發儀除去溶劑。由100ml MtBE于-20℃將殘余物結晶。獲得對應于85％產率的無色結晶固體6.23g(12.7mmol)。
實施例3Boc-Dap(Fmoc)-N-十六烷基(plamityl)-N-油基-酰胺[#3]的合成在50ml圓底燒瓶里溶解在10ml無水二氯甲烷中的521mg(1.06mmol)N-油基-十六烷基胺并加入289mg(1.17mmol)EEDQ。隨后，在攪拌下，加入500mg(1.17mmol)Boc-Dap(Fmoc)-OH并將混合物于室溫下攪拌20小時。用80ml二氯甲烷將溶液轉移入分液漏斗中并每次用20ml0.1N HCl洗滌三次并用20ml飽和NaHCO3溶液洗滌一次。通過Na2SO4干燥后使用旋轉式蒸發儀除去溶劑(圖4)。獲得未作進一步純化的微黃色粘性油。在使用1∶1的己烷/乙酸乙酯的薄層色譜分析中觀察到Rf為0.70。
實施例4Boc-Dap-N-十六烷基-N-油基-酰胺[#4]的合成在50ml圓底燒瓶中將1g Boc-Dap(Fmoc)-N-十六烷基-N-由基-酰胺粗產物溶于8ml無水二氯甲烷中。加入3ml二乙胺并于室溫下攪拌(圖4)。反應的薄層色譜控制顯示反應的薄層色譜控制顯示在4.5小時之后完成起始產物的反應。通過旋轉式蒸發儀除去揮發性組分并利用40g硅膠60(Merck)使用己烷/乙酸乙酯5∶1對殘余物進行色譜法純化。利用分級梯度來洗脫產物，所述梯度由乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇4∶1和二氯甲烷/甲醇4∶1組成。獲得作為黃色粘性油的576mg(0.85mmol)Boc-Dap-N-十六烷基-N-油基-酰胺。
實施例5四-Boc-[β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺][#5]的合成在100ml圓底燒瓶中將576mg(0.85mmol)Boc-Dap-N-十六烷基-N-油基-酰胺溶于10ml無水二氯甲烷并在攪拌下加入210mg(0.85mmol)EEDQ和403mg(0.85mmol)Boc-Arg(Boc)2-OH(圖5)。在氬氣氣氛下于室溫將混合物攪拌20小時。隨后，通過旋轉式蒸發儀除去二氯甲烷并將在100ml MtBE中的殘余物轉移入分液漏斗中。用0.1N HCl，1N NaOH和飽和NaHCO3溶液徹底洗滌有機相，通過Na2SO4干燥并通過旋轉式蒸發儀除去溶劑。隨后通過急驟色譜法(Combiflash Retrieve；Isco Inc.)純化粗制產物，利用己烷/乙酸乙酯作為洗脫劑。獲得對應于72％的產率的694mg(0.61mmol)無色粘性油。
實施例6β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物[#6]的合成在氬氣氣氛下，在根據Schlenk的25ml氮氣瓶中提供694mg(0.61mmol)充分干燥的四-Boc-[β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺]并加入二噁烷中的8ml 4N HCl(圖5)。在氬氣惰性氣體下于室溫將混合物攪拌24小時，由此在大約6-8小時后產物由溶液沉淀為無定形的和部分蠟樣的固體。在反應結束后(使用CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶4的薄層控制)在高真空下除去任何揮發性組分。獲得作為三鹽酸化物的489mg(0.58mmol)β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺。
實施例7N-十二烷基-十四烷基胺[#7]的合成在具有回流冷凝器和滴液漏斗的500ml 3-頸燒瓶中將18.54g(100mmol)十二烷基胺(十二烷基胺)，6.36g(60mmol)Na2CO3和50mg碘化四丁基胺(TBAI)懸浮于100ml無水DMF中。在100℃下于110分鐘時間內逐滴加入在100ml無水二噁烷中的16.4ml(60mmol)1-溴代四癸烷溶液并在100℃下將混合物再攪拌3.5小時(圖6)。在盡可能熱的溫度下過濾溶液。除去在4℃過夜沉淀的結晶固體并用少許冷甲醇進行洗滌。隨后，將固體從200ml甲醇重新結晶。獲得由100ml MtBE重新結晶的9g無色葉狀晶體。將晶體在-18℃下沉淀，由冷卻的玻璃料吸出并用冷MtBE進行洗滌。獲得7.94g(21mmol)的無色結晶固體，對應于35％的產率。
實施例8Boc-Dap(Fmoc)-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺[#8]的合成在50ml圓底燒瓶中將715mg(1.68mmol)Boc-Dap(Fmoc)-OH溶于15ml無水二氯甲烷中并加入420mg(1.7mmol)EEDQ。將混合物于室溫下攪拌45分鐘并且隨后在60分鐘內逐滴緩慢加入在25ml無水二氯甲烷中的641mg(1.68mmol)N-十二烷基-十四烷基胺溶液(圖6)。在20小時的反應時間后通過旋轉式蒸發儀除去溶劑并用100ml MtBE將殘余物轉移入分液漏斗中。用0.1N HCl和飽和NaHCO3溶液充分洗滌溶液，將有機相通過Na2SO4干燥并通過旋轉式蒸發儀除去溶劑。獲得1.02g的粗制產物，通過用己烷/乙酸乙酯作為洗脫劑的急驟色譜法(Combiflash Retrieve；IscoInc.)對其進行純化。獲得作為無色，極粘性油的607mg純產物。使用己烷/乙酸乙酯1∶1的薄層色譜分析提供了0.58的Rf。
實施例9Boc-Dap-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺[#9]的合成在50ml圓底燒瓶中將607mg Boc-Dap(Fmoc)-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺溶于8ml無水二氯甲烷中(圖6)。加入3ml二乙胺并將反應物于室溫下攪拌4.5小時。使用旋轉式蒸發儀除去揮發性組分并通過使用40g硅膠60(Merck)的色譜法以己烷/乙酸乙酯5∶1純化殘余物。通過分級梯度來洗脫產物，所述分級梯度由乙酸乙酯、二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇3∶1組成。獲得作為微黃色，粘性油的372mg(0.655mmol)Boc-Dap-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺。
實施例10四-Boc-[β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺][#10]的合成在50ml圓底燒瓶中將372mg(0.655mmol)Boc-Dap-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺溶于8ml無水二氯甲烷中并在攪拌下加入162mg(0.655mmol)EEDQ和311mg(0.655mmol)Boc-Arg-(Boc)2-OH(圖7)。將混合物于室溫下攪拌20小時。隨后，使用旋轉式蒸發儀除去二氯甲烷并用80mlMtBE將殘余物轉移入分液漏斗中。用0.1N HCl，1N NaOH和飽和NaHCO3溶液充分洗滌有機相，通過Na2SO4干燥并通過旋轉式蒸發儀除去溶劑。隨后通過使用乙烷/乙酸乙酯的分級梯度的急驟色譜法(CombiflashRetrieve；Isco Inc.)純化粗制產物。獲得500mg(0.5mmol)的無色粘性油，對應于產率76％。
實施例11β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺三鹽酸化物[#11]的合成在氬氣下，在25ml根據Schlenk的氬氣瓶中提供511mg(0.5mmol)充分干燥的四-Boc-[β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺]并加入在二噁烷中的10ml 4N HCl(圖7)。在氬氣惰性氣體下于室溫將混合物攪拌24小時，由此在6到8小時后產物由溶液沉淀為部分無定形的，部分蠟樣的固體。在反應結束后(使用CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶4的薄層色譜法控制)在高真空下除去所有揮發性組分。獲得以三鹽酸化物形式存在的323mg(0.5mmol)β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺。
實施例12Boc-Lys(Fmoc)-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺[#12]的合成在50ml圓底燒瓶中將937mg(2mmol)Boc-Lys(Fmoc)-OH溶于10ml無水二氯甲烷中并加入495mg(2mmol)EEDQ(圖8)。將混合物于室溫下攪拌60分鐘并且隨后在120分鐘內以逐滴的方式緩慢加入在30ml無水二氯甲烷中的764mg(2mmol)N-十二烷基-十四烷基胺溶液。在20小時的反應時間之后使用旋轉式蒸發儀除去溶劑，并用100ml MtBE將殘余物轉移入分液漏斗中。用0.1N HCl和飽和NaHCO3充分洗滌溶液，將有機相通過Na2SO4干燥并使用旋轉式蒸發儀除去溶劑。獲得1.757g的粗制產物，利用以己烷/乙酸乙酯4∶1作為洗脫劑的急聚色譜法對其進行純化。獲得了作為無色，極粘性油的1.377g純的產物。使用己烷/乙酸乙酯1∶1的薄層色譜法給出了0.57的Rf。
