專利名稱：：聚合物兩相系統及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種含水液體混合物，其包含兩種或者多種能夠形成多相系統的聚合物，其中每個相富含一種的該聚合物。本發明還包括一種使用本發明的多相系統從液體中分離至少一種目標化合物的方法以及包括用于進行這樣的方法的試劑盒。
背景技術：
：由于分離方法例如色譜法和電泳的發展，使得生物技術的變革，包括現代生物制藥學的發展和繪制人類基因組成為可能。這樣的方法可以用于小規模以及大規模中，并且被稱為靈活的方法，其可用于多種物質，包括生物物質。但是，它們需要技術和裝備二者。另外，由于需要非線性規格的加熱和冷卻，因此一些加工例如電泳的規格導致了對于更復雜的裝備的需要。在聚合物水相系統中的相之間的分配是一種可選擇的方法，從二十世紀五十年代開始就對其進行了研究，但是它的商業應用嚴重的受限于經濟的可升級的相系統的缺乏。與分離方法例如結晶和尺寸排阻(sizeexclusion)—起；分配被認為是一種分離技術。它涉及到目標物質和其他物質在兩相之間的不同分配。術語"分配，，可以指的是(a)例如在典型的色譜法中的液體-固體分配，(b)在兩種或者多種液相(分別是雙相和多相系統)之間的分配，(c)在流動液相和固定在固體相載體表面上的另一種液相之間的分配，和(d)粒子在液相和兩相的相界面之間的分配。在本專利申請中，"分配"和"分配于"指的是例如b，c或者d這樣的情況，即，在液相之間分配。分配典型的被表達為系數(K),該系數與一個相中的濃度比另一個相中的濃度相關，并且對于溶質而言，K通常符合Br0nsted等式。因此K被認為是不同類型的相互作用例如靜電和/或疏水相互作用的變化指數，并且其還對于溶質大小(即，與液相相互作用的面積)是敏感的。在界面分配的情況中，K被認為是界面張力的變化指數，該張力傾向于將粒子局限到該相界面中。典型的兩相系統是有才幾和含水兩相系統，其通常在所述相之間具有顯著的極性，以及顯著的界面張力。這樣的系統對于生物物質例如蛋白質或者細胞不是非常有用的，因為它們傾向于由于明顯非極性溶液而變性和剪切損壞，該損壞與具有顯著的界面張力的相系統的混合有關。對于生物物質而言更有用的是低張力的、含水聚合物兩相系統。公知的是后者可以包含一些添加的有機溶劑，例如乙醇或者其他有才幾添加劑，該添加劑一皮加入來增強目標物的溶解性，降^氐液相才及性，減少泡沫，充當殺菌劑等等。聚合物兩相系統可以通過在水溶液中混合某些親水性的聚合物和典型的中性聚合物來形成。這些聚合物包括葡聚糖(聚葡萄糖)和聚(乙二醇)(PEG);以及聚蔗糖(例如Ficol1)和PEG;或者線性聚丙烯酰胺和PEG。每個聚合物典型的濃度是5-10%w/w。在這樣的濃度，熵力傾向于推進兩相的形成，這二者都典型的是大于9(W(w/w)水，但是表現出極性，氫鍵特性，凝固點等等微妙的差異。該相典型的是富集一種聚合物，并且具有非常低的界面張力。在生物
技術領域：
中，PEG和葡聚糖類型的兩相系統的一個優點是目標蛋白質可以有利的分配在PEG富集的相中，而細胞片段和一些污染物可以分配到界面或者補充相中。WO2004/020629(Tjerneld)涉及包含亞乙基氧(EO)基團和亞丙基氧(PO)基團的PEG類聚合物(簡寫成EOPO聚合物)的用途。這樣的聚合物被稱作"E0P0"聚合物，其表現出逆轉的熱溶解性，并且在WO2004/020629中建議將它們用于質粒的分離。