重組人hnp基因脂質體復合物、制備方法及用途的制作方法

專利名稱：重組人hnp基因脂質體復合物、制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因治療領域，具體涉及a-防御素(HNP)成熟肽編碼序列的重組載體、脂 質體復合物，及其制備方法與用途。
技術背景人alpha防御素(a-防御素)是來源于人嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒內的陽離子活性 多月太(Human neutrophil p印tides， HNPs)，分子量為4 5KD，含保守的6個半胱氨酸殘基 ，形成3個典型的分子內二硫鍵(Ganz and Lehrer 1995)。目前發現的a-防御素(麗Ps)有 四種，但發揮主要功能的主要有三種麗P1、麗P2、麗P3，基因結構可以大致分為三部分， 分別編碼信號肽、前體肽以及成熟肽。以HNP1為例，首先合成94個氨基酸殘基的多肽( pr印ro-HNPl)，信號肽被切除之后獲得45個氨基酸的前體肽段，被來源于髓系細胞的切割 酶切除，最終生成30個氨基酸構成的具有活性的陽離子成熟肽(Valore and Ganz 1992)。在體外，麗Ps有廣譜的抗菌性，其中包括細菌，真菌，以及一些病毒(Selsted and Ouellette 2005)。近年來的研究表明，在體外HNPs對多種腫瘤細胞表現出細胞毒性 (Xichtenstein， Ganz et al. 1988; Aarbiou， Tjabringa et al. 2006)， HNPs可破壞細胞 膜進而導致細胞不可逆的損傷，當細胞膜的通透性改變后，HNPs隨即進入細胞內，在胞內發 揮其二次損傷的作用，HNPs在細胞內的損傷作用對于腫瘤細胞的裂解甚至更為重要 (Lichtenstein 1991)。而正常細胞與腫瘤細胞之間存在著許多差別，腫瘤細胞的細胞膜表 面比正常細胞的細胞膜表面有更多的負電荷，而且在腫瘤細胞表面存在大量的微絨毛，增加 了腫瘤細胞的表面積，使更多的防御素可以結合到腫瘤細胞的細胞膜，相對特異的發揮抗腫 瘤作用(Zwaal and Schroit 1997)。但是，這些體外研究發現，HNPs容易受到血清蛋白及 Ca離子濃度影響而失活，因而認為，HNPs難以在體內用于腫瘤的治療(Lichtenstein 1991; Aarbiou, Tjabringa et al. 2006)。作為抗菌肽，HNPs不僅在先天性免疫中發揮作用，同樣地它還能調節機體的獲得性免疫 (Selsted and Ouellette 2005)。除了直接的殺傷活性外，HNP1可以趨化人類的單核細胞， T細胞，和未成熟的樹突狀細胞(Territo， Ganz et al. 1989; Yang， Chen et al. 2000)， 而這些細胞與腫瘤免疫密切相關。麗Pl-3還可以增加腫瘤壞死因子alpha(TNF-a)，減少單 核細胞產生的白介素10(IL-10) (Chaly， Paleolog et al. 2000)，上調的TNF-a可以誘導腫瘤細胞的凋亡，而下調的IL-10減少了IL-10介導的免疫抑制。最近的研究表明，HNPs在病 毒感染的腫瘤中可能發揮作用(Hubert, Herman et al. 2007)，也可能影響腎癌細胞的增殖 (Muller， Markovic-Li沐ovski et al. 2002)，但目前尚沒有證據表明HNPs能夠介導抗腫瘤 免疫。纖維結合蛋白(FN)及受體整合素a5f3 1 (integrin a5{3 1)是血管生成的胞外機制 相關的重要蛋白。目前有研究表明麗Ps可以通過影響FN與integrin a5f3 1的結合，進而影 響內皮細胞粘附以及內皮細胞增殖來調節血管生成，并能抑制糖尿病所致的視網膜血管增生 (Economopoulou， Bdeir et al. 2005)。但目前尚沒有研究報道HNPs能夠抑制腫瘤血管生成 進而抑制腫瘤生長。事實上，上述的研究采用的HNPs主要直接從人的中性粒細胞提取，人工提取HNPs不僅受 到細胞來源的限制，所提取的麗Ps也是麗Pl-3的混合物，難以將三種主要有效成分分開，獲 得活性較強單體。體外人工合成的麗Ps不僅成本昂貴，而且多肽的活性也有待證實。并由于 HNPs多肽的作用呈現濃度依賴，并存在容易受到血清蛋白及Ca離子濃度影響的不穩定性，使 HNPs多肽難以作為藥物被開發用于臨床治療。由于HNPl的成熟涉及到多肽的剪切修飾等過程 ，要使用載體裝載基因片段進入體內進行表達并發揮其作用具有很大的不確定性。目前也沒 有利用HNPl基因設計基因藥物用于腫瘤治療的報道。癌癥基因治療目前主要策略集中于三個方面， 一是引入腫瘤凋亡調節基因，如p53， 二 是引入抑制腫瘤血管生長的基因，如endostatin，三是引入免疫基因，如IL-2。引入凋亡基 因及血管生長抑制基因的有效性已被多數研究所證實，但其效應的發揮必須依賴于高效的轉 染效率和抑制作用的持續發揮，而采用免疫基因的優勢在于只需要部分轉染腫瘤細胞即可誘 發腫瘤免疫，但在腫瘤負荷較大的情況下收效甚微，因此，目前基因治療的一個理想的策略 是獲得具有雙重或多重作用的理想候選基因。