實施例13Boc-Lys-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺[#13]的合成在50ml圓底燒瓶中將1.377g Boc-Lys(Fmoc)-N-十二烷基-N-十四烷基-酰胺溶于16ml無水二氯甲烷中。加入6ml二乙胺并于室溫下將混合物保持5小時(圖8)。使用旋轉式蒸發儀除去揮發性組分并通過使用40g硅膠60(Merck)的色譜法以己烷/乙酸乙酯5∶1純化殘余物。利用分級梯度來洗脫產物，所述分級梯度由乙酸乙酯、二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇3∶1組成。獲得作為微黃色粘性油的556mg(0.911mmol)Boc-Lys-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺以及119mg的混合級分。
實施例14四-Boc-[ε-精氨酰-賴氨酸-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺][#14]的合成將556mg(0.911mmol)Boc-Lys-N-十二烷基-N-十四烷基-酰胺溶于40ml無水二氯甲烷中并在控制下加入226mg(0.911mmol)EEDQ和433mg(0.911mmol)Boc-Arg(Boc)2-OH(圖9)。將混合物保持于室溫下達20小時。隨后，使用旋轉式蒸發儀除去二氯甲烷并用80ml MtBE將殘余物轉移入分液漏斗中。用0.1N HCl和飽和NaHCO3溶液充分洗滌有機相，通過Na2SO4將其進行干燥，使用旋轉式蒸發儀除去溶劑。隨后通過使用己烷/乙酸乙酯分級梯度的急驟色譜法(Combiflash Retrieve；Isco Inc.)來純化粗制產物。獲得730mg(0.684mmol)的無色、粘性油，對應于75％的產率。
實施例15ε-精氨酰-賴氨酸-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺三鹽酸化物[#15]的合成在氬氣下在25ml根據Schlenk的氬氣瓶中提供730mg(0.684mmol)充分干燥的四-Boc-[ε-精氨酰-賴氨酸(lysin)-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺]并加入在二噁烷中的10ml 4N HCl(圖9)。將混合物在氬氣惰性氣體下于室溫攪拌24小時，由此在大約8小時后產物由溶液沉淀為無定形的，部分蠟樣的固體。在反應如通過使用CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶4的薄層色譜法控制結束后，在高真空下除去所有揮發性組分。獲得作為三鹽酸化物的491mg(0.633mmol)ε-精氨酰-賴氨酸-N-十二烷基-N-十四烷基酰胺。
實施例16Tri-Boc-γ-胍-α，γ-二氨基丁酸[#16]的合成在100ml圓底燒瓶中提供在15ml乙腈里的1.31g(6mmol)Boc-Dab-OH并加入12mmol二異丙基乙基胺(DIPEA)(圖10)。隨后逐滴加入水直到一部分Boc-Dab-OH溶解并且隨后加入1.96g(5mmol)1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰基)胍。將混合物于室溫下攪拌12小時，之后使用旋轉式蒸發儀除去乙腈。將水性殘余物用5ml水稀釋并加入50ml二氯甲烷。通過在攪拌下加入2N HCl將反應物酸化至pH 2并且隨后分離有機相。用50ml二氯甲烷抽提水相并且隨后將合并的有機相用一些稀釋的HCl和飽和NaCl溶液進行洗滌。將有機相通過Na2SO4干燥并使用旋轉式蒸發儀除去溶劑。使用利用己烷/乙酸乙酯2∶1的在硅膠60上的色譜法來純化殘余物。獲得了1.138g(2.47mmol)無色無定形固體，對應于50％的產率。
實施例17β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物[#6]的合成在氬氣氣氛下將在15ml無水CH2Cl2中的1.225g(6mmol)Boc-Dap-OH懸浮于包含滴液漏斗的250ml Schlenk燒瓶中并加入1.72ml三甲胺(thrimethylamine)。在劇烈攪拌下于室溫在15到20分鐘內逐滴加入在30ml無水的CH2Cl2中的1.52ml(12mmol)TMSCI溶液。同時在氬氣氣氛下于100ml Schlenk燒瓶中將941mg(5.8mmol)羰二咪唑溶于8ml無水的CH2Cl2中。于室溫并且在攪拌下在15到20分鐘內逐滴加入在25ml無水的CH2Cl2中的2.66g(5.6mmol)Boc-Arg(Boc)2-OH溶液。將兩種反應溶液于室溫下攪拌4h。隨后，在氬氣氣氛下于室溫通過滴液漏斗在15到20分鐘內將832μl(6mmol)三乙胺加入第一種溶液中并且逐滴加入第二種溶液。在15到20分鐘之后，加入30ml水，劇烈攪拌45分鐘并將溶液調節到pH為2。分離有機相，并用CH2Cl2抽提水相幾次。用NaCl和硫酸鈉的飽和溶液干燥合并的有機相并使用旋轉式蒸發儀除去溶劑。利用在硅膠上的急驟色譜法用二氯甲烷作為洗脫劑純化玻璃樣殘余物。獲得2.74g(4.15mmol；74％)的無色、無定形固體[化合物17]。
在基本上類似于實施例10的條件之下將這種固體與油基十六烷基胺[#2]反應，由此將溫度設定為35到40℃(產率72％)。在裂解下如實施例11中所述的Boc保護基之后獲得所要的最終產物β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物[#6]。由此獲得的產物可以利用在RP-18硅膠上的急驟色譜法用MeOH/水作為洗脫劑作進一步純化。
實施例18由陽離子脂質體和siRNA組成的復合物(脂質復合物)的制備利用本領域已知的標準技術如脂質薄膜/塊再水合，乙醇注射法，反相蒸發或去污劑透析法制備由陽離子脂質體和siRNA組成的脂質復合物[參見 Liposomes as Tools in Basic Research and Industry；Jean R.Philippot和Francis Schuber；CRC Press January 1995 und Liposome TechnologyPreparation of Liposomes001 Gregory Gregoriadis CRC Press I Llc.April1984]。
由此獲得的脂質體，其在本文中也稱作結合核酸如siRNA的脂質復合物，包含作為脂質的β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物并且另外地1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺或1，2-二油基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，其中優選使用1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。這些脂質體和脂質復合物的脂質部分分別是50mol％的β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物和50mol％的1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺或50mol％的1，2-二油基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。
50mol％的β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物和50mol％1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺的組合在本文中也稱作atuFect。
所要理解的是在理論上本文公開的任何其它脂質和脂質復合物都可以利用先前提及的技術以及另外的加工步驟進行制備。
將脂質體和脂質復合物分別進行進一步的加工步驟以便在大小、多分散性和片層性方面修整它們。這些特征可以通過超聲波降解，如穿過多孔膜的擠壓，和均化作用，優選高壓均化作用進行調整。
通過用Beckman-Coulter N5亞微細粒分析儀進行光子相關光譜分析來表征由此形成的脂質體或脂質復合物，這些通過擠壓或通過高壓均化作用限定大小的這些脂質體的結果分別描繪于圖12A和12B中。
從圖12A可見脂質體的大小分布可以使用具有不同大小排阻的不同膜進行調整，在該情形中分別為1,000nm和400nm。在全部兩種情況下，都將擠壓步驟重復21次。不過，在本發明中，大小排阻可以從大約50到5000nm，并且可以將擠壓步驟重復10到50次。
從圖12B中可見，高壓均化作用還是調整脂質體大小分布的合適方法，由此在應用這種高壓均化作用后，脂質體的大小依賴于脂質體所進行的均化作用的周期數。典型壓力范圍是100-2500bar，由此在該情形中外加的壓力為1,500bar。
實施例19atuFect的貯存穩定性如果本文公開的組合物典型地用作藥物組合物，基本上這些藥物制劑對于保存條件是穩定的。為了研究貯存穩定性設計了一種針對腫瘤抑制劑PTEN的siRNA，所述腫瘤抑制劑PTEN使用在實施例18中所述的atuFect進行配制。