在室溫時，將較稀的、E0P0富集的上部相與EOPO和葡聚糖聚合物含水兩相系統分離，并且隨后將它的溫度升高到37。C,該上部相經歷了進一步的相分離，成為水富集的相和自締合的EOPO聚合物富集的相。有利的，該水富集的相應當包含期望的質粒。通常，這種E0P0和葡聚糖系統提供了在相聚合物成分再循環和設計有效的兩階段分配分離方法方面的優勢。但是，一個缺點是系統配制所涉及的成本，這與人造的合成聚合物PEG無關，而是與生物來源的和昂貴得多的葡聚糖有關。用不同的淀粉或者其他聚糖聚合物來代替葡聚糖的努力已經取得了有限的成功。一種中等界面張力的聚合物兩相系統可以通過在相對高的濃度合并PEG和某些水結構性鹽例如500mM疏酸銨來形成。PEG-鹽兩相系統是克服成本限制的一種可能的方案，但是增加PEG和鹽的濃度產生了對于加工成本產生不利影響這樣的挑戰。這些包括粘性相，鹽試劑成本，鹽處置和裝置腐蝕挑戰，以及與生產量有關的目標物溶解性問題。結果，聚合物經常難以再循環或者必須通過進一步下游的加工來與目標物分離。在生物
技術領域：
中，聚合物兩相系統(處于具有或者不具有明顯的鹽兩種形式中)是普遍令人感興趣的。這是因為它們容易用在小規模以及大規模分離中，當按比例增加到更大的體積時，沒有效率損失或者成本的顯著變化。同樣，任何常規的分離方案例如電荷基的、疏水基的、親合性基的或者粒徑基的分離可以在聚合物兩相系統中進行。通常許多不期望的成分例如細胞片段、內毒素、核酸稍微傾向于分配到PEG和葡聚糖或者PEG和鹽兩相系統中的下部相(分別富含葡聚糖的或者富含鹽的相)中。因此，如果能夠觀察到一個系統提供了目標物在上部(富含PEG)相中的良好分配，則可以獲得有效的初級分離和目標物濃度。此外，在克服與常規的色譜和/或過濾加工相關的缺陷的努力中，和在克服每個單元操作的單個理論分配步驟的局限的努力中，通過將一個相固定在色譜載體或者能夠優先潤濕該相的其他固載體上，而將液體-液體分配兩相系統例如PEG-葡聚糖或者PEG-鹽用于色i普法應用。然后將該補充相泵送通過色譜柱，來提供用于流動相和固定相之間平衡的重復的機會。這由W,Miiller等人在二十世紀八十年代在MerckDarmstadt進行了商業開發。US5093254(Giuliano等人)涉及公開了一種含水兩相蛋白質分配系統，其使用聚乙烯吡咯烷酮作為上部相和麥芽糊精作為下部相，并且提供了用于蛋白質分配的低成本系統。該系統也可以與氯三嗪染料的氨基衍生物一起使用，該染料以非共價鍵的方式結合到PVP上，并且充當了待分離的蛋白質的配位體。應當說明的是這種系統的一個優點是它的成本效益，因為染料能夠容易的結合到聚合物相上，而不必進行色譜法和溶劑萃取，該色譜法和溶劑萃取是在現有技術的PEG/羥丙基淀粉系統中形成共價鍵結合所必需的。但是，缺點是這樣的染料可能的致癌作用。Albertsson(P.-A.Albertsson,■PartitionofCellParticlesandMacromolecules,第2版，WileyInterscience，紐約，1971第10章PhaseDiagrams,第250-313頁)公開了包含PEG和Na羧甲基基團改性的葡聚糖(CMD)的系統。所述系統的缺點是(a)聚合物仍然包括了昂貴的多糖；(b)聚合物然后進一步化學改性；(c)所提到的高分子量(Mw2200000)和特性相粘度；和(c)形成相所需的相當高的聚合物濃度，其被期望結合水分子和降低系統蛋白質的溶解性。