發明內容本發明要解決的第一個技術問題是提供一種真核表達載體。該真核表達載體含有并能表 達人a -防御素成熟肽編碼基因。其中，上述真核表達載體為重組噬菌體載體、腺病毒載體或質粒載體。由于人a-防御 素(HNP)成熟肽存在一定抗病毒作用，故優選使用質粒載體。進一步的，上述的質粒載體為pSecTag2B或pcDNA3. 1。其中，上述人a-防御素成熟肽的編碼序列如SEQ ID NO. 1 (為HNP1成熟肽的編碼序列) 或SEQ ID NO. 2 (為麗P3成熟肽的編碼序列)所示。進一步的，上述表達載體中的a -防御素成熟肽編碼基因的5'端連接有免疫球蛋白信號 肽編碼基因或細胞因子信號肽編碼基因。其中，上述的免疫球蛋白信號肽編碼基因優選為人IL-2分泌信號肽的編碼基因、上述的 細胞因子信號肽編碼基因優選為免疫球蛋白ka卯a鏈(以下均簡稱IgK)信號肽的編碼基因連接了IgK信號肽編碼序列的麗Pl融合基因序列為(SEQ ID NO. 3):TGCTGA其中，下劃線部分為IgK信號肽編碼序列連接了IL-2信號肽編碼序列的HNP1融合基因序列為(SEQ ID NO. 4):AACCTGCATCTACCAGGGAAGACTCTGGGCATTCTGCTGCTGA其中，下劃線部分為IL-2信號肽編碼序列。更進一步的，上述真核表達載體具有SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。 本發明所要解決的第二個技術問題是提供制備上述真核表達載體的方法。該方法包括以 下步驟a、從人淋巴細胞的總RNA中擴增得到人a-防御素成熟肽編碼基因片段；b、將人a -防御素成熟肽編碼基因片段轉入真核表達載體中并置于表達啟動元件之后。本發明所要解決的第三個技術問題是提供上述真核表達載體的脂質體復合物。優選使用 陽離子脂質體。進一步的，上述脂質體復合物中的脂質體由摩爾比為l:l的DOTAP及Chol組成，脂質體與 真核表達載體的質量比優選為3 5:1 。本發明所要解決的第四個技術問題是提供制備上述脂質體復合物的方法。該方法包括以 下步驟將離子脂質體與重組載體混合；置于液氮中迅速冷卻，然后取出放入4攝氏度冰箱 中待其融化，反復凍融1 6次；凍融完畢后，放入冷凍干燥機中凍干，即得。本發明所要解決的第五個技術問題是提供上述真核表達載體或著脂質體復合物在制備抗 腫瘤藥物組合物中的用途。本發明所要解決的第六個技術問題是提供一種藥物組合物。該藥物組合物是由上述的真核表達載體或著脂質體復合物添加藥學上可接受的輔助性成分制備而成。該藥物組合物主要 通過注射給藥，能夠通過促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生長并誘導腫瘤免疫，起抗腫瘤 的作用。需要說明的是，本發明中生產和操作重組基因、重組載體和抗腫瘤注射劑的相關技術是 本領域技術人員可以根據公開的操作指南和手冊完成的描述的技術完成的。本發明采用具有分泌功能的信號肽基因序列與具有腫瘤細胞毒性的人a -防御素成熟肽 編碼基因構建融合基因，并用融合基因構建重組質粒，實施基因治療，直接將融合的人a-防御素成熟肽基因引入腫瘤細胞內部，證實了可在腫瘤內部表達并分泌具有殺傷活性的人a -防御素成熟肽，表達的人a-防御素成熟肽產生了明顯的抗腫瘤作用，避開了人a-防御素 成熟肽活性易受血清蛋白及Ca離子濃度影響的缺點，降低了治療成本，突破了之前本領域認 為不能采用HNPs多肽實施腫瘤體內治療的論斷。并為在此基礎上結合其他的腫瘤治療手段進 行綜合治療提供了基礎。本發明還優選出了a-防御素成熟肽基l (麗P1)基因是能夠發揮促 進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成并介導腫瘤免疫的多重作用的理想效應基因。本發明利 用HNP1成熟肽編碼序列重組載體的脂質體復合物對不同類型的腫瘤進行基因治療，證實 HNP1能在腫瘤細胞內表達并分泌到腫瘤細胞外，表達的HNP1能在體內外有效促進腫瘤細胞凋 亡，并能在體內抑制腫瘤血管生長，更重要的是，本發明獲得的DNA脂質體復合物，能夠在 體內誘導產生特異的抗腫瘤免疫，增強并延長了治療療效。同時本發明HNP1成熟肽編碼序列 重組載體的脂質體復合物，提高了基因藥物的轉染率，能夠反復使用，避免了普通病毒載體 的毒性及不能長期反復使用的缺點，方便了進一步臨床應用，并由于其治療的多重效應，尤 其是其免疫效應，使其在腫瘤治療中只需轉染部分腫瘤細胞即能產生治療作用，因而為癌癥 的治療提供了理想的基因藥物。


