專利名稱：：重組人fus1和人il-12的雙基因表達載體、脂質體復合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域，具體涉及人FUSl和人hlL-12的雙基因真核共表達重組質粒載體構建，其陽離子脂質體復合物的制備方法和用途。
背景技術：
：肺癌是當今世界各國常見的惡性腫瘤。也是全世界發病率和死亡率增長最快，對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。目前，肺癌發病率和死亡率在男性均占第一位，在女性發病率占第2位，而死亡率占第一位，肺癌已成為人類的第一殺手。據WH0最新統計，每年全世界估計有超過200萬新肺癌患者，死亡約180萬人[1]。我國形勢更為嚴峻。20世紀70年代以來的30年間，我國腫瘤死亡率呈明顯上升趨勢，70-90年代的20年間，腫瘤總的死亡率上升約30%，而肺癌死亡率上升幅度最為顯著，達到111.85%，進入21世紀，肺癌已成為我國城市人口惡性腫瘤死亡原因的第一位。肺癌給患者本人及家庭造成極大痛苦，也占用了大量的社會資源和財富，肺癌已經成為人類面臨的日益嚴重的公共衛生問題。各國政府都投入了大量的人力和物力，以期在肺癌研究領域有所突破。FUS1是在肺癌中新近發現的一種腫瘤抑癌基因，位于人類染色體3p21.3區，基因序列長3.3kb，含有3個外顯子，編碼110個氨基酸[2]。野生型FUSl是一種N-十四烷酰化的蛋白，FUSl基因的抑癌活性與蛋白質的N-十四烷酰化有關，FUS1蛋白的豆蔻酰化缺失突變使它喪失了抑制肺癌細胞生長、誘導肺癌細胞凋亡和抑制肺癌轉移的作用[3]。最近的研究發現在100。/。的小細胞肺癌和82。/。的非小細胞病人中存在FUSl基因的表達異常W。體外實驗證明FUS1基因轉染肺癌細胞能明顯誘導腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的生長，通過瘤內注入脂質體包裹FUS1基因復合物，在動物體內能明顯抑制肺癌H1299和A549細胞皮下移植瘤；通過靜脈注射脂質體包裹的FUS1基因復合物至A549轉移模型的小鼠能夠明顯減少肺部腫瘤轉移灶的數量[5]。美國AndersonCancer近期研究結果報道^，脂質體包裹FUS1基因復合物的I期臨床實驗取得了很好的結果，在I期臨床試驗中處理了十三個病人，并未發現任何與藥物相關的明顯毒性。所有治療的病人的中位生存期達到14.6月，而那些接受肺癌二線化療藥物治療的肺癌病人，其中位生存期僅為7個月。在I期臨床試驗中未發現脂質體包裹FUS1基因的最大耐受劑量，進一步的臨床試驗尚在進行中。這些研究表明FUS1基因是一種很好的腫瘤轉移抑制基因。此外，研究發現FUS1基因是肺癌發生過程中的早期基因，對于早期肺癌的發生和轉移均具有很好的治療前景。因此，FUS1基因在肺癌的發生和治療中具有非常重要的作用，FUS1基因的異常有可能成為肺癌分子治療的新突破點[7]。眾所周知，白細胞介素12(又名NK細胞刺激因子和CTL成熟因子)，是誘導細胞免疫的關鍵細胞因子，能顯著促進NK細胞、T細胞增殖，促進細胞毒T細胞(CTL)細胞的應答能力，誘導T細胞和NK細胞分泌IFN-y，促使Th細胞向Thl細胞分化等多種生物學活性W。近年來，大量的動物實驗證明IL-12具有強大的抗瘤活性、抗轉移作用以及延長荷瘤動物的生存時間[9]。鑒于IL-12的直接應用給機體帶來了不同程度的毒副作用(發熱、寒顫、惡心、嘔吐等)，人們嘗試著通過基因轉染技術增強機體抗瘤免疫功能，以達到治療腫瘤的目的。IL-12抗腫瘤的研究在美國已進入臨床1期實驗[1<)'11]。目前，IL-12基因治療概括起來主要有兩種方案體外免疫基因治療方案和體內基因治療方案。在體內基因治療方案中，將攜帶IL-12基因的載體直接注射到腫瘤部位，以達到抑制腫瘤生長或使腫瘤完全消退、阻止惡性轉移、抑制遠處腫瘤生長的目的.將攜帶IL212基因的載體直接注射到腫瘤部位，以達到抑制腫瘤生長或使腫瘤完全消退、阻止惡性轉移、抑制遠處腫瘤生長的目的。目前面臨的主要問題是如何選用合適的載體將治療基因有效地導入體內或腫瘤內，在此方面很多學者先后進行多種嘗試，研究使用的載體主要有質粒載體、病毒載體、非病毒載體等。常規療法之下肺癌可憐的生存率要求有新的治療方法的出現。因而，人們積極尋找手術、放療、化療以外的治療肺部腫瘤的新方法。近年來，肺癌的基因治療(包括替代缺陷的抑癌基因、滅活癌基因、引入自殺基因、免疫基因治療、多藥耐藥基因治療、腫瘤血管基因治療等)取得了長足的進步，有的研究已進入臨床實驗階段[12'13]。雖然這些療法都能不同程度地抑制肺癌的惡性增殖，但臨床效果不佳，原因頗多，其中之一在于肺癌的發生、發展是一個極為復雜的生物學過程，在這一進程中涉及到多基因(10到20個基因)的異常以及各種其他因素的作用[14]，其中包括抑癌基因的失活和癌基因的激活，即在腫瘤發生、發展的各個階段，涉及到多個基因的變化，功能失常的癌基因發揮各自不同的作用，在時間和空間上互相配合、協同作用，激活細胞增殖或抑制細胞凋亡，使細胞發生癌變。而單一基因治療只能作用于腫瘤發生、發展過程中的某一個環節，并且一種抗腫瘤基因的作用不夠強大、作用又有限，無法抑制住腫瘤細胞增殖，因此，單一因素的糾正往往不能達到理想的抑制肺癌的效應，只有向腫瘤細胞內導入多種相關基因，最大限度的利用各個基因的優點，通過基因間的相互協同作用，以求優勢互補，才能提高治療效果，使肺癌得以抑制。此外，肺癌中已經取得成效的基因治療途徑多是局限在固體腫瘤，即通過瘤內注射的方式進行治療，但是對于象肺癌這種全身性擴散的腫瘤，由于缺乏既能通過靜脈較好地將基因傳送到目的器官，同時又安全低毒的基因治療的載體，這方面的研究進展還受到一定的限制。癌癥基因治療目前主要策略集中于三個方面，一是引入腫瘤凋亡調節基因，如p53，二是引入抑制腫瘤血管生長的基因，如endostatin，三是引入免疫基因，如IL-2。引入凋亡基因及血管生長抑制基因的有效性已被多數研究所證實，但其效應的發揮必須依賴于高效的轉染效率和抑制作用的持續發揮，而采用免疫基因的優勢在于只需要部分轉染腫瘤細胞即可誘發腫瘤免疫，但在腫瘤負荷較大的情況下收效甚微。因此，目前基因治療的一個理想的策略是采用多基因的聯合治療。腫瘤聯合基因治療就是聯合應用幾種不同機制的目的基因以求獲得更佳的抗腫瘤效果。腫瘤的發生與發展的復雜性決定了基因治療策略的多樣性，在腫瘤的治療中，可聯合使用多個外源目的基因，使之發揮各自的作用，以達到協同治療的目的，比采用單一基因進行治療效果更加顯著[15]。多基因聯合治療具有更大的合理性與優越性，將極大地提高腫瘤基因治療的效果，將是腫瘤基因治療發展的必然方向。目前在聯合基因治療中，一般基因聯合的方式有兩種一是多個攜帶不同基因的獨立載體系統同時轉染靶細胞[16'17]。這種方式雖然可以自由調節各表達載體的比例，但載體的選擇、構建工作繁瑣，影響因素較多，比如針對不同的基因要選擇不同的載體，需要完成多輪構建過程[18]。為了實現治療目的，還需要多個載體共同轉染靶細胞，這樣就大大降低了實現效率[19]。此外，多個目的基因轉染至靶細胞時，由于轉染過程存在一定的隨機性，使得靶細胞中存在基因拷貝并不均一，有些過多，而有些正相反，這一方面不利于目的基因的表達及后續治療，另一方面也導致實驗結果難于評估分析[2<)'21]。