Gupta等人(VandanaGupta,SuniiNath,SubhashChandinPolymer43(2002)3387—3390:Roleofwaterstructureonphaseseparationinpolyelectrolyte-polyethyleneglycolbasedaqueoustwo-phasesystems)涉及對于聚電解質-聚乙二醇(PEG)基含水兩相系統(ATPS)相分離行為進行的研究，目的是闡明控制相行為的機理。Gupta使用了數均分子量60000的聚乙烯亞胺(PEI);和平均分子量250000聚丙烯酸(PAA)的。從這個研究可以得出結論在ATPS的相分離中，鹽-輔助的聚合物改性的水結構相互作用起到了核心的作用。Saravaanen(SettuSaravaanan，JohnyA.Reena，JonnalagaddaR.Rao,ThanapalanMurugesan,andBalanchandranU.NairinJ.Chem.Eng.Data2006,51,1246-1249:PhaseEquilibrumCompositions,Densities,andViscositiesofAqueousTwo-PhasePoly(ethyleneglycol)十Poly(acrylicacid)SystemsatVariousTemperatures)涉及一種溫度對于不同的質量分率(從0.O5-0.50)的聚(丙烯酸)(PAA)水溶液的密度和粘度以及在平衡時的含水兩相PEG-6000+PAA+水系統的液體-液體平衡、密度和粘度影響的研究。同樣這里仍然存在著對于新穎的分離方法的大的需求，該方法是相對工藝簡單和容易規模化的。
發明內容本發明一方面提供了一種分離生物分子和其他化合物的方法，其提供了高的動態能力和快速的質量轉移。如附加的權利要求所述，這可以根據本發明，通過將所述的生物分子和/或化合物分配到一定的體積內來實現，而不分配到不溶的多孔基質，該基質的表面提供了通過受控的吸收對于目標物的俘獲。因此，本發明的一個具體方面是提供這樣的方法，其同樣用于膠體粒子例如細胞，染色體等，其是不受這里固體載體干擾或者變得阻塞的色譜法或者過濾方案的影響。這可以通過使用本發明的具體的聚合物兩相系統來實現。本發明另一方面是提供這樣的聚合物兩相系統的用途，其用于分離生物分子和其他化合物，該系統形成了自然的相分離，并且優選還需要不復雜的裝置。本發明另一方面是提供這樣的聚合物兩相系統，該系統已經在添加劑例如用于有效分離生物分子的鹽方面進行了優化。本發明另一方面是提供這樣的兩相系統的用途以及包含本發明的優化的兩相系統的試劑盒。本發明的一個或多個方面可以如附加的4又利要求所述來實現。本發明另外的目標和優點將從下面的詳細公開中變得顯而易見。圖1是一種本發明的含水聚合物兩相系統的相圖，該系統使用PEG4000和NaPolyacrylate8000(其是聚丙烯酸聚合物的鈉形式)來形成。圖2是一種本發明的兩相系統的相圖，該系統包含PEG8000和Napolyacrylate8000(其是聚丙烯酸聚合物的鈉形式)。圖3是一種圖，表示了在室溫時，在含有200mM硫酸鈉并且調整到pH7的系統中，本發明的富含PEG8000的相(上部)和富含NaPAA15000的相(底部)的兩相系統中的分配。圖4表示了用于下面的實施例3的質粒DNA和RNA分配研究的上部和下部相樣品的相系統電泳分析。圖5表示了分配到系統的上部相中蛋白質的百分率，該系統的組成為6%PEG1500或者4000和6%NaPAA15000，300mMNaCl和20mM磷酸鈉(pH5.5-7)。