圖l HNP1全長及成熟片段的PCR產物。M， marker; 1，全長HNP1 PCR產物，全長片段約 280bps; 2，成熟HNP1 PCR產物，片段加上引物引入的信號肽約120bps。圖2目的基因連接到pSecTag2B， PCR驗證的電泳圖譜(1% Agarose電泳)，其中M為 marker ， 1為從重組質粒擴增的人的麗P 1基因片段。圖3驗證重組質粒在RNA水平的表達以及轉染重組質粒后分泌到細胞上清中HNP1的表達 量。A: RNA水平的表達。B: ELISA檢測細胞上清中麗P1的表達量。Untreated組指未對改組 實施干預。圖4 免疫組化檢測HNP1在A549細胞內的表達及對A549細胞的影響。A:轉染pSec-HNPl24小時后，部分細胞表現HNP1陽性，并清晰可見一部分死亡的細胞。B:轉染pSec-HNPl 48 小時后，麗P1表達陽性的細胞較24小時少，但是死亡的細胞卻明顯增多。C，D:轉染 pSecTag以及未處理的細胞(untreated)沒有HNP1陽性，且細胞生長狀態良好。圖5 體外麗P1誘導腫瘤細胞凋亡。Hoechst 33258染色結果顯示，轉染了pSec-麗P1的 細胞表現出核固縮以及含有核碎片的凋亡小體(A-a)，而轉染了pSecTag (A-b)， lipofectAMINE 2000 (B-c)，以及未處理的(untreated組，B-d)細胞則幾乎沒有凋亡細胞。 流式細胞檢測結果進一步顯示，細胞轉染了pSec-HNP1 (C-a)， pSecTag (C-b)， LipofectAMINE 2000 (C-c)，以及不做處理(untreated) (C-d)后，凋亡率分別為45. 7%， 18. 2%， 4. 1%，及3. 6%。圖6麗P1體內的抗腫瘤效應。A為A549裸鼠模型，B為4Tl乳腺癌Balb/c模型。結果顯示 ，pSec-麗Pl處理組與pSecTag和PBS組裸鼠相比表現出明顯的腫瘤生長抑制。圖7組織學分析與凋亡檢測。H&E染色結果顯示，對照組(pSecTag和PBS)腫瘤細胞 生長狀態良好，很少有壞死和淋巴細胞浸潤。而在治療組(pSec-HNPl)腫瘤組織內則有明 顯的淋巴細胞浸潤和壞死；免疫組化染色結果顯示治療組(pSec-HNPl)腫瘤細胞內HNP1表 達陽性，而對照組則無麗P1的表達。TUNEL結果顯示給與pSec-麗Pl治療的腫瘤細胞凋亡明顯 增加。圖8 腫瘤組織內微血管免疫組化觀察。A， pSec-HNP1; B， pSecTag; C， PBS; D，微 血管計數，pSecc-HNPl治療裸鼠來源的腫瘤組織微血管密度明顯下降。圖9 pSecc-HNPl在Balb/c小鼠4Tl模型誘導產生特異的細胞免疫。51&釋放實驗顯示， 來源于HNP1治療小鼠的T細胞與載體組及生理鹽水處理組比較，具有增強的特異的殺傷活性圖10 pSecc-HNPl誘導宿主產生針對4Tl腫瘤細胞的抗體反應。l為載體處理組作為對照 ，2為pSecc-HNPl處理后出現腫瘤生長受到明顯抑制的小鼠血清，2為pSecc-HNPl處理后出現 腫瘤消退的小鼠血清，結果表明，pSecc-HNPl治療小鼠4Tl腫瘤后可以產生抗體。以下結合附圖通過具體實施方式
的描述對本發明作進一步說明，但這并非對本發明的限 制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以作出各種變型或改進，只要不脫離本發明 的基本思想，均在本發明的范圍之內。
具體實施方式
實施例一 本發明重組載體的構建本實施例用RT-PCR方法從人淋巴細胞總RNA中擴增麗Ps片段，采用分子克隆手段將融合 基因克隆到目標載體，由于HNP1與HNP2具有高度相似性，目前NCBI的Gene Bank指定為同一 基因，即HNP1，故本發明克隆了并構建了HNP1成熟肽及HNP3成熟肽融合基因重組質粒，以 HNP1為例根據人HNP1基因序列設計并合成RT-PCR引物，將PCR產物直接插入克隆載體-T載體(購 自Promega公司)，采用引物序列如下全長HNP1上游引物(SEQ ID NO. 6) (full-HNP1-forward): 5'-ATAGGATCCGCCATGAGGACCCTCGC CATCCTTG-3'。 全長HNP1下游引物(SEQ ID NO. 7) (full-HNP1-reverse): 5'-GAGATATCAGCAGCAG AATGCCCAGAGTC-3'。 成熟HNP1上游引物(SEQ ID NO. 8) (mHNPl-forward)為 5'-GCGGCCCAGCCGGCCgcctgct attgcagaata-3'。 成熟HNPl下游引物(SEQ ID NO. 9) (mHNPl-reverse)為 5'-GAGATATCAGCAG CAGAATGCCCAGAGTC-3'。RT-PCR反應條件50°C 30 min; 94°C4 min; 94°C 30 s， 52°C 30 s， 72°C 30 s， 30 個循環，72。C 5 min。 PCR反應條件94。C 4 min; 94。C 30 s， 58。C 30 s， 72。C 30 s， 30個循環，72°C 5 min。擴增成熟肽基因片段的上，下游引物分別引入Sfi I和EcoRV酶切 位點。擴增出的麗Pl成熟肽編碼基因序列為SEQ ID NO. l所示。反應完成后，1X瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物，結果表明擴增出與預期片段大小一 致的100+bps左右的DNA片段(圖l)。隨后將上述片段酶切后克隆到pSecTag2B，先利用上述 成熟肽引物PCR驗證，結果能夠擴增出目的片段(圖2)，再經Invitrogen公司測序證實，表 明所得到重組質粒中的融合的HNP1成熟肽基因序列與預期一致，并且連在pSecTag2B自帶的 IgK分泌信號肽之后，獲得重組質粒pSecTag2B-HNPl，以下簡稱pSec-HNPl ，其全序列如SEQ ID NO. 5所示。