更加具體的是，脂質體利用具有在下面描述的最終貯存濃度的液體貯存溶液，通過在300mM蔗糖溶液中的脂質薄膜再水合進行制備，隨后分別進行擠壓和高壓均化作用。將由此獲得的脂質體與下面所述的siRNA分子以1∶1的mol比進行混合；或者脂質層可以在siRNA存在的情況下進行再水合并且將由此獲得的脂質復合物擠出或均化。
SiRNA分子如下反義PTENAV 10 5’uaaguucuagcuguggugg-P 3’；有義PTENBV105’ccaccacagcuagaacuua-P 3’；，其中粗體核苷酸顯示各自的核苷酸為2’-O-甲基。
將脂質復合物于Hela細胞上，在包含血清的培養基存在的情況下以不同濃度溫育48h(siRNA分子的nM顯示于圖13中)。如先前所述的那樣(標準的蛋白質印跡方案)進行使用p110a(負載對照)和PTEN特異性抗體，以全細胞提取物的免疫印跡。
合適的冷凍保護劑包括，但，不限于，蔗糖、海藻糖、麥芽糖、纖維二糖、棉子糖、半乳糖、甘露糖(mannitole)和PEG。在本實施例中，將300mM的蔗糖溶液用作包含PTEN靶向siRNA的atuFect制劑的載體。最終的貯存濃度為全脂質1,445mg/ml和15μM PTEN-siRNA。將溶液保持于室溫下，于4℃保存7天或保存于-80℃持續7天。在包含血清的培養基中稀釋所述溶液到指示的最終濃度(20，10，5nM)。在HeLa細胞上以40,000孔的細胞密度進行測試。結果描述于圖13中，從該圖可見冷凍在冷凍保護劑中包含siRNA的atuFect并且將其保存在-80℃下達7天，在融化后，和它在4℃保存一樣有效。
實施例20脂質組合物和siRNA負載制備兩種不同類型的脂質制劑。脂質制劑01由作為陽離子脂質的50mol％β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，和50mol％1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺組成，而脂質制劑02由作為陽離子脂質的50mol％β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，和50mol％1，2-二油基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺組成。每種脂質制劑都包含針對PTEN的siRNA，(貯存濃度為15μM siRNA和1,445mg/ml脂質)，其中在細胞上滴定siRNA的摩爾濃度，分別導致1μM，500nM，100nM和50nM的最終濃度。
將這種包含PTEN特異性RNAi的脂質制劑施用給生長在標準細胞培養條件下在Dulbecco′s改進Eagle′s培養基中的小鼠細胞系(B16V，ATCCNo.CRL6475)，所述培養基含有4mM L-谷氨酰胺，調節至包含1.5g/L碳酸氫鈉和4.5g/L葡萄糖，90％；胎牛血清，10％。細胞密度為40.000細胞/6孔并且在48小時之后將細胞裂解并進行蛋白質印跡分析，其結果描繪于圖14。以對激酶PRK2特異性的單克隆抗體(Becton Dickinson)獲得的信號用作與PTEN信號(單克隆抗體，Santa Cruze，CA)作比較的負載對照。
從圖14可見，如果siRNA含量為50nM，脂質制劑01，即包含1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺的制劑仍然有效，而如通過PTEN特異性抗體(Santa Cruze，CA)檢測，只有siRNA含量為大約1μM或更多，包含1，2-二油基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺作為輔助脂質的脂質制劑02才能產生PTEN的降低(knockdown)。非相關激酶PRK2的信號被用作負載對照并通過針對其的抗體進行檢測。
實施例21脂質組合物和PEG含量為了測試PEG對于脂質組合物的轉染和遞送功效的影響，根據本文公開的方法產生下列制劑，所述脂質組合物包含β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物(陽離子脂質)作為脂質組分以及1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)和1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇-2000(DSPE-PEG2000)C1-C5制劑
H1-H5制劑
對于任何前述制劑來說，脂質濃度為在300mM蔗糖中的1.445mg/ml，siRNA濃度為15μM。稀釋形成的濃縮貯存-復合物在細胞培養基中產生20，10，5nM siRNA的最終濃度。
包含在所述制劑中的RNAi分子是針對PTEN的并且序列在實施例22中描述。將脂質制劑施用到在6孔板中所包含的HeLa細胞中，所述板每個包含40,000細胞/孔。對細胞分析PTEN的表達并且結果作為蛋白質印跡描繪于圖15中。p110a表達用作負載對照并且通過對p110a特異性的單克隆抗體進行檢測。由圖15中所描繪的任何蛋白質印跡可見大約1到2mol％的含有PEG的輔助脂質適于提供PTEN表達的有效降低。
可以斷定，優選地，DPhyPE組分要被PEG化的輔助脂質所代替而非陽離子脂質組分被PEG化的輔助脂質所代替。這可以從上面的實驗得知，其中H制劑似乎比C制劑更有效。PEG化的輔助脂質的含量優選為從大約0.05％到4.9％，優選地1-3％并且更加優選地2-3％。
實施例22包含siRNA的脂質制劑的體內使用為了測試按照本發明的包含siRNA的脂質制劑的適合性，將所述脂質制劑用于小鼠模型中。與經常用于在體內向肝遞送siRNA的，將相應于大約10％體重的體積，大約2.5ml的液體/小鼠快速注射到尾靜脈中的所謂流體壓注射相反，本發明的體內實驗是這樣實施的，從而使以低體積(200-300μl)全身性施用包含siRNA的脂質制劑，其是緩慢地，即，在幾秒鐘的時間上，注射入小鼠的尾靜脈中，由此實施一種臨床相關模式的給藥。實驗設置描述于圖16中。
使用致瘤Ras(RasV12)轉化功能上正常的大鼠胚胎成纖維細胞(RAT2；ATCCCRL-174)。隨后將轉化的RasV12依賴型成纖維細胞注射入小鼠中(6只小鼠每組；八周齡雄性ShoeNMRI-nu/nu，DIMED，德國)，其在十天后發展成腫瘤。在此階段，所述動物不進行處理直到在注射了轉化的成纖維細胞之后第19天，或者使用各種制劑的處理在第11天開始。作為進一步的對照，將功能上正常的大鼠胚胎成纖維細胞注射入不發展腫瘤的小鼠體內。
本文稱作T-Ras的siRNA分子由在5’-3’方向上具有下列序列的第一鏈T-Ras 3Aaacguguagaaggcauccu-P和在5’-3’方向上具有下列序列的第二鏈T-Ras 3Baggaugccuucuacacguu-P組成。請注意以粗體打印并且下劃線的核苷酸為2’-O-甲基核苷酸。在任何鏈上，前述序列中3’端起始以由P表示的磷酸酯。
作為對照設計了PTEN特異性siRNA分子，帶有具下列序列的第一鏈5’uaaguucuagcuguggugg-P 3’和第二序列5’ccaccacagcuagaacuua-P 3’，其中修飾模式分別與關于T-Ras 3A和T-Ras 3B所列出的相同。
將下列制劑施用給小鼠模型制劑組APBS；T-Ras 310mg/kg/atuFect/3.7mg/kg；裸T-Ras 3 10mg/kg；和T-Ras 3 5mg/kg/atuFect 38.5mg/kg.
制劑組BPBS；僅atuFect 38.5mg/kg；PTEN 10mg/kg/atuFect 38.5mg/kg；和T-Ras 35mg/kg/atuFect 38.5mg/kg.
制劑組C蔗糖(50mM)；T-Ras 33.75mg/kg/atuFect-PEG 28.9mg/kg，靜脈內給藥；和T-Ras 33.75mg/kg/atuFect-PEG 28.9mg/kg，腹膜內給藥。
這里所用的atuFect-PEG意為在50mM蔗糖中，50mol％β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，48mol％1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和2mol％1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇-2000(DSPE-PEG2000)。
在動物中的劑量為5mg/kg siRNA和38.5mg/kg總脂質；注射溶液中組分的濃度為0.5mg/ml siRNA和3.85mg/ml總脂質；摩爾比率為siRNA0.5mg/ml相應于0.04μmole/ml(分子量大約為12500Da)。脂質為3.85mg/ml總脂質，其中陽離子脂質的含量為1.97mg/ml(分子量843.6)相應于2.3μmole/ml陽離子脂質。siRNA與陽離子脂質的摩爾比率為0.0174到1。
這些實驗的結果描述于圖17A(制劑組A)，圖17B(制劑組B)和圖17C(制劑組C)中，顯示腫瘤體積為時間即，在細胞攻擊后的天數的函數。
由圖17A和17B都可見，由以atuFect配制的T-Ras特異性siRNA組成的脂質復合物顯示最強烈的抑制并且表明靶向的特異性。應當注意當與僅atuFect相比時，陰性對照分子PTENV10并不顯示對腫瘤生長抑制作用的改進(圖17B)。