圖6表示了分配到系統的上部富含PEG的相中蛋白質的百分率，該系統的組成為6%(w/w)PEG1500,NaPAA15000,20mM磷酸鈉(pH6或者8)和250mM或者300mMNaCl。圖7是一系列的三個照片，表示了包含重組體綠色熒光蛋白質(GFP)的E.coli細胞在本發明的兩相系統中的分配，該系統包含6。/。PEG8000,8%NaPAA15000和150mM石舜酸鈉(pH7)。定義本申請中所用的術語"聚酸(poly(acid))"是指線性的或者支化的聚酸主鏈，其含有多個酸基團作為側基和/或端基。術語"目標化合物，，在此表示了化合物以及分子和細胞，即，任何的期望從液體中進行分離的實體。具體實施方式本發明涉及一種能夠形成含水聚合物多相系統的液體混合物，其包含第一聚合物、第二合成聚合物和至少一種鹽，該第一聚合物是合成聚酸，該第二合成聚合物是親水性聚醚，其中該聚酸的分子量范圍是1000-100000Da。本發明的液體混合物和多相系統中所用的聚合物是含水的，意思是在與水合并時，它們形成了水相。此外，如本領域技術人員所理解的那樣，在本發明的上下文中，術語液體"混合物"僅僅指的是此處所述的成分的組合。在該條件下，這樣的作為單相、兩相或多相存在的液體混合物是從相圖中可推斷出來的。本發明的液體混合物的一個優點是它們產生了這樣的相，其看起來比許多通常所研究的相系統更稀薄、目視更透明和更快的分離。聚酸可以是任何的合適的聚酸。因此，所述主鏈可以是烴鏈，聚醚，聚酯，聚酰胺，聚縮醛，聚氨酯或者聚砜。在一種實施方案中，該聚酸是烴(乙烯基聚合物)或者聚醚鏈。本領域技術人員能夠容易的制備這樣的聚酸。因此，在本發明液體混合物的一種實施方案中，聚酸選自使用例如下面的酸官能化的單體所形成的聚合物丙烯酸，曱基丙烯酸，衣康酸，巴豆酸，馬來酸，富馬酸，乙烯基安息香酸，丙烯酰氨基乙醇酸，琥珀酸丙烯酰氧乙基酯，乙烯基磺酸，苯乙烯磺酸，丙烯酰氨基甲基丙烷磺酸，乙烯基膦酸等等。在一種有利的實施方案中，聚酸是聚(丙烯酸)(PAA)或者聚丙烯酸鹽。當用于聚合物多相系統中時，富含PAA的相將是透明的，快速分離的，并且表現出比葡聚糖基系統更低的粘度。本發明的能夠形成PAA基多相系統的液體混合物是通過將例如40%的市售NaPAA溶液與亞乙基氧聚合物和鹽進行合并來容易的形成的。聚酸可以處于酸、酸酐或者脫質子化的形式(即鹽的形式)。在本發明液體混合物的一種實施方案中，聚酸聚合物的分子量范圍是900-100000Da，例如1000-20000Da。在一種實施方案中，該分子量處于400-1000000Da的寬范圍內。如本領域技術人員所理解的那樣，對本發明的合成聚酸和聚酸進行選擇，使其在鹽存在下能夠形成含水兩相系統。本領域技術人員基于相圖能夠容易地推出，所述的聚合物作為單相或多相存在于系統中時的PH值，鹽濃度，分子量等。9因此，在本發明系統的一種實施方案中，聚醚能夠在聚酸和鹽的存在下形成兩種物理不同的相的系統，其中每個相富含了一種聚合物。在本發明液體混合物的一種實施方案中，聚醚分子量范圍是900-100000Da，例如1000-20000Da。在一種實施方案中，該分子量處于400-1000000Da的寬范圍內。在一種有利的實施方案中，聚醚是包含亞乙基氧單元的合成聚合物。在一種有利的實施方案中，該亞乙基氧聚合物選自水溶性聚醚，其包括聚乙二醇(PEG);處于無規共聚物形式(例如Breox⑧聚合物)或者嵌段共聚物(例如Pluronic⑧聚合物)形式的環氧乙烷環氧丙烷共聚物(E0P0)。