因此，這些缺點限制了多載體系統的進一步應用。二是將兩個或兩個以上的基因由一個載體攜帶表達[22—24]。這種策略可以通過多啟動子載體、融合基因或多順反子載體等多種載體形式及調控手段提高基因轉移效率，增加表達強度，維持相對的表達比例，從而克服了前者的不足。因為具備這些優點，近來利用多基因載體進行基因治療得到了研究者的日益重視。在基因治療研究中，多基因表達載體同樣分為病毒載體和非病毒載體。在前者中，單純皰疹病毒、逆轉錄病毒以及慢病毒等都可用于構建多基因表達載體。ShusukeMoriuchi等[22]報道利用單純皰疹病毒分別構建了共表達胸苷激酶(TK)和TNF-a以及TK和IicBa的載體，均得到了顯著提高腫瘤細胞殺傷療效的結果。Gonzalez-Nicolini等。^以逆轉錄病毒為基礎，構建了可在哺乳動物細胞中同時表達三種基因的載體，此外，JAKOBREISER等。^也成功構建出基于慢病毒的多基因表達載體用于艾滋病的治療。非病毒載體主要以質粒載體為主，盡管質粒載體在轉移效率上遜色于病毒載體，在靶細胞內的表達時間也不盡如人意，但其結構簡單、易于制備、能攜帶較大片段的外源基因以及較病毒載體更為安全，這些優點為質粒載體贏得諸多研究者青睞。據統計，截至2007年，美國業已批準的基因治療臨床試驗當中，以質粒為載體的研究僅次于逆轉錄病毒和腺病毒載體[27]。基于質粒的多基因表達載體，不少研究者也進行了這方面的嘗試。如YuanZhang等。"以pcDNA3為基礎，構建了CD-TK雙自殺基因共表達系統，用于多要耐藥的神經膠質瘤細胞的治療研究，取得了滿意的結果。腺病毒具有親肺的特性，可感染分裂和非分裂細胞，在肺內轉化的效率較高;不整合到染色體中，安全性較好。因Adv不會整合到宿主染色體中特點使其成為體內基因治療和肺癌基因治療最常用的一種方法[28]。其缺陷主要是因其不整合到染色體上，因而隨細胞分裂會丟失，不能獲得穩定而持久地表達;腺病毒編碼蛋白可以激發機體的免疫反應，使病毒載體很快清除，同時由于全身用藥可能產生致命的過敏反應，只能用于局部注射的腫瘤治療.影響穩定的治療效果，缺乏特異性[29]。通過腺病毒介到基因的局部腫瘤治療雖然已經取得了一些成績，但是由于病毒載體的毒性和不能有效將目的基因傳送到耙器官，使用這種治療方式用于治療如肺癌，乳腺癌，結腸癌等這些全身擴散的腫瘤疾病顯然存在一定的局限。因此，急需發展有效但不能激發機體免疫反應，能夠全身給藥的安全的基因治療的載藥系統.雖然，目前將治療基因導入作用耙點的方式主要是病毒載體仍占主流，但由于非病毒載體主要是DNA的生物安全性和易于大規模制備，并且能夠誘導良好的免疫反應，從而得到越來越廣泛的重視和應用。脂質體是一種定向藥物非病毒載體，屬于靶向給藥系統的一種新劑型。利用其獨有的特性，它可以將毒副作用大、在血液中穩定性差、降解快的藥物包埋在直徑為納米級的脂質體微粒中，這種微粒具有類細胞結構，可以透過人體病灶部位血管內皮細胞間隙到達病灶部位，進入人體的自身免疫功能，并改變被包封藥物的體內分布，使藥物主要在肝、脾、肺和骨髓等組織器官中積蓄，從而提高藥物的治療指數，減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒性，以達到定向給藥的目的。近年美國FDA已經批準上市的脂質體藥物品種有兩性霉素、多柔比星和柔紅霉素，而阿霉素脂質體TLCD99、兩性霉素B脂質體、慶大霉素脂質體和丁胺卡鈉霉素等幾個脂質體產品也已經進入臨床試驗。國內開發申報的注射用紫杉醇脂質體和注射用兩性霉素B脂質體也已獲準上市，還有十余種脂質體藥物處于臨床研究或技術審評階段，但都是包裹化學合成藥或蛋白制劑。由于脂質體的緩釋作用和能夠顯著增強DNA的穩定性，同時，脂質體作為載體還可同時增強機體的體液免疫和細胞免疫能力，大大減少DNA的用量，因此，用脂質體包裹DNA用于疾病研究的報道越來越多，其中使用最廣泛的是陽離子脂質體[3<)'31]。陽離子脂質體是近年發展起來的最有前途的非病毒載體，免疫原性低、毒性小、適合大批量生產，對其所轉移的基因大小無限制，在實際應用中安全經濟，已經進入I期臨床實驗"」'"」。陽離子脂質體與DNA除通過靜電作用吸附外，還可能有效地中和帶負電荷的DNA，從而導致DNA的結構上的相應"倒塌"，"倒塌"的DNA由于裸露的表面積變小，所以能夠被脂質體有效地包住，從而更有利于防止核酸酶對DNA的降解以及復合物進入細胞。有研究表明陽離子脂質體特別適宜一些組織如肺腫瘤的基因轉移。當靜脈給予脂質復合物時，肺部腫瘤組織是目的基因表達水平最高的器官，這主要與呼吸道細胞對陽離子脂質的親和性高有關。陽離子脂質體(liposomes)可通過膜融合作用或細胞吞噬作用將外源DNA轉導入腫瘤細胞，這種方法在肺癌基因治療中已顯示了特殊效果，并且全身注射使用陽離子脂質體沒有發現明顯的器官相關毒性[34'35]。1.ParkinDM，BrayF，Ferlay丄etal.Globalcancerstatistic,2002.CA-CancerJClin.2005;55:74-1072.M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發明內容本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種能同時表達人FUS1蛋白與人IL-12蛋白的雙基因表達載體。該載體為重組質粒載體，裝載有編碼人FUS1蛋白的基因與人IL-12蛋白的基因，能在真核細胞中同時表達人FUS1蛋白與人IL-12蛋白。其中，上述編碼人FUS1蛋白的基因與編碼人IL-12蛋白的基因分別處于不同啟動子的控制之下表達。其中，上述人FUS1蛋白的編碼基因具有SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，所述人IL-12的編碼基因具有SeqIDNo.6所示的核苷酸序列。其中，上述編碼FUSl的基因處于hFerHProm啟動子的控制之下表達。其中，上述編碼FUS1蛋白的基因所在表達框的構成是從5'到3'方向依次為hFerHProm啟動子、編碼人FUS1蛋白的基因序列、EFlpAn加尾信號。其中，上述編碼人IL-12蛋白的基因處于hFerLprom啟動子的控制之下表達。其中，上述編碼人IL-12蛋白的基因所在表達框的構成是從5'到3'方向依次為hFerLprom啟動子、編碼人IL-12蛋白的基因、SV40pAn加尾信號。進一步的，上述重組質粒載體具有SEQIDNo.7所示的核苷酸序列。本發明所要解決的第二個技術問題是提供上述的重組質粒載體的脂質體復合物。該脂質體復合物中脂質體和重組質粒載體的重量比為56:1。其中，上述脂質體是DOTAP和CH0L制成，用量配比為摩爾比l:l。本發明所要解決的第三個技術問題是提供上述的重組質粒載體或脂質體復合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。本發明所要解決的第四個技術問題是提供一種抗腫瘤藥物。該抗腫瘤藥物是上述的重組質粒載體或脂質體復合物作為主要活性成分添加藥學上可接受的輔助性成分制備而成。根據本發明的第一個方面，提供了一種含有上述的FUS1和IL-12基因的真核共表達重組載體。這些能攜帶本發明重組FUSl和hlL-12基因的各種載體是本領域已知的，如腺病毒、質粒和其他的經加工后可以含有本發明FUS1和IL-12雙基因序列的原核和真核載體。