由圖17C也可見atuFect-PEG是高度有效的并且允許腹膜內以及靜脈內給藥，導致類似的效力。與之相關值得注意的是，顯而易見，PEG化的復合物是功能上具有活性的，并且可以假定由于PEG化作用，這些脂質組合物比缺少PEG化的(輔助)脂質的類似脂質組合物具有更小的毒性。
實施例23實施例24到27的材料和方法siRNA-脂質復合物的制備通過脂質薄膜在300mM無菌無RNA酶蔗糖溶液中重新水合至總脂質濃度4.34mg/ml來制備摩爾比率為50/49/1的包含陽離子脂質β-L-精氨酰-2，3-L-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物的陽離子脂質體，中性磷脂1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(Avanti Polar Lipids Inc.，Alabaster，AL)和PEG化的脂質N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺鈉鹽(Lipoid GmbH，Ludwigshafen，德國)。隨后通過利用EmulsiFlex C3裝置(Avestin，Inc.，Ottawa，加拿大)進行高壓均化作用(22個循環于750bar和5個循環于1000bar)將多層分散體作進一步處理。將獲得的脂質體分散體與等體積的在300mM蔗糖中的0.5625mg/ml的siRNA溶液混合，導致核酸主鏈磷酸酯與陽離子脂質氮原子的計算電荷比為大約1到4。通過準彈性光散射(N5 Submicron Particle SizeAnalyzer，Beckman Coulter，Inc.，Miami，FL)測定脂質復合物-分散體的大小為大約120nm。對于體外實驗來說，將這種分散體在包含10％血清的細胞培養基中進一步稀釋為5-20nM siRNA的濃度。
動物實驗在整個本研究中使用無胸腺的雄性裸小鼠(HsdNMRI-nu/nu，8周齡)。對于已建立腫瘤異種移植物的腫瘤治療實驗來說，皮下(s.c.)植入總共5.0×106細胞/100μl(對于3Y1-RasV12在存在50％matrigel的情況下)。對于腫瘤治療實驗來說，通過低壓，小體積的尾靜脈注射靜脈內給藥脂質體siRNA復合物溶液。通過改變注射方案(每天對每兩天)對30g小鼠使用包含0.28mg/ml siRNA和2.17mg/ml脂質(等同于1.88mg/kg siRNA和14.5mg/kg脂質的劑量)的200μl注射體積的貯存溶液來實現不同的給藥劑量。使用測徑器測定腫瘤體積并根據公式體積＝(長×寬2)/2來進行計算。本研究中進行的所有動物實驗都是根據批準的方案并且遵循Landesamt für Arbeits-，Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin，德國(No.G0264/99)的指導方針來進行的。
統計分析將數據表示為平均值±S.E.M.。差異的統計學顯著性是通過Mann-Whitney U檢驗來確定的。P值＜0.05被認為是統計學上顯著的。
在細胞培養物和小鼠中的siRNA-Cy3攝取實驗對于細胞培養物中的非制劑化的siRNA-Cy3分子的攝取研究來說，將HeLa細胞與限定量的siRNA溶液一起在無血清的培養基中溫育過夜。通過如下所述的過夜轉染來實施脂質復合的siRNA-Cy3細胞的攝取。用冰冷的PBS漂洗經處理的細胞并在顯微鏡觀察之前固定于4％甲醛/PBS溶液中達15分鐘。為了標記最近的內體和溶酶體，根據生產商的建議將細胞與熒光染料LysoTracker(Molecular Probes)一起溫育并在固定后通過共焦顯微鏡觀察進行檢查。通過靜脈內施用制劑化的和裸的siRNA來進行利用熒光標記siRNA-Cy3的體內遞送實驗。以最終劑量為1.88mg/kgsiRNA-Cy3和14.5mg/kg脂質的單次200μl靜脈內注射來處理小鼠。在限定的時間點上處死小鼠并通過對甲醛固定的，石蠟包埋的或OCT安置的冷凍組織切片的顯微觀察檢查熒光吸收。
體外轉染人HUVEC，HeLa，PC-3細胞系以及鼠EOMA和NIH3T3細胞系獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)并根據ATCC’s的建議進行培養。人肝細胞瘤細胞系HuH-7可在MDC，柏林獲得。根據描述38通過可誘導RasV12的轉導產生表達致癌性RasV12的大鼠3Y1細胞。
利用上述陽離子脂質體以siRNA轉染細胞系。簡言之，在細胞接種之后大約12小時，向細胞中加入不同量的在包含血清的培養基中稀釋的siRNA-脂質復合物溶液以達到1-50nM范圍的siRNA的轉染濃度。在轉染后(48h)將細胞裂解并如所述20進行免疫印跡法。下列抗體用于免疫印跡法兔抗-PTEN(Ab-2，Neomarkers)，單克隆p110α/p8539，兔抗-PKN338，山羊抗-CD31(Santa Cruz Biotechnology)，兔抗-CD34(Santa CruzBiotechnology)，兔抗-磷酸化Akt(S473)(Cell Signaling Technology)。
體內BrdU測定法為了測量體內細胞增殖，通過腹膜內注射用BrdU(Sigma；250mg/kg)處理小鼠并在兩小時后處死。根據生產商的方案(BrdU原位檢測試劑盒，Pharmingen)，將甲醛固定的石蠟包埋的肝或腫瘤組織切片進行BrdU染色。
微血管密度(MVD)的測定通過在單一腫瘤切片的3-8個隨機選擇區域中計數CD31-/CD34-陽性血管來測定微血管的數目24。將血管數目作為血管單位來估計而不管形狀、分枝點和腔大小(稱作“血管數目”)。此外，通過利用Axiovision 3.0軟件(Zeiss)測定CD31-/CD34-陽性血管結構的總長度(稱作“血管長度總和”)來評估血管密度。通過用Zeiss Axioplan光學顯微鏡于200x放大倍率掃描腫瘤切片進行計數。
組織學分析和顯微術在處死小鼠后，將組織立即固定于4.5％經緩沖的甲醛中持續16小時并由此進行處理用于石蠟包埋。切出4μm切片并置于玻璃載玻片上。用山羊多克隆抗-CD31/PECAM-1(1∶1000，Santa Cruz Biotechnology)(或者對于冷凍切片大鼠CD31，1∶100，Pharmingen)和大鼠單克隆抗-CD34(Cedarlane)對組織切片進行染色以顯現石蠟切片中的內皮細胞。根據標準方案對于石蠟組織切片進行免疫組織化學和蘇木精/曙紅(H&E)復染色。對于熒光標記的siRNAs的體內吸收研究，用Zeiss Axioplan顯微鏡通過表面熒光對石蠟切片進行直接檢查。記錄圖像并利用Zeiss LSM5成像軟件進行處理。在siRNA吸收的深度顯微分析中，用Zeiss LSM510 Meta共焦顯微鏡來進行。為此，用二甲苯對切片進行脫蠟，通過分級乙醇洗滌進行再水合，用Sytox Green染料(Molecular Probes 100nM；10min)進行復染色，漂洗并最后安置于FluorSave(Calbiochem)中用于顯微鏡檢查。利用下列抗體，如所述40的那樣進行NIH3T3細胞的免疫熒光染色免疫組織化學特異性兔抗磷酸化-Akt(S473)(Cell Signaling Technology)和小鼠抗α-微管蛋白(DM1A，Calbiochem)。
表1在實施例24-27中所用的siRNA序列siRNA名稱序列5′-3′PKN3sgagagccuguacugcgagaPKN3asucucgcaguacaggcucucPTEN s ccaccacagcuagaacuuaPTEN asuaaguucuagcugugguggPTEN s(對照)ccaccacagcuagaacuua
PTEN as(對照)uaaguucuagcugugguggPTEN s ccaccacagcuagaacuuauaaguucuagcugugguggPTEN as-Cy3 -Cy3CD31-1s ccaacuucaccauccagaaCD31-1asuucuggauggugaaguuggCD31-2s ggugauagccccgguggauCD31-2asauccaccggggcuaucaccCD31-6s ccacuucugaacuccaacaCD31-6asuguuggaguucagaaguggCD31-8s cagauacucuagaacggaaCD31-8asuuccguucuagaguaucug具有2’-O-甲基修飾的核苷酸帶下劃線。
實施例24體外和體內遞送裸露的和配制的siRNAs在本研究中，我們采用缺少3’-突出端的19-mer siRNA雙鏈體，其通過在兩條鏈上交替2’-O-甲基糖修飾來進行化學穩定化16，其中未修飾的核苷酸面對著在對應鏈上被修飾的核苷酸。實際使用的siRNA分子在實施例23中描述。
在第一步中，我們分析了這些分子是否在缺乏遞送載體的情況下介導細胞培養物中的RNAi。免疫印跡分析顯示與對于siRNA-脂質復合物所用的納摩爾級濃度相比，即使當裸siRNA以微摩爾級濃度應用時也不會發生基因沉默。結果顯示于圖18a中。
由圖18可以更加詳細地看到，關于脂質復合的siRNAs有濃度依賴型的PKN3蛋白表達抑制，但如通過免疫印跡評估，裸siRNA在Hela細胞中沒有抑制。PTEN作為負載對照起作用。