如本領域技術人員將明白的那樣，這些聚合物可以包括不同的改性形式，例如單曱氧基形式的PEG。在一種有利的實施方案中，亞乙基氧聚合物是PEG。在生物分子的分離中，通過目標物的局部化，PEG經常是有利的，這是因為它是生物相容性的，并且是一種可接受的FDA賦形劑；以及因為它能夠容易的與蛋白質，細胞和其他目標物分離。在另外一種有利的實施方案中，亞乙基氧聚合物是環氧乙烷環氧丙烷共聚物(E0P0)。作為本領域技術人員已知的，EOPO通過加熱分離成為兩相，并且因此被認為是一種熱分離聚合物。因此，在一種具體的實施方案中，亞乙基氧聚合物是一種熱分離聚合物，例如E0P0。在該實施方案中，本發明的系統能夠分離成為三相，其將在下面的使用本發明多相系統的方法的上下文中更詳細的進行討論。對于每個所面對的用途來說，可以對本發明的液體混合物的總聚合物濃度進行優化。例如，公知的是蛋白質和其他大分子可以通過加入相對大量的水溶性聚合物而從溶液中沉淀出來。所以，如果本發明的系統被用于蛋白質的分離中，則過高的總聚合物濃度將不允許足夠的蛋白質溶解度來實現成本有效的分離。因此，在本發明液體混合物的一種實施方案中，對于分離生物分子和/或粒子來說，總聚合物含量有利的是占到了系統的大約8-20%(w/w)。在一種實施方案中，該液體混合物占10-20%(w/w)。在另外一種實施方案中，該液體混合物占水的大約70%。因此，在一種實施方案中，本發明的液體混合物包含大約4-6%的每個聚合物，例如大約5%,大約4.5%或者大約4%的每個聚合物。在另外一種實施方案中，該液體混合物包含高到大約10°/。的每個聚合物，例如大約8%的每個聚合物。因此，基于相圖數據和任選的非常簡單的例行試驗，本領域技術人員能夠容易的確定這樣合適的條件例如pH和溫度，在該條件時多相系統例如兩相系統是由本發明的液體混合物形成的。在一種實施方案中，本發明的液體混合物的pH值接近于中性。形成兩相系統所用的溫度范圍可以是4-3(TC，例如室溫。如果由富含熱分離聚合物的相來形成第三相，則該階段時使用更高的溫度。在本發明系統的一種具體的實施方案中，鹽的濃度范圍是l-500mM，例如低于300mM或者在100-300mM的范圍內。如本領域技術人員將理解的那樣，形成兩相系統所需的鹽的量將受到聚合物匿，濃度和物理狀態的影響。因此如果將它用聚酸的鈉或者其他的鹽形式來配制，則形成兩相系統僅僅需要100mM的緩沖液鹽。在一種有利的實施方案中，該鹽選自NaCl,Na2P04,KPO"NaS04，檸檬酸鉀，(肌)肌,乙酸鈉及其組合。基于霍夫麥斯特系列(HoffmeisterSeries),本領域技術人員可以容易的預測每個具體的鹽對于相分離的影響，例如蛋白質的分離。這是因為公知的是處于霍夫麥斯特系列低端的鹽例如NaCl將傾向于將凈正電荷的蛋白質轉移到富含亞乙基氧聚合物的相；而相反，處于霍夫麥斯特系列的更高端或者右端的鹽將所述的蛋白質轉移到富含聚酸的相。在一種實施方案中，本發明的液體混合物包含10%或者更少的鹽。在一種具體的實施方案中，本發明的液體混合物包含一種或多種色譜法配位體。當將本發明的液體混合物用于生物分子或者粒子的分離時，這樣的色譜法配位體可以用作一種工具，在該情況中配位體可以結合某些目標化合物，通過該配位體來將所述的目標化合物分配到有利的相。在一種實施方案中，該配位體是親合性配位體，其能夠通過"鎖/鑰匙"類型的高特效相互作用(例如在受體和配位體之間，或者抗體-抗原之間的相互作用)來結合目標分子。示例性的親合配位體是例如蛋白質A或者蛋白質A基配位體。