本發明以類似方法采用表達載體pcDNA3. l構建了融合IL-2分泌信號肽與a -防 御素成熟肽的融合基因表達載體。采用與此相似的方法，獲得HNP3成熟肽的基因，其序列如SEQ ID N0.2所示。并將其連 接在pSecTag2B自帶的Igk分泌信號肽之后，獲得了HNP3的重組質粒pSecTag2B-麗P3，以下簡 稱pSec-HNP3。然后，通過比較pSec-麗Pl及pSec-麗P3對不同腫瘤細胞的抑制活性，利用MTT法篩選pSec-HNPl及pSec-HNP3中活性較強的重組融合基因。實驗方法將獲得的重組質粒采用可以去內毒素的QIAGEN質粒抽提試劑盒小規模制備質 粒，將獲得的質粒定量。分別采用A549細胞、小鼠CT26及4T1細胞鋪被96孔板，每孔細胞l X 104個，細胞貼壁生長8小時后，利用商售的Invitrogen公司lipofectine2000轉染試劑盒分 別轉染pSec-HNPl或pSec-HNP3，每孔轉入質粒5ng、 10ng及20ng，每個濃度三復孔，每種質 粒均轉染三種腫瘤細胞，轉染后分別于24小時、48小時采用MTT法檢測腫瘤生長情況。實驗結果MTT實驗結果顯示pSec-麗Pl對腫瘤的抑制活性優于pSec-麗P3，故本發明在 下面的實施例中主要采用pSec-HNPl來制備脂質體復合物并進行效果驗證。實施例二 制備本發明重組載體的脂質體復合物首先利用QIAGEN公司去內毒素的大量質粒的提取試劑盒抽提pSec-HNPl及pSecTag2B載體 質粒并定量。然后通過如下方法制備HNP1成熟肽重組載體的脂質體復合物。獲得脂質體精確稱取DOTAP 58mg，膽固醇Chol 32mg (mol/mol=l: 1)，于100ml旋蒸 瓶中，加入20ml氯仿溶解，之后在旋轉蒸發器上旋轉蒸發45分鐘以除去氯仿，置于真空干燥 機中干燥12小時后，取出，加入一定量5%葡萄糖溶液，60攝氏度下探頭超聲(功率為400W) IO分鐘，將所得液體繼續在60攝氏度下孵化1小時，即得。制備凍干粉針劑將陽離子脂質體與HNP1重組質粒按照質量比2 10:1于凍融管中混合 ，之后將凍融管置于液氮中迅速冷卻，IO秒后取出，立刻將其放入4攝氏度冰箱中待其融化 ，如此反復凍融4次。最后一次凍融完畢后，將液體全部移入西林瓶中，再向其中加入20%甘 露醇注射液(保證最終體系中甘露醇質量不超過總質量的5%)，最后將液體放入冷凍干燥機 中凍干，即得pSec-HNPl脂質體DNA復合物，采用相同的方法制備pSecTag2B載體的脂質體復 合物作為后期實驗的對照品使用。質粒DNA包封率的測定并計算質粒濃度凍干粉采用5%的葡萄糖復溶后移入離心管中， 10000rpm離心，取上清，測260nm下吸收值，g卩包封率=00260 (上清液)/ OD260 (包裹前 )X100%，在此基礎上計算重組質粒的量進行下一步動物實驗。在脂質體復合物的制備中，本發明通過包封率，脂質體復合物在溶液狀態下的穩定性， 以及轉染效率三個方面來評價脂質體與重組載體的比例。得出脂質體與重組載體的較優比例 為重量比3 5:1，最佳比例為3:1。鑒于在體內實驗中本發明均采取了該脂質體復合物，在 下述實例中，若非特別說明，仍以pSec-麗Pl及pSecTag指代相應的脂質體復合物，其中脂質 體與重組載體的比例均為重量比3:1。實驗例三.本發明重組載體在體外的表達能力及抗腫瘤活性1、 本發明重組載體表達的檢測將重組質粒轉染A549細胞，48小時后收集細胞提取RNA做RT-PCR，只有轉染了 pSec-麗Pl質粒的細胞可以擴增出麗Pl成熟肽基因片段，而轉染單純的pSecTag質粒，以及未 轉染的A549細胞的RNA不能擴增出目的條帶(圖3A)。為了檢測HNP1的分泌以及上清中HNP1的表達量，于轉染后24、 48小時分別收集細胞上清 ，通過ELISA進行檢測。結果顯示，轉染后24小時上清中HNPl的量約為102ng/ml，轉染后48 小時麗Pl成熟肽的量約為120ng/ml，對照組細胞則無麗P1成熟肽的表達(圖3B)。2、 本發明重組載體的抗腫瘤活性檢測首先通過免疫組化方法檢測了HNP1成熟肽在胞內的表達，結果發現在轉染后24小時 HNP1成熟肽即有明顯表達，在48小時即觀察到陽性細胞的明顯凋亡(圖4， A-B)。進一步通 過Hoechst 33258染色，從形態學角度發現轉染了pSec-HNPl的腫瘤細胞有明顯的凋亡特征， 即核固縮，形成含核碎片的凋亡小體(圖5， A-a)，流式細胞儀檢測到凋亡明顯增加(圖5 ，B-eO實驗例四本發明脂質體復合物的體內表達活性及抗腫瘤活性1、 實驗方法首先建立人肺癌細胞A549裸鼠腫瘤模型。然后采用pSec-HNPl及pSecTag單次治療腫瘤， 劑量為20yg， 50yg， 100yg，治療后第三天收獲腫瘤，檢測麗P1的表達，在證實瘤內有 麗P1的表達后，分別構建人肺癌細胞A549裸鼠腫瘤模型及小鼠乳腺癌4T1的Balb/c腫瘤模型 ，分別分為3組PBS或生理鹽水(n. s)處理組、空載體組(pSecTag)以及麗P1基因組，每 組10只，在腫瘤直徑約3-5mm時予以治療，瘤內注射100mg載體質粒或HNPl基因脂質體，2天 治療一次，共治療5次，觀察腫瘤大小。