我們還測試了未修飾的常規siRNAs(21-mer，2核苷酸3’-突出端)6和幾種綴合的分子，包括膽固醇綴合的或肽連接的siRNAs，但是在缺乏遞送載體的情況下沒有檢測到內源性蛋白質表達的任何目標特異性減弱(數據未顯示)。
為了分析缺乏基因沉默是否是由于陰離子siRNAs和帶負電細胞膜之間排斥作用產生的效率低的細胞吸收的結果，我們采用了3’熒光(Cy3)標記的siRNAs以便通過共焦顯微鏡來研究它們的吸收。我們，以及其他人在之前已經顯示，當用遞送載體進行轉染時，反義分子3’端的熒光標記并不損害RNA沉默活性16，17。令人驚訝的是，當應用高濃度的siRNA-Cy3分子時在缺乏轉染劑的情況下我們觀察到熒光標記的siRNAs的顯著攝取。不過，如通過LysoTracker標記進行共定位所顯示的，大部分熒光標記好象在后期的內體/溶酶體小泡中結束(end up)，提示未配制的siRNAs保持局限于內體途徑中。相反地，作為脂質體復合物轉染的siRNAs從這些小泡上解離下來并且釋放到細胞質中。這些結果表明siRNAs的脂質體制劑對于siRNAs的功能性遞送提供至少兩種有益效果增強的細胞攝取以及重要地是從內吞/內體途徑逃逸到細胞質中18，在這里發生RNAi-介導的mRNA降解。
圖18b的詳情如下。
圖18b顯示裸的和配制的siRNAs的細胞內分布。在左行和中間行的HeLa細胞中，通過共焦顯微鏡分析熒光標記的siRNAs-Cy3。右行顯示在用LysoTracker(綠色；箭頭，siRNA-Cy3關于內體/溶酶體區室的定位)復染后，亞細胞分布的并接圖片。上排，裸的siRNA-Cy3；下排脂質復合的siRNA-Cy3。
為了分析脂質體制劑是否改變siRNAs的體內藥學特性，我們注射(小體積和低壓力)的單一劑量的siRNA-Cy3分子(1.88mg/kg siRNA)進入小鼠的尾靜脈。包括胰腺、肺、腎和前列腺的幾種器官的顯微分析顯示用配制的siRNAs在Cy3特異性熒光上有顯著的增強(數據未顯示)。在所有分析的時間點上(注射后1h，4h，24h，圖18c)，在用脂質體配制的siRNAs處理的小鼠的肝中都檢測到最高量的熒光。這種結果表明當與裸siRNAs給藥相比時，在脂質復合物中配制的siRNAs分子有更好的生物分布。
不過，在全部器官中增強的生物分布并不一定表明這些分子的細胞內或細胞類型特異性的攝取，所述攝取是經遞送siRNAs的功能性的必要條件。通過共焦顯微鏡對肝中配制的siRNA-Cy3吸收的更加詳細的分析揭示在細胞水平上熒光染色主要存在于血管里層和血竇中(圖18c，下版)。肝血管的更近檢查揭示，與PBS對照相反，內皮層被熒光性siRNA-Cy3清楚地標記(圖18d，上排)。在內皮細胞內，siRNA-Cy3只存在于細胞質中(圖18d，下版)。在未固定的肝冰凍切片中觀察到相同的染色模式，這排除了任何甲醛固定的假象(數據未顯示)。為了測試熒光標記的脂質復合siRNA是否也靶向腫瘤血管系統，我們用siRNA-Cy3脂質復合物的單次靜脈內注射來處理具有不同實驗性腫瘤的小鼠。在所有三個實驗性腫瘤異種移植物(兩個皮下的，s.c.，和一個肝內的，i.hep.)中，我們檢測在腫瘤血管系統中的顯著的熒光信號(圖18e，箭頭)。腫瘤血管系統的內皮層的siRNA-Cy3吸收通過用抗-CD34抗體，內皮細胞標志物進行復染來證實(圖18e，下版)。此外，使用熒光標記的脂質來證實內皮對脂質復合的siRNA的吸收(未顯示)。總體來說，這些數據證實siRNAs的基于陽離子脂質的制劑改善了siRNAs的動力學和分布特性并且使RNAs主要吸收到內皮細胞中。
對于顯示于圖18c中的結果的實驗設置如下。通過單一靜脈內注射施用裸的或脂質復合的siRNA-Cy3，并通過表面熒光顯微鏡術來分析指示時間點的肝組織切片(上版)。下版，肝切片的近距離共焦顯微圖像顯示與脂質復合物(右圖，siRNA-Cy3紅色；細胞核，通過用Sytox Green復染為綠色)比較的未配制的siRNA-Cy3(左圖)的分布。用相同的裝置記錄圖像。比較肝血管(箭頭)和血竇(雙箭頭)的染色強度。
圖18d的細節如下。與PBS處理的對照切片(左版)相反，用熒光siRNA-Cy3(右版)處理肝血管的內皮層。共焦顯微術顯示在肝內皮細胞(紅血細胞，雙箭頭)中配制的siRNA-Cy3的細胞質遞送(紅色，融合)。在細胞核(綠色，箭頭)中沒有未檢測到熒光。
對于在圖18e中顯示的結果的實驗設置如下。用如箭頭指示的脂質體配制的siRNAs靶向不同腫瘤的內皮細胞(siRNA-Cy3，紅色；細胞核，綠色)。上排顯示來自皮下生長的PC-3腫瘤(左版)和RasV12轉化的3Y1大鼠成纖維腫瘤(中版)或肝內生長的HuH-7腫瘤(右版)的切片的熒光圖像。下排顯示在HuH-7腫瘤的內皮細胞中的脂質體遞送的siRNA-Cy3的檢測。通過H&E染色顯示腫瘤內皮細胞(左版)，特征在于它們的薄的細胞質和突出的核(箭頭)。連續切片分別顯示內皮細胞的相應的siRNA-Cy3熒光(紅色，中間版)和抗-CD34免疫染色(右版)。
實施例25PTEN特異性siRNAs向肝和腫瘤內皮細胞的功能性遞送為了證實siRNA-脂質復合物體內沉默內皮細胞中的內源基因表達的能力，我們選擇腫瘤抑制劑PTEN，磷酸肌醇3-激酶(PI 3-激酶)的拮抗劑作為靶標。我們意欲通過在內皮細胞核中以BrdU摻入測量增加的DNA合成來在陽性讀取系統中檢測PTEN的功能性基因沉默。已知PTEN表達的減少緩慢激活PI 3-激酶信號傳導，這可以通過下游激酶Akt的磷酸化的增加來進行測量19(圖19a)。PI 3-激酶的緩慢激活還伴隨以DNA合成的增加速率20。
首先，通過脂質-介導的轉染體外證實選定的siRNAPTEN(參見實施例23)靶向小鼠和人PTEN mRNA的RNAi活性(圖19a)。將在每個核苷酸上攜帶2’-O-甲基修飾的相同siRNA序列用作陰性對照(siRNA對照)，因為這種統一的修飾模式徹底破壞了RNAi活性16。通過免疫印跡法來觀察PTEN蛋白質擊倒和Akt的增加的磷酸化。免疫熒光研究證實在存在活性siRNAPTEN分子時增加的Akt磷酸化(圖19a)。這證實了siRNAPTEN分子在細胞培養物中激活PI 3-激酶信號傳導的能力。
為了測試體內PTEN基因沉默，連續三天通過低壓，尾靜脈注射，用PBS、裸siRNAPTEN，siRNAPTEN-脂質復合物，或脂質載體來處理小鼠(每組4只)(見方法)。在處理的第4天，將BrdU注射到小鼠中并在2小時后，處死小鼠，通過對肝切片進行免疫組織學染色來測量BrdU陽性細胞核的BrdU結合。內皮細胞的小尺寸和在用磷酸化的Akt和PTEN特異性抗體檢測可靠的信號中的難度不容許原位檢測蛋白質擊倒。然而，與觀察到的熒光標記的siRNA向內皮細胞的細胞特異性遞送一致，我們觀察到在僅具有脂質體siRNAPTEN的肝內皮中BrdU的陽性細胞核的顯著增加(圖19b)。用具有腫瘤的小鼠進行的相似實驗揭示在用脂質體配制的活性PTEN-siRNA處理后，腫瘤內皮的BrdU陽性細胞核的數量上的同樣的增加(圖19c)。相對于PBS對照組，失活的、完全甲基化的對照分子siRNA對照沒有導致BrdU結合的增加。我們從這些數據推論用陽離子脂質配制的穩定的PTEN-特異性siRNAs在體內是功能性的來在系統給藥后誘導內皮細胞中的基因沉默。
圖19a的細節如下。穩定的PTEN特異性siRNA(10nM)的轉染體外減少PTEN蛋白質水平并且增加下游激酶Akt(P*-Akt)的磷酸化，如通過免疫印跡法所揭示(右上版；PI 3-激酶亞基p110α，p85，不受影響的負載對照)。SiRNA對照表示完全甲基化的失活的siRNAPTEN分子；ut，未處理的細胞。磷酸化Akt的增加還通過在用siRNAPTEN轉染的NIH3T3細胞中通過免疫熒光染色來觀察(磷酸化Akt，紅色；作為細胞形態的標志物的抗-α-微管蛋白，綠色)。
圖19b描述顯示在肝樣品中的BrdU陽性內皮細胞核(箭頭)的數量上的顯著不同的代表性圖片(上版)和相應的量化(下面的圖表)，所述肝樣品分別來自用PBS，裸siRNAPTEN，脂質復合的siRNAPTEN，和陽離子脂質體處理的動物。(對于每次處理顯示兩張圖片)。統計學顯著性裸siRNAPTEN對比siRNAPTEN-脂質復合物，*P＝0.0286；脂質體對比siRNAPTEN-脂質復合物*P＝0.0286。
圖19c的詳情如下用對于腫瘤血管系統的BrdU測定法證實脂質復合的siRNAPTEN在DNA合成上的序列特異性。在腫瘤血管中檢測增加的BrdU陽性細胞核(箭頭)，所述血管來自用siRNAPTEN-脂質復合物對比siRNA對照-脂質復合物處理的動物；Tu腫瘤組織。在內皮細胞中的BrdU-陽性細胞核的量化顯著增加siRNA對照-脂質復合物對比siRNAPTEN-脂質復合物*P＝0.032。
實施例26CD31的體內基因沉默為了直接證實體內siRNA介導的基因沉默，我們集中于靶向選擇性在內皮細胞中表達的基因。我們選擇也已知為CD31的血小板-內皮-細胞黏附分子1(PECAM-1)，作為適合的靶標，因為其表達局限于血管系統的細胞，主要是內皮細胞以及血小板、單核細胞、嗜中性粒細胞和選定的T細胞21-23。
在小鼠和人來源的內皮細胞系(HUVEC，EOMA)中篩選2’-O-甲基修飾的siRNA分子(參見實施例23)導致一些有效的人和小鼠特異性CD31-siRNA分子的鑒定(圖20a)。最有效的siRNA分子，siRNACD31-8，如實施例23中描述進行脂質體配制，并且被全身性施用到具有腫瘤的小鼠中達連續2或7天。用等滲蔗糖溶液或用脂質復合的siRNAPTEN處理對照小鼠以測試特異性。處理后，處死小鼠并且在各種組織中通過實時RT-PCR(TaqMan)和免疫印跡法來分析基因沉默。