在一種有利的實施方案中，對該親合性配位體進行聚合物改性，來促進它們向具體相的分配。在另外一種實施方案中，加入聚合物改性的親合性配位體，來將相互作用性目標物分配到富集聚合物的相中，該聚合物最類似于連接到配位體的聚合物。由本發明的液體混合物(其包含亞乙基氧和含有酸基團的聚合物)所ii形成的兩相系統可以包含其他帶電的和不帶電的基團，例如是由本發明人用PEG和聚(乙烯基曱醚-共聚-馬來酸酐)所形成的兩相系統的情況。由于上述的多相系統對于分配所涉及到液體是有用的，因此這樣的方法能夠容易的在線結合到其他通常使用的從堆棧的碟式離心機到色譜法和過濾的分離步驟上。因此，本發明一種有利的用途是分離生物分子或者粒子。在第二方面，本發明涉及本發明的液體混合物或者多相系統在分離至少一種目標化合物，例如生物分子，細胞或者粒子中的用途。該目標化合物可以是蛋白質，肽，核酸，細胞，病毒，或者上述任何一個的任何的部分、片段或者融合產物。因此，在一種實施方案中，目標化合物是抗體，或者其的片段或者融合產物。示例性的抗體片段是例如Fab片段。在另外一種實施方案中，目標化合物是核酸，例如DNA或者RNA,例如質粒，染色體組的DNA,適體(aptamer)或者低聚核苷酸。在另外一種實施方案中，該目標4b合物是細胞，例如真核細月包或者原核細胞，例如成年細胞或者祖細胞。在本申請中，術語"粒子"有時候用于表示細胞。在第三方面，本發明涉及一種從液體中分離至少一種目標化合物的方法，該方法包含(a)將合成聚合物與第二合成聚合物和至少一種鹽進行合并，該合成聚合物是聚酸，該第二合成聚合物是親水性聚醚；(b)將包含至少一種目標化合物的液體加入到獲自(a)的系統中；(c)柔和的混合獲自(b)的系統，直到至少形成兩相；和任選的，(d)從一個相中回收期望的目標化合物。在該本發明方法的一種實施方案中，在步驟(a)中，提供了根據上述的本發明第一方面的液體混合物。因此，在一種實施方案中，聚酸分子量范圍是1000-100000Da。在一種有利的實施方案中，該親水性聚醚是一種亞乙基氧聚合物。在一種具體的實施方案中，在步驟(d)中，通過一種方法來從一個相中回收期望的目標化合物，所述的方法可以包括在溶液中自由的自然聚結使所形成的相區域(小滴)成更大的區域，或者通過^L用所施加的能量(離心分離，電泳，冷卻)的幫助或者通過使用一個相在不同的表面(容器，離心機，過濾器，粒子等等)上相對于另一個相的優先潤濕的幫助下聚結成更大的區域。在一種具體的實施方案中，本發明的方法包括步驟在聚合物分子量和pH對鹽濃度之間選擇合適的平衡，在該條件時形成了富含聚酸的相和富含亞乙基氧聚合物的相。如上所述，聚醚是一種熱分離的聚合物例如EOPO，因此本發明的液體混合物能夠形成三相。在第一實施方案中，本發明的方法包含形成上述的兩相系統，隨后除去富含聚酸的相，然后加熱富含熱分離的聚合物例如EOPO的相來提供第二個兩相系統，目標物可以從該系統進行回收。但是，本發明人出乎意料的發現當本發明的液體混合物用于分離生物分子例如蛋白質時，在對富含熱分離聚合物的相進^亍加熱之前，除去富含聚酸的相不是必需的。因此，在一種可選擇的實施方案中，本發明的方法包含加熱兩相系統，直到形成三相。在一種實施方案中，在步驟(a)中，通過一個相在另一個相存在下的表面優先潤濕，將聚合物局限到基質或者其他表面上來提供(thepolymer(s)hasprovidedlocalizedonamatrixofothersurfaceviapreferentialwettingofthesurfacesbyonephaseinthepresenceoftheotherphase)。