由于腺病毒載體其不整合到染色體上，因而隨細胞分裂會丟失，不能獲得穩定而持久地表達；腺病毒編碼蛋白可以激發機體的免疫反應，使病毒載體很快被清除，同時由于靜脈全身用藥可能產生致命的過敏反應，只能用于局部注射的腫瘤治療，影響穩定的治療效果，缺乏特異性。通過腺病毒介導基因的局部腫瘤治療雖然已經取得了一些成績，但是由于病毒載體的毒性和不能有效將目的基因傳送到耙器官，使用這種治療方式用于治療如肺癌、乳腺癌、結腸癌等這些全身擴散的腫瘤疾病顯然存在一定的局限。因此，需要選擇有效但不能激發機體免疫反應，能夠全身給藥的安全的基因治療的載藥系統。優選的，所述載體為DNA質粒載體。由于要實現雙基因在同一個載體上的同時表達，同時還要轉染真核細胞，因此，進一步優選的，質粒載體為PVITR02-neo-mcs。以RT-PCR方法從人肺成纖維細胞MRC-5的總RNA中擴增FUS1基因片段，然后將本發明提供的FUS1基因片段克隆到載體PVITR02上，獲得PVITR02-FUS1表達載體。以P0RF-hlL-12的質粒為模板，PC財廣增hlL-12基因片段，然后將本發明提供的hlL-12基因片段克隆到載體PVITR02上，獲得PVITR02-hlL-12表達載體。然后以PVITR02-FUS1的質粒為模板，PC財廣增FUS1基因片段，FUS1基因經過雙酶切后，定向插入用相同限制性內切酶切成線性的PVITR02-hIL-12真核表達載體上，獲得PVITR02-hIL-12-FUS1雙基因真核共表達載體。本發明另一個方面是提供一種抗腫瘤藥物。該抗腫瘤藥物是由上述的重組質粒載體或者其脂質體復合物添加藥學上可以接受的輔助性成分制備而成。優選的，所述的抗腫瘤基因藥物為雙基因脂質體復合物(Lipo-PVITR02-FUSl-hIL-12，以下簡稱P-I-F)。脂質體的成分及制備方法可以采用是本領域已知的方案。另外，本發明還提供了一種優選的脂質體方案，為DOTAP及膽固醇(Choi)組成脂質體，優選的配比為mol/mohl:l，優選的脂質體與DNA的比例為6:1。本發明脂質體配方獨特，通過在陽離子脂質中添加適當比列的膽固醇，很好地提高了脂質體的穩定性，并且出人意料的是與常用的陽離子脂質體(D0PE/D0TAP)相比，其穩定性和包封質粒載體后的轉染效率均同時得到了提高。添加藥學上可接受的輔助性成分制備成的FUSl和hlL-12雙基因陽離子脂質體藥物注射劑能夠通過促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生長產生抗肺腫瘤轉移的作用。特別需要說明的是，以上生產和操作本發明公開的重組載體和抗腫瘤復合物注射劑的具體技術方法是本領域技術人員已知的，并可按照已描述的技術完成。本發明采用構建雙基因真核共表達質粒實施基因治療，通過靜脈注射將雙基因雙基因陽離子脂質體藥物導入體內，證實了可在體內減少肺部轉移灶的數目和抑制腫瘤的生長，這主要是由于導入基因在體內的表達導致產生了明顯的抗腫瘤作用，并且雙基因藥物的抗腫瘤的作用優于單基因藥物的治療。通過載體介導的hlL-12的基因治療，克服了hlL-12重組蛋白全身應用所導致的毒性反應缺點，為肺癌聯合基因治療提供了新的基因聯合應用方式，并為在此基礎上結合其他的腫瘤治療手段進行肺癌的綜合治療提供了基礎。本發明利用FUSl和hlL-12雙基因脂質體復合物用于肺癌的治療，表達的FUSl和hlL-12能在體內外有效促進腫瘤細胞凋亡，并能在體內抑制腫瘤血管生長，首次證實了FUS1基因和hlL-12的聯合應用能夠發揮促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成的多重作用。更重要的是，本發明獲得的DNA脂質體復合物，可能能夠在體內誘導產生特異的抗腫瘤免疫，增強并延長治療療效。此外，本發明的陽離子脂質體具有特別適宜在一些組織如肺腫瘤的基因轉移中的應用。當靜脈給予雙基因脂質體復合物時，肺部腫瘤組織是目的基因表達水平最高的器官，這主要與呼吸道細胞對陽離子脂質的親和性高有關。并且動物組織HE染色發現全身注射使用雙基因陽離子脂質體復合物沒有發現明顯的器官相關毒性。提高了基因藥物的轉染率，同時能夠連續反復多次使用，避免了病毒載體的毒性及不能長期反復使用的缺點，方便了進一步臨床應用，并由于其雙基因治療的多重效應，大大提高了抗腫瘤的作用，尤其是為肺癌的治療提供了極有前景的基因治療藥物。圖l人FUS1基因全長片段的PCR產物電泳圖譜(1%Agarose電泳)。M:marker;l:全長FUS1PCR產物，全長片段約356bps，與理論預測值一致。圖2:重組PVITR02-FUS1質粒載體構建酶切電泳圖M:Marker;1:Agel和Clal雙酶切片段用限制性內切酶Agel和Clal切成6100bp的線性PVITR02真核表達載體和356bp的FUSl，結果與預期相符。圖3人hlL-12基因全長片段的PCR產物電泳圖譜(1%Agarose電泳)。M:marker;1:全長IL-12PCR產物，全長片段約1611bp，片段與預期一致.圖4:重組PVITR02-hIL-12質粒載體構建酶切電泳圖.M:Marker;1:SgrAl和Nhel雙酶切片段；限制性內切酶SgrAl和Nhel切成6100bp的線性的PVITR02真核表達載體和1611bp的hIL-12，結果與預期一致。圖5.PVITR02-IL12-FUS1雙基因真核共表達載體的構建酶切電泳圖M:Marker;1:SgrAl和Nhel雙酶切片段.2:Agel和Clal雙酶切片段；用限制性內切酶Agel和Clal切成6100bp的線性PVITR02真核表達載體和356bp的FUSl，用限制性內切酶SgrAl和Nhel切成61OObp的線性PVITR02真核表達載體和161lbp的hIL-12。圖6.雙基因真核共表達質粒DNA脂質體復合物粒徑測定.制備好的陽離子脂質體用馬爾文粒度儀檢測，其粒度曲線顯示粒徑在114nm-212nm左右。圖7驗證雙基因真核共表達質粒中hlL-12基因在RNA水平的表達(24h).M:marker;1:A549;2:PVITR02;3:PVITR02-hIL-12;4:PVITR02-hIL-12-FUS1，500bp處為P—action。圖8:驗證轉染雙基因真核共表達質粒后分泌到細胞上清中hlL-12的表達量.用PVITR02-hIL-12、PVITR02-hlL-12-FUSl轉染A549細胞后24、48小時，收獲細胞，用PBS洗細胞2次。分別提取轉染細胞及未轉染的A549細胞總RNA進行RT-PCR，結果顯示(圖8)，P-I、P-I-F轉染A549細胞后24小時即可檢測到hlL-12蛋白的表達，RT-PC財廣增產物位于426bp附近，只轉染了空載體P和未轉染的A549細胞則沒有該基因的蛋白表達。圖9雙基因真核共表達質粒轉染A549細胞后FUS1表達的WESTERNBLOT分析.M:Marker;1:control;2:純化的FUS1重組蛋白；3.P-F;4:P-1-F用P-1，P-1-F轉染A549細胞48小時后，收獲細胞對其表達產物進行WesternBlot分析，結果顯示轉染P-I-F和P-F的細胞裂解液可與抗FUS1蛋白多克隆抗體結合，條帶位置與FUS1預期蛋白的大小的相符合，而未轉染基因的A549細胞無特異性條帶出現。