在用siRNACD31-8-脂質復合物處理的小鼠的腫瘤、肝和肺中觀察到CD31mRNA水平的減少，但是在脾組織樣品中未觀察到。觀察到的CD31mRNA水平的減少指基于mRNA裂解的RNAi-作用模式(圖20b)。此外，與在對照小鼠中觀察到的未變化的蛋白質水平相反，在來自用siRNACD31-8-脂質復合物處理連續2天的小鼠的腫瘤和肝裂解物中檢測到CD31蛋白質水平的顯著減少(圖20c，左版)。
為了測試特異性和等價負載，我們在這些裂解物中平行分析了CD34，另一種內皮細胞標志物蛋白質以及PTEN的蛋白質水平。我們還已經從脾和肺檢查了全細胞提取物，但是在這些器官中通過免疫印跡分析我們沒有檢測到可靠的CD31蛋白質表達(數據未顯示)。通過7天每天一次的靜脈內注射在非腫瘤攜帶小鼠上，在獨立的實驗中證實CD31蛋白質擊倒(圖20c，右版)。
此外，通過在異種移植物腫瘤小鼠模型中，測量內皮細胞標志物CD31和CD34在微血管密度(MVD)中的顯著不同，還原位揭示了在CD31表達中的減少。MVD測量是腫瘤血管發生的替代標志物，并且通過用CD31或CD34特異性抗體來對血管進行免疫組化染色進行分析24-26。將配制的CD31和PTEN特異性siRNAs在攜帶腫瘤的小鼠(腫瘤大小800mm3)中在連續兩天以常規體積(200μl)和常規壓力通過尾靜脈注射來施用配制的CD31和PTEN特異性siRNAs。在第三天，將小鼠處死，并且在分別用CD31和CD34抗體免疫染色后，比較連續的切片之間的MVD。
用脂質復合的siRNACD31-8處理的小鼠顯示在CD31陽性血管的總量中的統計學意義上的減少，如通過血管以及血管長度的總數所測量的(圖20d)。用CD34特異性抗體進行的染色沒有揭示MVD的變化，再次指示特異性CD31沉默。兩個對照組，siRNAPTEN和等滲蔗糖處理的，沒有顯示通過CD31或CD34染色在MVD測量中的不同。該結果以及在mRNA和蛋白質擊倒上的分子數據指示響應于脂質復合的siRNACD31-8的系統施用，在CD31表達中的特異性減少，而在CD34陽性內皮細胞中沒有減少。我們得出結論，體內CD31(PECAM-1)基因沉默可以通過在腫瘤和肝的血管系統中施用陽離子脂質配制的siRNAs來實現。
圖20a的詳情如下。圖20a顯示用于有效CD31擊倒的有效穩定的siRNAs的鑒定。用四個不同的靶向人、小鼠特異性siRNAs的CD31(CD31-1，-2，-6，-8)和對照PTEN-siRNA來轉染HUVEC和鼠EOMA細胞。特異性蛋白質擊倒通過使用抗-CD31和抗-PTEN的免疫印跡法來評估特異性蛋白質擊倒，證實siRNACD31-8分子的最高的功效。
圖20b的細節如下。通過靜脈內注射脂質復合的siRNACD31-8在連續的兩天處理小鼠顯示在某些組織中的CD31mRNA水平的減少，如通過定量TaqMan RT-PCR所揭示。將CD31mRNA的相對量標準化為PTEN mRNA水平。
圖20c的詳情如下。通過使用抗-CD31抗體和抗-PTEN以及抗-CD34(另一種內皮細胞標志物蛋白質)以來自肝和腫瘤的提取物進行免疫印跡分析來顯示等價的蛋白質負載來證實在用siRNACD31-8-脂質復合物系統處理的小鼠中的CD31蛋白質擊倒。通過在兩天(左版肝和腫瘤)或連續七天(右版肝)通過靜脈內注射來處理小鼠。在siRNACD31-脂質復合物處理的動物的肝和腫瘤中觀察到CD31蛋白質擊倒(見動物2，左版)，但是在用等滲的蔗糖溶液處理的小鼠或siRNAPTEN-脂質復合物處理的小鼠(見動物1，3)中未觀察到。關于7天處理方案，與對照動物4，7和8相反，在動物5和6中觀察到顯著的CD31擊倒(右版)。在HUVEC細胞中平行證實用于體內研究的siRNACD31-8-脂質復合物的功能性(10nM siRNA)。
圖20d的詳情如下。通過對石蠟腫瘤切片進行免疫染色來直接評價CD31蛋白質的體內擊倒，所述腫瘤切片來自用等滲蔗糖、siRNACD31-8-脂質復合物和siRNAPTEN-脂質復合物處理的相應的小鼠。用抗-CD31和抗-CD34抗體分別對連續的切片進行染色以觀察腫瘤的血管系統。在來自用siRNACD31-8-脂質復合物處理的小鼠的腫瘤切片中觀察到關于CD31，而非CD34的減少的染色強度。CD31陽性血管的MVD量化(通過血管的數量、上面的圖表，和血管的總長度，下面的圖表所確定)顯示在來自siRNACD31-8-脂質復合物處理的小鼠的樣品中的減少的MVD。通過CD34陽性血管的MVD測量沒有觀察到這種不同。
與本文公開的抗-CD31 siRNA分子相關，要注意的是，本申請的公開內容涉及任何抗-CD31 siRNA分子并且更優選地顯示修飾模式的抗-CD31siRNA，所述抗-CD31 siRNA在本文顯示和描述諸如與抗CD31-8 siRNA分子相關公開的。
實施例27在腫瘤模型中系統施用siRNACD31-脂質復合物的功效在該實施例中，我們致力于針對CD31/PECAM-1的配制的siRNAs是否顯示在腫瘤生長上的任何治療功效的問題。
CD31涉及參與血管/血小板形成和功能的多樣細胞機制23，27，28，但是其在腫瘤生長中對于新血管發生的可能的作用迄今尚未得到研究。用于治療方法所選的siRNA分子包括特異性siRNACD31-8和iRNAPTEN作為對照分子。在體內實驗前，在HUVEC中以劑量依賴轉染實驗測試了用于體內功效研究的siRNACD31-8-和siRNAPTEN-脂質復合物。證實這些siRNA-脂質復合物的功能性和效力的代表性免疫印跡法顯示于圖21a中。
用這些制劑，以低的亞-毫微摩爾范圍的siRNACD31-8實現CD31蛋白質的擊倒。介導基因沉默的siRNACD31-8的特異性通過探測PTEN、磷酸化Akt和CD34來證實。不象用siRNAPTEN進行的轉染，Akt的磷酸化狀態在HUVEC細胞中沒有被CD31的減少所影響。當與未處理的對照相比時，用兩種脂質復合物都未改變CD34蛋白質的水平。在具有兩種不同類型的皮下腫瘤異種移植物的小鼠中研究了系統施用CD31-siRNA-脂質復合物的潛在治療效果。
首先，我們確定了容許使用不同的脂質復合物每日劑量的重復系統處理的方案。通過每天一次施用或每兩日一次施用尾靜脈注射200μl脂質復合物溶液(單一劑量1.88mg/kg/d siRNA；14.5mg/kg/d脂質)來實現不同的總的劑量。我們沒有觀察到對動物健康的嚴重毒性作用，如通過監測作為一般健康的總體標志物的體重的變化所評估的(圖21b)。
隨后，我們分析在siRNACD31-8-脂質復合物對腫瘤生長抑制上的功效研究中的表示每日一次或每兩日一次靜脈內處理的兩種給藥方案。用脂質復合的siRNACD31-8的兩種處理方案導致對已建立的、快速生長的3Y1-RasV12皮下異種移植物的明顯抑制作用(圖21c)。顯而易見地，對于這種特別的腫瘤異種移植物而言，每兩日一次的方案改善了對腫瘤生長的抑制作用。當與siRNAPTEN-脂質復合物以及蔗糖處理對照組比較時，這種抑制是統計學上顯著的(圖21c)。
在另外的實驗中，與siRNAPTEN對照相反，用脂質體配制的siRNACD31-8對緩慢生長的皮下PC-3腫瘤異種移植物進行系統處理類似地導致腫瘤生長的顯著延緩(圖21d)。總體而論，體內異種移植物實驗明顯證實在裸鼠中腫瘤細胞的生長可以通過脂質體配制的CD31-siRNAs的系統施用而受到抑制。這些數據還顯示，CD31(PECAM-1)，一種非經典的藥物靶標，似乎是基于RNAi的抗-血管發生的治療干預的適合靶標。
圖21a的詳情如下。在HUVEC中，將脂質復合的siRNA的質量控制和功效測試用于全身性腫瘤處理。使用抗-CD31抗體的免疫印跡法揭示在siRNACD31-8的情形中CD31的濃度依賴型擊倒，但是在對照siRNAPTEN沒有觀察到這種擊倒。與siRNAPTEN對照相反，CD31的減少對于PI 3-激酶信號傳導沒有影響，如通過監測Akt磷酸化狀態(P*-Akt)所揭示的。CD34蛋白質水平沒有受到影響。
圖21b的詳情如下。監測兩種不同的siRNA-脂質復合物劑量對體重的影響。將不同的siRNAPTEN-脂質復合物劑量(正方形導致1.88mg/kg/dsiRNA和14.5mg/kg/d脂質的每日一次注射；菱形每兩日一次注射(8h間隔)，3.75mg/kg/d siRNA和28.9mg/kg/d)施用達連續7天，測量體重中的變化并且標繪作平均值(n＝7只小鼠)。出于比較，顯示用等滲的蔗糖溶液(圓形)處理的動物的體重(平均值±S.E.M.)。
圖21c和21d的詳情如下。通過CD31-siRNA-脂質復合物處理來抑制腫瘤生長。在裸鼠皮下建立兩種不同的腫瘤異種移植物(c3Y1-RasV12，dPC-3)(c左圖表n＝8小鼠/組，右，n＝7小鼠/組；dn＝8/組)。用siRNACD31-8-脂質復合物(菱形)、siRNAPTEN-脂質復合物(三角形)或等滲蔗糖(實心球形)來處理具有腫瘤的小鼠。如所示應用不同的處理方案；單箭頭，每日一次；雙箭頭，每兩日一次。(c)通過應用每兩日一次給藥方案，當與siRNAPTEN-脂質復合物比較時，建立的3Y1-RasV12腫瘤的生長被siRNACD31-8-脂質復合物顯著抑制(右面圖表)。(d)如所示，與處理施用的siRNAPTEN-脂質復合物比較，建立的PC-3異種移植物的生長被siRNACD31-8-脂質復合物顯著抑制(1.88mg/kg/d siRNA；14.5mg/kg/d脂質；箭頭)。數據表示平均值±S.E.M.；顯著性按照Mann-Whitney，*P＜0.05。