這樣的潤濕現象是公知的，并且包括天然表面的優先潤濕，例如通過在低極性的富含PEG的相存在下，高極性的富含聚酸的相在不銹鋼或者其他金屬或者親水性表面上的潤濕。它們還可以包括富含PEG的相在低極性表面上的優先潤濕。在另外一種實施方案中，使用單粒子或者粒子聚集體，并且所述粒子的直徑典型的是小于200微米和大于5nm。粒子和/或聚集體可以用聚合物共價改性或者以其它方式改性(becovalentlyorotherwisemodifiedwithpolymers);包4舌4吏用不同的聚合物改性的"配位體"例如通常用于下面中的這些配位體免疫-，外源凝集素-或者金屬離子-或者其他-親合色譜法，以及離子交換色譜法，疏水相互作用色謙法(HIC),和其他模式的色譜法，包括離子-pi，p-p和其他相互作用，包括基于范德華或者分散相互作用的這些。在第四方面，本發明涉及一種用于分離至少一種目標化合物，例如生物分子，細胞或者粒子的試劑盒，該試劑盒包含上述的本發明的液體混合物或者多相系統。在該試劑盒一種實施方案中，液體混合物或者多相系統被提供在塑料袋中。試劑盒不同的成分可以存在于容器例如塑料袋的分開的分隔間中。在一種有利的實施方案中，該塑料袋是這樣的尺寸，其允許加入從其中分離一種或多種目標化合物的液體，并且包含了用于添加供料的裝置以及用于混合的裝置。在一種有利的實施方案中，本發明的試劑盒至少包含聚合物，其是在水溶液中的合成聚酸或者干燥形式的合成聚酸。該試劑盒可以包含用法說明，例如書寫的或者其他存在的說明，用于它在目標化合物分離中的使用。在一種具體的實施方案，試劑盒還包含第二合成聚合物(其含有亞乙基氧)，和至少一種鹽，其中聚酸分子量范圍是1000-100000Da。附圖詳細說明除非另有指示，否則下面的百分比是作為重量/重量(w/w)給出的。圖1表示了本發明的含水聚合物兩相系統的相圖，該系統使用PEG4000和NaPolyacrylate8000來形成。更具體的，該系統是用22。C的200mMNaCl形成的。雙節點曲線是通過將系統滴定到與下面相關的濃度點來肉眼評^f介的圓形兩相系統；正方形單相系統；和三角形明顯處于雙峰區域并且難以分派的系統。本發明的相在相對低的(總)聚合物濃度時形成，并且它們是透明的，相對低的粘度，和在單位重力下快速分離。此外該相雙節點曲線在接近于臨界點時線性更大，這表明接近于這個區域所形成的兩相系統將具有顯著的連線(tie-line)長度，并且因此在物理性能方面以及在分配結果方面具有更大的可再現性。應當指出的是在雙峰曲線上，雙峰聚合物濃度上最低的總聚合物濃度出現在大約12%，這對應于6%的每個聚合物。圖2是本發明兩相系統的相圖，該系統包含PEG8000和Na-polyacrylate8000。該圖指的是用25°C的大約230mMNa2S04(3%重量)形成的系統。相組成確定；(圓形)兩相系統，(正方形)單相系統，(三角形)明顯處于雙峰區域并且難以分派的系統。本發明的相在相對低的(總)聚合物濃度時形成，并且是透明的，相對低的粘度，和在單位重力下快速分離。此外該相雙節點曲線在接近于臨界點時線性更大，這表明接近于這個區域所形成的兩相系統將在物理性能方面以及在分配結果方面具有更大的可再現性。應當指出的是在雙峰曲線上最低的總聚合物濃度出現在大約10%，這對應于5°/。的每個聚合物，與圖1相比，其與硫酸鈉鹽更大的水結構效應是一致的。