2、 實驗結果在瘤內注射pSec-麗Pl后24小時即有麗Pl的表達，麗P1的局部表達不僅高度富集在腫瘤 細胞內，還能有效分泌到細胞間隙，并能滲透到腫瘤血管內，結合到腫瘤血管壁上，在48小 時即能觀察到腫瘤細胞的凋亡，并能觀察到瘤周有淋巴細胞浸潤，HNP1的表達呈現一定的劑 量依賴。實驗期間各組均未觀察到明顯的毒副反應。pSec-HNPl治療組腫瘤生長速度明顯慢于空質粒組、PBS或n. s組，治療中出現部分腫瘤 在治療后腫瘤完全消退，部分小鼠腫瘤生長明顯抑制(圖6， A為A549模型，B為4T1模型)實驗例五本發明脂質體復合物在體內抗腫瘤實驗。1、 實驗方法按實驗例四的方法建立腫瘤模型，實施治療，治療結束后一周，收獲腫瘤組織，檢測注 射的脂質體復合物表達的HNP1成熟肽促進腫瘤凋亡的作用，HE染色檢測治療后腫瘤內腫瘤細 胞的形態、壞死或凋亡情況，免疫組化檢測HNP1成熟肽的表達，進一步采用TUNEL法檢測凋 亡水平。檢測血管生成的抑制作用收獲腫瘤組織，分別利用CD31抗體檢測腫瘤內血管生成情況 ，計算腫瘤血管密度，比較瘤內血管密度差異。在Balb/c小鼠4Tl腫瘤模型中檢測麗Pl治療后的免疫作用，收獲治療后Balb/c小鼠的脾 細胞作為效應細胞，以4T1作為耙細胞，51&釋放實驗體外檢測脾細胞對腫瘤細胞的特異的 殺傷活性。收獲小鼠血清作為一抗，其中分別收取腫瘤消退的小鼠血清及腫瘤抑制小鼠血清 ，檢測血清中是否產生針對4T1膜蛋白的特異抗體。2、 實驗結果HE染色顯示，脂質體復合物處理組小鼠瘤內壞死及凋亡明顯，腫瘤內可見淋巴細胞浸潤 ，TUNEL法檢測證實，脂質體復合物治療促進腫瘤細胞的凋亡(圖7) 。 CD31染色發現， HNP1處理組腫瘤內的微血管密度明顯下降，證明脂質體復合物在體內表達HNP1成熟肽能夠抑 制腫瘤血管生成(圖8) 。 ^Cr釋放實驗證實麗Pl成熟肽能夠誘導小鼠產生特異的毒性CTL ( 圖9)，而腫瘤消退的小鼠及腫瘤明顯抑制的小鼠血清中均存在針對4T1膜蛋白的特異抗體( 圖IO)。由本實例可知，本發明構建HNP1成熟肽脂質體復合物能夠通過促進腫瘤細胞凋亡，抑制 腫瘤血管生成及誘導抗腫瘤免疫，在體內有效地抑制腫瘤生長。具有其它的腫瘤基因治療藥 物難以比擬的優勢。以上的較優的具體實施方式
是對本發明作進一步的舉例說明，但并非對本發明范圍的限 制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以作出各種變型或改進，只要不脫離本發明 的基本思想，均在本發明的精神及所附上的權利要求書定義的范圍之內。如由本領域常識可 知，若有不同的要求，本發明的抗腫瘤藥物中重組麗P1成熟肽基因的載體的用量可以在一個 較大范圍內變動。本領域技術人員可以根據一些已知的因素，諸如疾病的種類，病情嚴重程 度，病人體重，劑型，所選用藥途徑等很容易地加以確定。SEQUENCE LISTING〈110> 四川大學〈120>重組人HNP基因脂質體復合物、制備方法及用途 〈130> A080136k 〈160> 9〈170> Patentln version 3. 4〈210> 1〈211> 93〈212> DNA〈213> artificial〈220>〈223> artificial 〈400> 1gcctgctatt gcagaatacc agcgtgcatt gcaggagaac gtcgctatgg aacctgcatc 60 taccagggaa gactctgggc attctgctgc tga 93〈210> 2〈211> 90〈212> DNA〈213> artificial〈220>〈223> artificial 〈400> 2gactgctatt gcagaatacc agcgtgcatt gcaggagaac gtcgctatgg aacctgcatc 60 taccagggaa gactctgggc attctgctgc 90〈210> 3〈211> 171〈212> DNA〈213> artificial〈220>〈223> artificial 〈400> 3atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccgc ctgctattgc agaataccag cgtgcattgc aggagaacgt 120 cgctatggaa cctgcatcta ccagggaaga ctctgggcat tctgctgctg a 171〈210> 4〈211> 156〈212> DNA〈213> artificial〈220>
artificial
〈400> 4
atgtacagga tgcaactcct
gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60
gccgcctgct attgcagaat accagcgtgc attgcaggag aacgtcgcta tggaacctgc 120
atctaccagg gaagactctg ggcattctgc tgctga