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在說明書中公開的本發明的特征，權利要求和/或附圖都可以單獨地和以其任何組合作為理解以其各種形式存在的本發明的材料。
序列表<110>阿圖根股份公司<120>脂質、脂質復合物及其應用<130>A 19025PCT<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>PTEN特異siRNA的反義鏈<220>
<221>misc_feature<223>PTEN特異siRNA分子的反義鏈<400>1uaaguucuag cuguggugg 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>PTEN特異siRNA分子的有義鏈<400>2ccaccacagc uagaacuua 19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>T-Ras特異si RNA分子的有義鏈<220>
<221>misc_feature<223>T-Ras特異si RNA分子的鏈<400>3aacguguaga aggcauccu 19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>T-Ras特異si RNA分子的有義鏈<220>
<221>misc_feature
<223>T-Ras特異si RNA分子的鏈<400>4aggaugccuu cuacacguu 19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>PKN3特異si RNA分子的有義鏈<400>5gagagccugu acugcgaga 19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>PKN3特異si RNA分子的反義鏈<400>6ucucgcagua caggcucuc 19<210>7<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>PTENspecif ic si RNA分子的有義鏈<220>
<221>misc_feature<223>PTEN特異si RNA分子的有義鏈<400>7ccaccacagc uagaacuua 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>PTEN特異si RNA分子的反義鏈<220>
<221>misc_feature<223>PTEN特異si RNA分子的反義鏈<400>8uaaguucuag cuguggugg 19<210>9<211>19
<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>對照PTEN特異si RNA分子的有義鏈<400>9ccaccacagc uagaacuua19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>對照PTEN特異si RNA分子的反義鏈<400>10uaaguucuag cuguggugg19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>PTEN特異si RNA分子的有義鏈<400>11ccaccacagc uagaacuua19<210>12<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>在3’端具有Cy3的PTEN特異si RNA分子的反義鏈<400>12uaaguucuag cuguggugg19<210>13<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>CD 31特異si RNA分子(CD31-1)的有義鏈<400>13ccaacuucac cauccagaa19<210>14<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature
<223>CD 31特異si RNA分子(CD31-1) 的反義鏈<400>14uucuggaugg ugaaguugg 19<210>15<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>CD 31特異si RNA分子(CD31-2)的有義鏈<400>15ggugauagcc ccgguggau 19<210>16<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>CD 31特異si RNA分子(CD31-2)的反義鏈<400>16auccaccggg gcuaucacc 19<210>17<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>CD 31特異si RNA分子(CD31-6)的有義鏈<400>17ccacuucuga acuccaaca 19<210>18<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>CD 31特異si RNA分子(CD31-6)的反義鏈<400>18uguuggaguu cagaagugg 19<210>19<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>CD 31特異si RNA分子(CD31-8)的有義鏈<400>19cagauacucu agaacggaa 19
<210>20<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>CD 31特異si RNA分子(CD31-8)的反義鏈<400>20uuccguucua gaguaucug19
權利要求
1.按照式(I)的化合物 其中R1和R2各自并且獨立地選自包含烷基的組；n是介于1和4之間的任何整數；R3是選自包含賴氨酰、鳥氨酰、2，4-二氨基丁酰、組氨酰的組的酰基和按照式(II)的酰基部分， 其中m是1-3的任何整數，且Y-是藥用陰離子。
2.按照權利要求1的化合物，其中R1和R2各自并且獨立地選自包含十二烷基、十四烷基、十六烷基和油基的組。
3.按照權利要求1和2中任一項的化合物，其中R1是十二烷基且R2是十四烷基；或R1是十六烷基，且R2是油基。
4.按照權利要求1-3任一項的化合物，其中m是1或2。
5.按照權利要求1-4任一項的化合物，其中所述化合物是陽離子脂質，優選地與陰離子Y-締合。
6.按照權利要求1-5任一項的化合物，其中Y-選自包括鹵化物、乙酸鹽(酯)和三氟乙酸鹽(酯)的組。
7.按照權利要求1-6任一項的化合物，其中所述化合物選自包括下列各項的組-β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物 -β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十二烷基-N-十四烷基-酰胺三鹽酸化物 和-ε-精氨酰-賴氨酸-N-十二烷基-N-十四烷基-酰胺三鹽酸化物
8.一種組合物，其包括作為脂質組分的按照權利要求1-7任一項的化合物、和載體。
9.按照權利要求7的組合物，其中所述組合物包括另一種組分。
10.一種藥物組合物，其包括按照權利要求1-7任一項的化合物和藥物活性化合物以及優選地藥用載體。
11.按照權利要求8-10任一項的組合物，其中所述藥物活性化合物和/或所述另一種組分選自包括下列各項的組肽、蛋白質、寡核苷酸、多核苷酸和核酸。
12.按照權利要求11的組合物，其中所述蛋白質是抗體，優選地是單克隆抗體。
13.按照權利要求11的組合物，其中所述核酸選自包括DNA，RNA，PNA和LNA的組。
14.按照權利要求11或13任一項的組合物，其中所述核酸是功能性核酸，其中優選地，所述功能性核酸選自包括下列各項的組RNAi，siRNA，siNA，反義核酸，核酶，適體和spiegelmers。
15.按照權利要求8-14任一項的組合物，所述組合物還包括至少一種輔助脂質組分，其中優選地所述輔助脂質組分選自包括磷脂和類固醇的組。
16.按照權利要求15的組合物，其中所述輔助脂質組分選自包括下列各項的組1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和1，2-二油基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。
17.按照權利要求15-16任一項的組合物，其中所述輔助脂質組分的含量從所述組合物的總脂質含量的約20mol％到約80mol％。
18.按照權利要求17的組合物，其中所述輔助脂質組分的含量從約35mol％到約65mol％。
19.按照權利要求16-18任一項的組合物，其中所述脂質是β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，所述輔助脂質是1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。