圖10免疫組化檢測雙基因真核共表達質粒轉染A549細胞后FUS1在細胞內的表達A:未轉染基因的細胞沒有FUS1陽性，且細胞生長狀態良好。B:轉染P-I-F48小時后，部分細胞表現FUS1陽性，并清晰可見FUS1蛋白分布在胞質和核膜。圖ll體外雙基因真核共表達質粒轉染A549細胞后誘導腫瘤細胞凋亡((200X)Hochest染色熒光顯微鏡下觀察轉染48小時后A549細胞變化，P-F組(D)和P-I-F組(E組)可見A549細胞核濃縮、碎片、體積變小及凋亡小體形成，雙基因組(E)中出現的凋亡小體明顯多余單基因組；P-I組(C)和空載體組(B)有少量凋亡小體出現；對照組(A)細胞沒有明顯的改變。圖12.雙基因真核共表達質粒體內抗肺轉移效應(A549裸鼠模型)圖依次為A:對照組(GLu)B:PVITR02組；C:P-F組；D:P-1-F組.結果顯示，P-1-F組(D)與空載體PVITR02組(B)和葡萄糖組(A)相比，裸鼠肺部轉移灶明顯減少，顯出明顯的腫瘤生長抑制，與P-F(C)相比，P-I-F處理組抑制腫瘤轉移灶的效果也好于單基因處理組圖13本發明雙基因載體構建路線圖。圖14:雙基因真核共表達質粒體內抗肺轉移凋亡檢測(200X):原位TUNEL檢測試劑盒分析A549腫瘤組織中的凋亡水平，可見在P-I-F治療組(C)中顯示強的綠色熒光，表明治療后的殘存腫瘤中存在大量凋亡細胞，而對照組(葡萄糖)(A)和PVITRO空載體組(B)熒光較少。TUNEL結果顯示給與P-I-F治療的腫瘤細胞凋亡明顯增加。圖15PVITRo2真核表達載體的結構圖，全長6125bp。具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這并非對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以作出各種變型或改進，只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。實施例一構建人FUS1和IL-12雙基因真核共表達載體本發明雙基因真核共表達載體的構建路線如圖13所示。通過引物可以擴增人FUS1和IL-12基因1):人FUS1基因的引物合成以FUSl在GenBank中的序列NM—007275為模板設計引物。從人肺成纖維細胞MRC-5細胞總RNA反轉錄之后擴增該基因的0RF區。上游引物(SEQIDNo.l):5'TATACCGGTAAGATGGGCGCCAGCGGGTCCAAAG3'下游弓l物(SEQIDNo.2):5'GCGATCGATTCACACCTCATAGAGGATCACAG3'上游添加Age頂每切位點，下游添加CIa位點擴增得到的人FUS1基因的序列為SEQIDNo.3所示。2):人hlL-12基因的引物合成以p0RF-hlL-12的質粒為模板設計以下引物擴增hlL-12上游序列(SEQIDNo.4):5'TTACACCGGTGAAGATGGGTCACCAGCAGTTGGTC3'下游序列(SEQIDNo.5):5'GCGGCTAGCTTAGGAAGCATTCAGATAGCTCATC3'上游添加SgrAl酶切位點，下游添加Nhel酶切位點擴增得到的hlL-12基因的序列為EQIDNo.6所示。將上述基因產物構建成雙基因真核共表達重組載體。從人正常肺細胞中提取RNA，通過上述設計的引物RT-PC財廣增FUS1(圖l)，酶切后，定向插入用相同限制性內切酶Agel和Clal切成線性的PVITR02真核表達載體(購自invivogen，USA，全長6125bp，其結構見圖15)，以T4DNA連接酶16。C水浴16-20h，將目的基因片段與載體相連，轉化大腸桿菌JM109，在卡那霉素抗性平板上隨機挑選數個白色菌落提取質粒DNA，通過凝膠電泳初步篩選出可能的重組子，進一步做Agel與Clal雙酶切反應進行鑒定，酶切結果得到了一條約356bp的片段和一條約6100bp左右片段，與預期結果相一致，同時用PCR鑒定也得到了目的條帶，證明FUS1質粒載體正確構建，命名PVITR02-FUS1(圖2)，并進一步送上海英俊生物公司測序鑒定，結果正確。以P0RF-hlL-12的質粒為模板，以上述設計的引物PC財廣增hlL-12(圖3)，酶切后定向插入用相同限制性內切酶SgrAl和Nhel切成線性的PVITR02真核表達載體，以T4DNA連接酶16。C水浴16-20h，將目的基因片段與載體相連，轉化大腸桿菌JM109，在卡那霉素抗性平板上隨機挑選數個白色菌落提取質粒DNA，通過凝膠電泳初步篩選出可能的重組子，進一步做限制性內切酶SgrA1和Nhe1雙酶切反應進行鑒定，酶切結果得到了一條約1611bp的片段和一條約6100bp左右片段，與預期結果相一致，同時用PCR鑒定也得到了目的條帶，證明hlL-12質粒載體正確構建，命名PVITR02-hlL12(圖4)，并進一步送上海英俊生物公司測序鑒定，結果正確。以PVIT02-FUS1的質粒為模板，以上述設計的引物PC財廣增FUS1，酶切后定向插入用相同限制性內切酶Agel和Clal切成線性的PVITR02-hlL-12真核表達載體，以T4DNA連接酶16。C水浴16-20h，將目的基因片段與載體相連，轉化大腸桿菌JM109，在卡那霉素抗性平板上隨機挑選數個白色菌落提取質粒DNA，通過凝膠電泳初步篩選出可能的重組子，進一步做SgrAl和Nhel及Agel和Clal雙酶切反應進行鑒定，結果如(圖5)所示，酶切結果得到了一條約1611bp的片段和一條約6100bp左右片段，一條約356bp的片段和一條約6100bp左右片段，與預期結果相一致，證明雙基因質粒載體正確構建，命名PVITR02-hlL-12-FUSl，并進一步送上海英駿生物公司測序鑒定，與預期結果一致。最后確定PVITR02-hlL-12-FUSl的序列如SEQIDNo.7所示。實施例二人FUS1和IL-12雙基因真核共表達載體的脂質體復合物的制備利用QIAGEN公司去內毒素的大量質粒的提取試劑盒抽提P-1-F(PVITR02-hIL-12-FUS1)，P(PVITR02)，P-1(PVITR02-hIL-12)，P-F(PVITR02-FUS1)載體質粒并定量。通過如下方法獲得雙基因陽離子脂質體復合物。1、陽離子脂質體的制備精確稱取DOTAP58mg，膽固醇Chol32mg(mol/mol=l:1)，于100ml旋蒸瓶中，加入20ml氯仿溶解，之后在旋轉蒸發器上旋轉蒸發45分鐘以除去氯仿，置于真空干燥機中干燥12小時后，取出，加入一定量5%葡萄糖溶液，60攝氏度下探頭超聲(功率為400W)IO分鐘，將所得液體繼續在60攝氏度下孵化1小時，即得陽離子脂質體。分裝后置于4-8攝氏度條件下保存。2、DOTAP:CHOL與雙基因質粒復合物制備及粒徑測定制備過程如下1.4mMDOTAP:CHOL溶液制備取兩個l.5ml的EP管各加入800y15%葡萄糖，從4度冰箱中取出一管20mM的脂質體溶液分別吸取200yl加入前述EP管中即稀釋至4mM，混勻備用。2.lug/yl質粒溶液制備從-7(TC冰箱中取質粒稀釋至lyg/ul，混勻備用。3.質粒與DOTAP:CHOL復合物的配制如配制質粒P-F為IOyg終體系200yl的復合物。