156
〈210> 5
〈211> 5192
〈212> DNA
〈213> artificial
〈220>
artificial
〈400> 5
gacggatcgg g卿tctccc
gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 了20
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
caccatggag acagacacac tcctgctatg ggtactgctg ctctgggttc caggttccac %0
tggtgacgcg gcccagccgg ccgcctgcta ttgcagaata ccagcgtgca ttgcaggaga 1020
acgtcgctat ggaacctgca tctaccaggg aagactctgg gcattctgct gctgatatcc 1080
agcacagtgg cggccgctcg agtctagagg gcccgaacaa aaactcatct cagaagagga 1140
tctgaatagc gccgtcgacc atcatcatca tcatcattga gtttaaaccc gctgatcagc 1200ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 1260
gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 1320
ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gc肌ggggga 1，
卿ttggg肌gac肌tagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 1440
ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tccccacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 1500
cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc 1560
cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc 1620
tctaaatcgg ggcatccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa 1680
aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg 1740
ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac 1800
actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgggga tttcggccta I860
ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattaattct gtggaatgtg 1920
tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg 1980
catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 2040
atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc 2100ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt 2160
atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc 2220
ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcgga 2280
tctgatcagc acgtgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg 2340
acaaggtgag gaactaaacc atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc 2400
gcgacgtcgc cggagcggtc gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg 2柳
tggaggacga cttcgccggt gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc 2520
aggaccaggt ggtgccggac肌caccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc ，0