20.按照權利要求19的組合物，其中所述脂質是所述組合物的總脂質含量的50mol％，所述輔助脂質是所述組合物的總脂質含量的50mol％。
21.按照權利要求8-20任一項的組合物，其中所述組合物包含至少兩種輔助脂質。
22.按照權利要求21的組合物，其中至少一種輔助脂質包含選自包括下列各項的組的部分PEG部分、HEG部分、聚羥基乙基淀粉(polyHES)部分和聚丙烯部分，其中該部分優選地提供約500-10000Da的分子量、更優選地約2000-5000Da的分子量。
23.按照權利要求21或22的組合物，其中包含PEG部分的輔助脂質選自包括下列各項的組1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，1，2-二烷基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺；和神經酰胺-PEG。
24.按照權利要求23的組合物，其中所述PEG部分具有約500Da到10000Da的分子量、優選地約2,000到5,000Da的分子量、更優選地2,000Da的分子量。
25.按照權利要求24的組合物，其中所述組合物包含作為脂質組分的β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，作為第一輔助脂質的1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和作為第二輔助脂質的1，2-二硬脂酰(disteroyl)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG2000。
26.按照權利要求25的組合物，其中所述第二輔助脂質的含量是約0,05mol％到4,9mol％、優選地約1到3mol％。
27.按照權利要求26的組合物，其中所述脂質的含量是45mol％到50mol％，第一輔助脂質的含量是45到50mol％，并且在存在PEG化的第二輔助脂質的條件下，所述第二輔助脂質的含量是約0,1mol％到約5mol％，優選地約1-4mol％，且更優選地約2％，其中所述脂質、所述脂質、所述第一輔助脂質和所述第二輔助脂質的含量的總和是100mol％，并且其中所述第一輔助脂質和所述第二輔助脂質的總和是50mol％。
28.按照權利要求21-27任一項的組合物，所述組合物含有a)50mol％的β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，48mol％的1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺；和2mol％1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG2000.或b)50mol％的β-L-精氨酰-2，3-L-二氨基丙酸-N-十六烷基-N-油基-酰胺三鹽酸化物，49mol％1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺；和1mol％N(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，優選其鈉鹽。
29.按照權利要求8-28任一項的組合物，其中所述功能性核酸是雙鏈核糖核酸，其中所述組合物還包含核酸，優選地功能性核酸，其更優選地是雙鏈核糖核酸，并且更優選地是選自包括下列各項的組的核酸RNAi、siRNA、siNA、反義核酸和核酶，其中優選地RNAi與陽離子脂質的摩爾比率是約0-0.075，優選地約0.02-0.05并且甚至更優選地0.037。
30.按照權利要求8-29任一項的組合物，其中所述化合物和/或輔助脂質組分是作為在水性介質中的分散體存在。
31.按照權利要求8-29任一項的組合物，其中所述化合物和/或所述輔助脂質組分作為在水混溶性溶劑中的溶液存在，其中優選地所述溶劑選自包括乙醇和叔丁醇的組。
32.按照權利要求8-31任一項的組合物，其中所述功能性核酸是雙鏈核糖核酸，優選地選自包括RNAi、siRNA、siNA、反義核酸和核酶的組的核酸，并且其中優選地RNAi與陽離子脂質的摩爾比率是從約0-0.075，優選地從約0.02-0.05，并且甚至更優選地0.037。
33.按照權利要求8-32、優選地29-32任一項的組合物，其中所述組合物含有核酸，其中核酸主鏈磷酸酯與陽離子脂質氮原子的電荷比率是約從1∶1,5-7，優選地1∶4。
34.按照權利要求8-33、優選地29-33任一項的組合物，其中在分散體中的所述顆粒的大小是約120nm。
35.按照權利要求8-34、優選地29-34的任一項的組合物，其中所述分散體是含有約1到100μM siRNA的貯存分散體，其中優選地所述貯存分散體在體內或體外稀釋1∶100到1∶10000，更優選地1∶1000。
36.按照權利要求1-7任一項的化合物或按照權利要求8-35任一項的組合物用于制備藥物的應用，所述藥物優選地用于治療癌癥和/或心血管相關的疾病。
37.按照權利要求36的應用，其中所述藥物用于治療癌癥，其中優選地所述癌癥選自包括實體和非實體腫瘤的組，并且其中更優選地所述實體瘤選自包括下列各項的組胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌和肝細胞癌。
38.按照權利要求35或36的應用，其中所述癌癥涉及選自包括血管發生和新血管發生的組的過程。
39.按照權利要求36的應用，其中所述藥物用于將所述核酸施用到細胞中，所述細胞選自包括下列各項的組內皮細胞、上皮細胞和腫瘤細胞，優選地所述細胞是內皮細胞。
40.按照權利要求39的應用，其中所述內皮細胞是血管系統的內皮細胞。
41.按照權利要求40的應用，其中所述血管系統是來自新血管發生、優選地腫瘤相關的新血管發生的血管系統。
42.按照權利要求40的應用，其中所述血管系統選自包括下列各項的組中肝血管系統、心臟血管系統、腎臟血管系統、胰腺血管系統和肺血管系統。
43.按照權利要求36-42的任一項的應用，其中所述藥物用于系統施用。
44.按照權利要求36-42的任一項的應用，其中所述藥物用于局部施用。
45.按照權利要求36-44任一項的應用，其中所述藥物是診斷劑。
46.按照權利要求1-7任一項的化合物或按照權利要求8-35任一項的組合物作為轉移劑的應用。
47.按照權利要求46的應用，其中所述轉移劑將藥物活性組分和/或另一種成分轉移到細胞、優選地哺乳動物細胞和更優選地人細胞中。
48.按照權利要求47的應用，其中所述細胞是內皮細胞，優選地血管相關的內皮細胞。
49.一種將藥物活性化合物和/或另一種成分轉移到細胞中或穿過膜、優選地細胞膜的方法，所述方法包括下列步驟-提供所述細胞或所述膜；-提供按照權利要求1-7任一項的化合物；-提供所述藥物活性化合物和/或所述另一種成分；和-使所述細胞或所述膜與所述藥物活性化合物和/或所述另一種成分，以及按照權利要求1-7任一項的化合物接觸。
50.一種將藥物活性化合物和/或另一種成分轉移到細胞中或穿過膜、優選地細胞膜的方法，所述方法提供下列步驟-提供所述細胞或所述膜；-提供按照權利要求8-35任一項的組合物；和-使所述細胞或所述膜與按照權利要求8-35任一項的組合物接觸。
51.按照權利要求49和50的方法，其中所述藥物活性化合物包括作為另外的步驟的-在所述細胞中和/或越過所述膜檢測所述藥物活性化合物和/或所述另一種成分。
52.一種用于合成N-十六烷基-油胺的方法，所述方法包括下列步驟-提供油酸；-提供十六烷基胺；-使所述油酸和所述十六烷基胺反應以形成N-十六烷基-油酰酰胺；和-將所述N-十六烷基-油酰酰胺還原成N-十六烷基-油胺，其中所述油酸是至少90％、更優選地95％和最優選地99％純，其中所述百分比是油酸和不同于油酸的任何脂肪酸的摩爾比率。
53.按照權利要求52的方法，其中所述油酸和所述十六烷基胺在室溫反應。
54.按照權利要求52或53的方法，其中所述油酸在將其與所述十六烷基胺反應之前進行預處理，其中所述預處理包括將所述油酸與氯甲酸乙酯、優選地在無水二氯甲烷或無水四氫呋哺中進行反應。
55.按照權利要求52-54任一項的方法，其中所述反應在0℃下、優選地在惰性氣體下進行。
56.按照權利要求54和55的方法，其中所述反應物還與酸清除劑反應，其中所述酸清除劑優選地選自包括三乙胺、二異丙基乙胺和吡啶的組。
57.按照權利要求52-56任一項的方法，其中氯甲酸乙酯、油酸、三乙胺和十六烷基胺的摩爾比率是約1-1.05∶1∶1∶1-3∶1-1.10。
58.按照權利要求52-57任一項的方法，其中使用LiAlH4來進行N-十六烷基-油酰酰胺向N-十六烷基-油胺的還原。
59.按照權利要求52-57任一項的方法，其中在所述油酸與所述十六烷基胺反應后，洗滌所述反應物，并將其進行沉淀，將由此獲得的沉淀物任選地進行再結晶。
60.按照權利要求1-7任一項的化合物或按照權利要求8-35任一項的組合物用于系統給藥、優選地系統給藥于脊椎動物的應用。
61.按照權利要求60的應用，其中所述脊椎動物是哺乳動物，更優選地選自包括下列各項的組的哺乳動物小鼠、大鼠、豚鼠、貓、狗、猴和人。
全文摘要
本發明涉及按照式(I)的化合物，其中R
文檔編號C07C237/00GK1968714SQ200580014157
公開日2007年5月23日 申請日期2005年5月6日 優先權日2004年5月5日
發明者O·凱爾, J·考夫曼 申請人:阿圖根股份公司