取兩個EP管標注為A和B，A中加入90yl5%葡萄糖，B中加入81.5yl5%葡萄糖，將配制好的lug/uI的P-F質粒溶液IOy1加入A中輕輕混勻三次，將配制好的4mM的D0TAP:CH0L18.5yl加入B輕輕混勻三次，最后將A中質粒溶液全部吸出加入B中，加入時應在液面處輕輕加入并混勻三次，混勻時動作一定要輕柔避免沉淀出現。整個配制過程盡量迅速，最后置于4度過夜。4.粒徑和電位的測定及動物治療第二天早晨從冰箱取出所配復合物室溫靜置l小時后，用于動物治療實驗和復合物的粒徑與電位測定。在DNA脂質體復合物的制備中，本發明通過對DNA脂質體復合物粒徑和電位的測定以及轉染效率三個方面來評價脂質體與DNA的比例，我們得出的優勢比例為脂質體和質粒的重量比為5-6:l，最佳比例為6:1。在體內實驗中本發明均采取了該比例配制的脂質體復合物。用馬爾文粒度儀檢測脂質體復合物粒徑，測定結果表明用于多次連續治療的脂質體復合物粒度均一，粒徑范圍在114nm-185nm之間，符合脂質體在體內基因治療中的粒徑要求(見圖6)。實驗例一人FUS1和IL-12雙基因真核共表達載體在體外的表達及抗腫瘤活性1、hlL-12基因表達的檢測用PVITR02-hIL-12(P-1)、PVITR02-hIL-12-FUS1(P-1-F)轉染A549細24、48，72小時后，收獲細胞，用PBS洗細胞2次。提取轉染及未轉染的A549細胞總RNA進行RT-PCR，結果顯示(圖7)，PVITR02-hIL-12、PVITR02-hIL-12-FUS1轉染A549細胞后24小時即可檢測到hlL-12基因特異片段的表達，RT-PC財廣增產物位于426bp附近，未轉染的A549細胞則未表達該基因.用分別用PVTR02，PVITR02-hIL-12、PVITR02-hIL-12-FUS1轉染A549細胞24、48小時后，收獲細胞上清檢測hlL-12的濃度，結果發現轉染24h后，即可在P-I-F組和P-I組檢測到IL-12的表達，而且表達量很高，而在空載體P組和未轉染組，幾乎檢測不到IL-12的表達(見圖8)。各組IL-12表達量見表1。表1.轉染雙基因真核共表達質粒后分泌到細胞上情中hIL-12的表達量.hlL-12(pg/ml)24h犯h4.1994.798P11.15211.893P-I4362.4919767.215P-I-F2865.Sll8554.1752.FUS1表達的檢測用P-F、P-I-F轉染A549細胞48小時后，收獲細胞對其表達產物進行WesternBlot分析，結果顯示轉染P-I-F.和P-F的細胞裂解液可與抗FUS1蛋白多克隆抗體結合，條帶位置與預期的相符合，而未轉染的A549細胞無特異性條帶出現(圖9)。用P-I-F轉染A549細胞48小時后，用細胞免疫組化檢測FUS1在A549細胞內的表達。結果發現轉染P-F-I24小時后，部分細胞表現FUS1陽性，并清晰可見FUS1蛋白分布在胞質和核膜(A)，而未轉染和僅轉染了PVITR0(B和C)的細胞中沒有FUS1蛋白陽性，且細胞生長狀態良好(圖IO)。3、雙基因聯合表達的抗腫瘤活性檢測我們通過Hoechst33258染色，從形態學角度發現，轉染了P-I-F，P-F的腫瘤細胞有明顯的凋亡特征，即核固縮，形成含核碎片的凋亡小體，但雙基因組(E)中出現的凋亡小體明顯多余單基因組(D);P-I組(C)和空載體組(B)有少量凋亡小體出現；對照葡萄糖組(A)細胞沒有明顯的改變(圖ll)。實驗例二雙基因真核共表達質粒脂質體復合物在體內抗腫瘤活性檢測1、實驗方法
技術領域：
：本發明首先建立人肺癌細胞A549裸鼠肺轉移腫瘤模型，采用P-I-F，P-F，P-I及P的陽離子脂質體復合物連續8次尾靜脈給藥治療腫瘤，劑量為10ug/mice，治療后第三周解剖老鼠，計數肺部腫瘤轉移灶的數目，計算轉移抑制率。實驗結果證實了雙基因真核共表達質粒DNA脂質體復合物在體內的抗腫瘤活性。2、實驗結果A、實驗期間各組均未觀察到明顯的毒副反應，HE染色發現治療組和對照組各組織間無明顯差異。B、P-I-F治療組腫瘤轉移灶明顯少于空質粒組、葡萄糖組或單基因組，治療中出現部分腫瘤轉移灶在治療后完全基本消退，部分小鼠腫瘤轉移灶生長明顯抑制(圖12)。實驗例三雙基因真核共表達質粒脂質體復合物的體內抗腫瘤實驗1、實驗方法按上述方法建立腫瘤模型，實施治療，治療結束后三周，收獲肺組織，檢測P-I-F的脂質體復合物促進腫瘤凋亡的作用，HE染色檢測治療后肺部轉移灶中腫瘤細胞的形態、壞死或凋亡情況，進一步采用TUNEL法檢測凋亡水平。檢測血管生成的抑制作用收獲肺組織，分別利用CD31抗體檢測肺部轉移灶中血管生成情況，比較各組瘤內血管密度差異。2、實驗結果HE染色顯示(200X)，雙基因P-I-F的脂質體復合物處理組小鼠肺轉移灶中瘤內壞死及凋亡明顯，腫瘤內可見淋巴細胞浸潤，對照組和PVITRO空載體組腫瘤細胞生長狀態良好，很少有壞死和淋巴細胞浸潤。而在P-I-F的脂質體復合物處理組腫瘤轉移灶明顯減小，組織內則有明顯的淋巴細胞浸潤和壞死。TUNEL法檢測證實，雙基因P-I-F的脂質體復合物治療組明顯促進腫瘤細胞的凋亡(圖14)。CD31染色發現，與空載體比較雙基因P-I-F處理組肺轉移灶中腫瘤內的微血管密度明顯下降，轉移灶也明顯減小，證明P-I-F的脂質體復合物能夠抑制腫瘤血管生成。綜上，由本發明構建的重組FUSl和hlL-12雙基因真核共表達DNA脂質體復合物能夠通過促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成，在體內有效地抑制腫瘤生長。同時由本領域常識可知，若有不同的要求，本發明的抗腫瘤注射劑中重組P-I-F基因的用量可以在一個較大范圍內變動。本領域技術人員可以根據一些已知的因素，諸如疾病的種類，病情嚴重程度，病人體重，劑型，所選用藥途徑等很容易地加以確定。以上的較優的具體實施方式是對本發明作進一步的舉例說明，但并非對本發明范圍的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以作出各種變型或改進，只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的精神及所附上的權利要求書定義的范圍之內。SEQUENCELISTING〈110>四川大學〈120>重組人FUS1和人IL-12的雙基因表達載體、脂質體復合物及其制備方法和用途〈130>A080307k〈160>7〈170>Patentlnversion3.4〈210>1〈211>34〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>1tataccggtaagatgggcgccagcgggtccaaag34〈210>2〈211>32〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>2gcgatcgattcacacctcatagaggatcacag32〈210>3〈211>333〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>3atgggcgccagcgggtccaaagctcggggcctgtggcccttcgcctcggcggccggaggc60ggcggctcagaggcagcaggagctgagcaagctttggtgcggcctcggggccgagctgtg120ccccccttcgtattcacgcgccgcggctctatgttctatgatgaggatggggatctggct180cacgagttctatgagg卿caatcgtcacca卿acgggc卿agcgggccaagctgagg240cgagtgcataagaatctgattcctcagggcatcgtgaagctggatcacccccgcatccac300gtggatttccctgtgatcctctatgaggtgtga333〈210>4〈211>35〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>4ttacaccggtgaagatgggtcaccagcagttggtc35〈210>5〈211>34〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>5gcggctagcttaggaagcattcagatagctcatc34〈210>6〈211>1611〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>6atgggtcaccagcagttggtcatctcttggttttccctggtttttctggcatctcccctc60gtggccatatggg肌ctg肌gaaagatgtttatgtcgtagaattggattggtatccggat120gcccctggaga肌tggtggtcctcacctgtgacacccctgtatcacctgg180accttggacc卿gcagtgaggtcttaggcccctgaccat240gagtttggagatgctggccagtacacctgtC3C肌3gg3ggcgaggttctaagccattcg300ctcctgctgcgga卿tggaatttggtccactgatatttt肌3gg3CC3g360ctttctaagatgcgaggccatggacgtttc420acctgctggtggctgacgac肌tcagtactgatttgacattcagtgtcaa肌gC3gC3g3■ggctcttctgacccccaaggggtgacgtgccactctctgc卿g卿gtc540卿gg卿catgagtactcagtggagtgccaggaggacagtgcctgccca600gctgctgaggagagtctgcccattgaggtcatggtggatgccgttcacaagctcaagtat660g肌肌ctacaccagcagcttcttcatcaggaacctgaccc3CCC肌g肌C720ttgcagctgagaattctcggcaggtggaggtcagctgggagtaccctgac780acctggagtactccacattcctacttctccctgacattctgcgttcaggtccagggc肌g840tagagtcttc3Cgg3C肌g3cctcagccacggtcatctgc■ccagcattagcgtgcgggcccaggaccgctactatagctcatcttggagc960g肌tgggcatctgtgccctgcagtgttcctggagtaggggtacctggggtgggcgcc卿1020aacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactccc肌肌c1080ctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagac1140tgcacttctg肌gagattg3tcatg肌gatcacagtggag1200gcctgtttaccattggaattg卿gttgccagagacctct1260atgggagttgcctggcctcccttttatgatggccctgtgc1320cttagtagtactcgaagatgtaccaggtggagttc肌gac1380aagcttctgatggatcctaagaggc卿tctttctagatcggcagttatt1440gatgagctgatgcaggccctg肌tttc肌cagtg卿ctgatcctccctt1500g肌g肌ccggaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcaga1560attcgggcagtgactattgat卿gtgatgagctatctgaatgcttccta1611〈210〉7〈211〉8216〈212〉DNA〈213〉artificial〈220〉〈223〉artificial〈400〉7cctgcaggcgtacggta肌tggcccgcctggctgaccgccc肌cgacccc60cgcccattgacgtc肌t肌tgacgtatgttcgccaatagggactttccat120tgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtat180catatgcc肌gtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattat240gcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatc300gctattaccatgatgatgcggttttggcagtacatc肌tgggcgtggatagcggtttgac360tcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgactagtc420agggccccaaccccccc肌gcccccatttcac肌cacgctggcgctacaggcgcgtgact■tccccttgctttggggcggggggctg卿ctcctatgtgctccggattggtcaggcacgg540ccttcggccccgcctcctgccaccgcagattggccgctaggcctccccgagcgccctgcc600tccgagggccggcgcaccat肌肌g肌gccgccctagccacgtcccctcgcagttcggcg660gtcccgcgggtctgtctcaagcttgccgcc3g肌C3C3ggtaagtgccgtgtgtggttcc720cgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccatgccc780ctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttgg肌gtgggtggg卿gttc840gaggccttgcgctt肌ggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcttgggcg■ctggggccgccgcgtgctaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgctaa960gtctctagccat11aaaatttttgataaccagctgcgacgctttttttctggcg卿tag1020tcttgtaaatgcgggccaggatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcgg1080cgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggcc11403CCg3g肌tC卿cgggggt3gtctca肌ctggccggcctgctctggtgcctggcctcgc1200gccgccgtgtatcgccccgccctgggcggc肌ggctggcccggtcggcaccagttgcgtg1260tggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcg1320cccggg卿gcgggcgggtgagtcacccacagggcctttccttcctcatc1380cgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttgtc1440gagcttttggagtacgtcgtctttaggttgggg卿ggggttttatgcgatggagtttcc1500ccacactgagtgggtgg卿ctgaagagttaggccagcttggcacttgatgtaattctcc1560ttggaatttgccctttttgagtttggatcttgcctcattctcaagcctcagacagtggtt1620caaagtttttttcttccatttcaggtgtcgccctaaaagccaccggcatg1680ggtcaccagcagttggtcatctcttggttttccctggtttttctggcatctcccctcgtg1740gccatatgggagatgtttatgtcgtagaattggattggtatccggatgcc1800cctggagaaatggtggtcctcacctgtgacacccctgaagaagatggtatcacctggacc1860ttggaccagagcagtgaggtcttaggctctggc肌肌ccctgaccatccaagtcaaagag1920tttgg卿tgctggccagtacacctgtcaca肌ggaggcgaggttctaagccattcgctc1980ctgctgcttcagatggaatttggtccactgggaccagaaa2040g肌ccc肌肌at肌gacctttctaagatgcgaggcca卿attattctggacgtttcacc2100tgctggtggctgacgac肌tcagtactgatttgacattcagtgtcaaaagcagc卿ggc2160tcttctgaccccc肌ggggtgacgtgcggagctgctacactctctgcagag卿gtc卿2220ggggac肌caaggagtatgagtactcagtggagtgccaggaggacagtgcctgcccagct2280gctgagg卿gtctgcccattgaggtcatggtggatgccgttcacaagctcaagtatgaa2340gcagcttcttcatcagggacatcatcaaacctgacccacccaagaacttg2400cagctgaagcttctcggcaggtggaggtcagctgggagtaccctgacacc2460tggagtactccacattcctacttctccctgacattctgcgttcaggtccagggca卿gc2520agtcttcacggacaagacctcagccacggtcatctgccgc2580gcattagcgtgcgggcccaggaccgctactatagctcatcttggagcgaa2640tgggcatctgtgccctgcagtgttcctggagtaggggtacctggggtgggcgccagaaac2700ctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctg2760ctgagggccgtcagc肌catgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgc2820acttctgaagtg肌gatatc肌3CC3gC3Cagt卿ggcc2880tgtttaccatagttgcctaagacctctttc2940卿gttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgcctt3000atg肌gactcgaagatgtaccaggtggagttc肌gaccat3060cttctgatggatcct肌gaggcagatctttacatgctggc3120gagctgatgcaggccctgaatttcaacagtg卿ctgtgccacaaaaatcctcccttgaa3180gaaccggatttttataaaacctctgcatacttcttcatgctttcagaatt3240cgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcctaagctagctggcca3300gatacattgatgagtttggactag肌tgca3360tgctttatttgtgaaatttggctttatttg3420ttgcattcattttatgtttcaggttcaggg卿ggtgtgg3480gaggtttttt3肌cctctacaaatgtggtatggaaatgtt3540CC3tg3CC肌cgtgagttttcgttccactgagcgtcagacCCCgt3g肌33600atcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgc3660gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaactctttttc3720cgaaggtaactggcttcagc卿gcgc卿tgttcttctagtgtagccgt3780agttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcc3840tgttaccagtggctgctgccagtcgtgtcttaccgggttggactc肌gac3900gatagttaccggat肌ggcgcagcggtcgggctg肌cggggggttcgtgc3C3C3gCCC33960gcttggagcg肌cgacctac3CCg肌Ctg3gatacctacagcgtgagctatg卿肌gcg4020ccacgcttcccg肌ggg卿肌ggcggacaggtatccggt肌gcggcagggtcgg肌cag4080g卿gcgcacgagggagcttccaggggg肌acgcctggtatctttatagtcctgtcgggt4140ttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctat4200gg肌肌3CgCcagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctc4260acatgttctt肌tt肌cctgcagggcctgacttggttagg4320taccttctgaggctg肌卿