tgtacgccga gtggtcggag gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca
tgaccg卿t cggcgagcag ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca ，0
actgcgtgca cttcgtggcc gaggagcagg actgacacgt gctacgagat ttcgattcca 2760
ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 2820
tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag 2880
cttat肌tgg ttaca肌t肌3gc肌tagc3 tcac3肌ttt c3C3肌ta肌gcattttttt 2940
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac 3000cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 3060
gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 3120
gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 3180
cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 3240
tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 3300
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 3360
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 3420
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 3480
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 3540
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 3600
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 3660
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 3720
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 3780
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 3840
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 3900tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 3%0
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 4020
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 4080
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 4140
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 4200
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 4260
cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 4320
ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 4380
cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 4440
ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 4500
ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 4560
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 4620
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 4680
ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 4了40
ctggtgagta ctc肌cc肌g tcattctgag肌tagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 4800gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 4860ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 4920cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 4980ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 5040aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 5100gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 5160gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tc5192〈210> 6 〈211> 34 〈212> DNA〈213> artificial〈220>〈223> artificial〈400> 6ataggatccg ccatgaggaccctcgccatc cttg 34〈210> 7 〈211> 29 〈212> DNA〈213> artificial 〈220>〈223> artificial<400> 7gaga.tatcag cagcagaatg cccagagtc 29<210> 8〈211> 33〈212> DNA〈213> artificial〈220>〈223> artificial<400> 8gcggcccagc cggccgcctg ctattgcaga. a.ta 33<210> 9〈211> 29〈212> DNA〈213> artificial<220>〈223> artificial<400> 9gagatatcag cagcagaatg cccagagtc 29
權利要求
1. 含有并能表達人α-防御素成熟肽編碼基因的真核表達載體。
2.根據權利要求l所述的真核表達載體，其特征在于所述的真核表達 載體為重組噬菌體載體、腺病毒載體或質粒載體。
3.根據權利要求2所述的真核表達載體，其特征在于所述的質粒載體 為pSecTag2B或pcDNA3. 1。
4.根據權利要求1 3任一項所述的真核表達載體，其特征在于所述 的人a-防御素成熟肽的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。
5.根據權利要求1 4任一項所述的真核表達載體，其特征在于所述 的a -防御素成熟肽編碼基因的5'端連接有免疫球蛋白信號肽編碼基因或細胞因子信號肽編 碼基因。
6.根據權利要求1 5任一項所述的真核表達載體，其特征在于所述 的免疫球蛋白信號肽編碼基因為人IL-2分泌信號肽的編碼基因、所述的細胞因子信號肽編碼 基因為人免疫球蛋白IgK鏈信號肽的編碼基因。
7.根據權利要求1 6任一項所述的真核表達載體，其特征在于具有 SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
8.制備權利要求1 7任一項所述的真核表達載體的方法，其特征在 于包括以下步驟a、從人淋巴細胞的總RNA中擴增得到人a-防御素成熟肽編碼基因片段；b 、將人a-防御素成熟肽編碼基因片段轉入真核表達載體中并置于表達啟動元件之后。
9.權利要求1 7任一項所述的真核表達載體的脂質體復合物。
10.根據權利要求9所述的脂質體復合物，其特征在于脂質體由摩爾 比為l:l的DOTAP及Chol組成，脂質體與真核表達載體的質量比為3 5:1 。
11.制備權利要求9或10所述的脂質體復合物的方法，其特征在于包 括以下步驟凍將陽離子脂質體與重組載體混合；置于液氮中迅速冷卻，然后取出放入4攝 氏度冰箱中待其融化，如此反復凍融1 6次；最后一次凍融完畢后，將液體放入冷凍干燥機中凍干，即得。
12，權利要求1 7任一項所述的真核表達載體或著權利要求9或10所 述的脂質體復合物在制備抗腫瘤藥物組合物中的用途。
13， 一種藥物組合物，其特征在于是由權利要求1 7任一項所述的真 核表達載體或著權利要求9或10所述的脂質體復合物添加藥學上可接受的輔助性成分制備而 成。
全文摘要
本發明涉及重組人HNP基因脂質體復合物、制備方法及用途，屬于基因治療領域，所解決的技術問題是提供了一種新的腫瘤基因治療的藥物。該真核表達載體含有并能表達人α-防御素成熟肽編碼基因，還能制備成脂質體復合物。本發明真核表達載體及其脂質體復合物能在腫瘤內部表達并分泌具有殺傷活性的人α-防御素成熟肽，產生了明顯的抗腫瘤作用，避開了人α-防御素成熟肽活性易受血清蛋白及Ca離子濃度影響的缺點，為腫瘤的基因治療提供了新的選擇。
文檔編號A61P35/00GK101280318SQ20081030184
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月30日 優先權日2008年5月30日
發明者莉 楊, 王永生, 魏于全 申請人:四川大學