accagctgtgg肌tgtgtgtcagttagggtgtgga肌gtc4380cccaggctccccagcaggcagaagtatgca肌gcatgcatctcaattagtC3gC肌CC3g4440gtgtgga肌gtccccaggctccccagcaggcagaagtatgC肌3gC3tgC4500gtcagcaaccatagtcccactagttccgcc卿gcgcgcgagggcctccagcggccgccc4560CtCCCCC3C3gcaggggcggggtcccgcgcccaccggaaggagcgggctcggggcgggcg4620<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>,ggggactagcttctatgcctgaatagg6480tgaccggaggtcggcacctttcctttgcaattactgacccactgactgtt6540tcatcggcatagtatatcggtacgactcactataggaggg6600CC3CC3tg肌Ctg3C3gC肌cttctgttgagaagtttctc6660ttgattctgtttctgatctcatgcagctgtctg肌ggtgagccttttctt6720ttgatgttggagga卿ggttatgttctgagggtcaattcttgtgctgatggtttttaca6780tgtttacagacactttgcctctgctgctctgccaattccag肌gttctgg6840acattggagaattttctgaatctctcacctactgcatcagC3g肌g3gC3caaggagtca6900ctctccaggatctccctgaaactgagctgccagctgttctgcaacctgttgctgaagcaa6960tggatgccattgcagcagctgatctgagccaaacctctggatttggtccttttggtcccc7020肌ggcattggtcagtacaccacttggagggatttcatttgtgccattgctgatcctcatg7080tctatcactggc卿ctgtgatggatgacacagtttctgcttctgttgctcaggcactgg7140atg肌ctcatgctgtgggcagaagattgtcctgaagtcagacacctggtccatgctgatt7200ttggaagcaacaatgttctggC3g肌tC3Ctgcagtcattgactggtctg7260aagccatgtttggagattctcaatatgaggttgccaacatttttttttggagaccttggc7320tggcttgcatgg肌c肌c肌3C3CCC3g肌ctggctggtt7380cccccagactgagagcctacatgctcag肌ttggcctggaccaactgtatcaatctctgg7440ttgatggaaactttgatgatgctgcttgggC3C肌gg肌gatgtgatgccattgtgaggt7500ctggtgctggaactgttggattgcaagaaggtctgctgctgtttggactg7560atggatgtgttgaagttctggctgactctg3CCCtCC3C3agacccagag7620ccaaggaatgagattatccctaatacctgcC3CCCC3CtCttaatcagtg7680gtgga卿acggtctcagaactgtttgtttcaattggccatttaagttta7740actggttaatccttcagaagtgttttgtgg7800accactttggttttcttttttgcgtgtggctattagtttt7860tttgtcacagcccatt7920gtgttcctttggtcaacaccggtgaa卿c7980ggttttacga3tctgga肌cttcttg肌肌tgtaattcttgagttaacac8040ttctgggtgg卿atagggttgttttccccg,gggg肌ggaatatcat8100g卿gggttgctttgattacaacactggagcatgttgctg8160attgcctgtcgcca肌肌ctgagtccttgggttgcatagaaagctg821權利要求1.重組質粒載體，其特征在于裝載有編碼人FUS1蛋白的基因與人IL-12蛋白的基因，能在真核細胞中同時表達人FUS1蛋白與人IL-12蛋白。2、根據權利要求l所述的重組質粒載體，其特征在于所述編碼人FUS1蛋白的基因與編碼人IL-12蛋白的基因分別處于不同啟動子的控制之下表達。3、根據權利要求2所述的重組質粒載體，其特征在于所述人FUS1蛋白的編碼基因具有SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，所述人IL-12的編碼基因具有SeqIDNo.6所示的核苷酸序列。4、根據權利要求2所述的重組質粒載體，其特征在于所述編碼FUS1的基因處于hFerHProm啟動子的控制之下表達。5、根據權利要求4所述的重組質粒載體，其特征在于所述編碼FUS1蛋白的基因所在表達框的構成是從5'到3'方向依次為hFerHProm啟動子、編碼人FUS1蛋白的基因序列、EFlpAn加尾信號。6、根據權利要求3所述的重組質粒載體，其特征在于所述編碼人IL-12蛋白的基因處于hFerLprom啟動子的控制之下表達。7、根據權利要求6所述的重組質粒載體，其特征在于所述編碼IL-12蛋白的基因所在表達框的構成是從5'到3'方向依次為hFerLprom啟動子、編碼人IL-12蛋白的基因、SV40pAn加尾信號。8、根據權利要求l所述的重組質粒載體，其特征在于具有SEQIDNo.7所示的核苷酸序列。9、權利要求18任一項所述的重組質粒載體的脂質體復合物，特征在于脂質體和質粒的重量比為56:1。10、根據權利要求9所述的脂質體復合物，特征在于所述脂質體由D0TAP和CH0L組成，其用量配比為摩爾比l:l。11、權利要求18任一項所述的重組質粒載體或權利要求9或10所述的脂質體復合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。12、抗腫瘤藥物，由權利要求18任一項所述的重組質粒載體或權利要求9或10所述的脂質體復合物作為主要活性成分添加藥學上可接受的輔助性成分制備而成全文摘要本發明屬于基因治療領域，要解決的技術問題是提供新的雙基因治療產品。具體涉及重組人FUS1和人IL-12的雙基因表達載體、脂質體復合物及其制備方法和用途。該雙基因表達載體含有編碼人FUS1蛋白的基因與編碼人IL-12蛋白的基因，能在真核細胞中同時表達人FUS1蛋白與人IL-12蛋白。優選的方案是將編碼人FUS1蛋白與人IL-12蛋白的基因分別處于不同的啟動子的控制之下表達。實驗表明，本發明重組載體的脂質體復合物由于其雙基因治療的多重效應，大大提高了抗腫瘤的作用，因而為腫癌的治療提供了一種新的選擇。文檔編號A61K48/00GK101368187SQ20081030480公開日2009年2月18日申請日期2008年10月9日優先權日2008年10月9日發明者文朱,鄧洪新,陳俐娟,魏于全申請人:四川大學