圖3是一種圖，表示了在室溫時，在含有200mM^L酸鈉并且調整到pH7的系統中，本發明的富含PEG8000的相(上部)和富含NaPAA15000的相(底部)的兩相系統中的分配。該系統4皮表示為(x-y),這里x是PEGwt°/。，y是NaPAAwt。/。。在這種情況中，臨界濃度位于每個聚合物的4°/。-4.5%之間的某處，這允許比圖2更高的MWNaPAA聚合物和更低溫度時更大的相形成能力。實現了大約相等的相體積的相系統。類似的結果可以在含有NaPAA8000的系統(未示出)中看到。圖4表示了如下面的實施例3中更詳細描述的質粒DNA和RNA分配研究的上部和下部相才羊品的相系統電泳分析。標準物和上部和下部相樣品的電泳用于上表中的6%PEG8000,6°/。NaPAA8000，3%硫酸鈉，lOmM磷酸鈉，pH7系統。通道(Lanes)l-3是47min,用于進行pDNA，通道4-6是30分鐘，用于進行RNA。通道分配是1MW標準物，2上部相，3下部相，4MW標準物，5上部相，6下部相。圖5表示了分配到系統的上部相中的模型蛋白質肌球蛋白和牛血清的蛋白(BSA)百分率，該系統的組成是6。/。PEG1500或者4000和6，aPAA15000，300mMNaCl和20mM磷酸鈉pH5.5-7。圖6表示了分配到系統的上部富含PEG相中的蛋白質的百分率，該系統的組成為6%PEG1500，NaPAA15000，20mM磷酸鈉pH6或者8和250mM或者300mMNaCl。圖7是一系列的三個照片，表示了包含重組體綠色熒光蛋白質(GFP)的E.coli細胞在本發明的兩相系統中的分配，該系統包含6y。PEG8000，8%NaPAA15000和150mM磷酸鈉(pH7)。從該圖可見，完整細胞分配到上部富含PEG的相中，相反，溶解的細胞分配到上部相中，然后在輕的離心分離之后轉移到界面上。從溶解的細胞中釋放的GFP和其他釋放的蛋白質稍微有利的分配到上部相中。這是通過將所述的管適度的離心分離來將溶解的細胞帶到界面而觀察到的。這些結果表明對于NaPAA基兩相系統來說，可以找到具體的相系統，其處于適于大部分細胞分配的鹽濃度范圍中，并且這樣的系統可以將細菌或者其他細胞不對稱的分配到所述的相之間。試驗提供了本發明的實施例僅僅用于示例性目的，并且絕對不應當被解釋為對附加的權利要求所定義的本發明的限制。實施例1-本發明的兩相系統的制備和相圖15原料聚合物聚(乙二醇)4000(Merck)，PEG8000(Sigma-Aldrich)，聚丙烯酸鈉，來自Aldrich，CAS號:9003-04-7,分子量30000(在40wt%的水溶液中)，分子量8000(在45wt。/。的水溶液中)。NaCl和Na2S04甲醇，Ba(N03)2(來自Merck和P.A.quality)。^敬孔過濾水被用于全部的溶液中。相圖的確定主干(stem)(雙峰)的相邊界是通過公知的方法滴定法來確定的[參見MethodsinEnzymology，第228巻,AqueousTwo-PhaseSystems,HarryWalter和G.Johanssoneds.AcademicPress,紐約,1994]。在該情況中，制造了這樣的系統，其具有被懷疑處于兩相區域中的組成。如果該系統在混合時變混濁，則它表明兩相系統的存在。通過加入具有與所研究的系統相同鹽濃度的鹽溶液，該系統的聚合物被稀釋。如果該聚合物濃度低于臨界值，則該系統變成單相系統，其在混合時不變混濁。通過加入聚合物和繼續稀釋該系統，在該相邊界的兩側繪制了相圖，即，雙節點曲線。該系統是在22°C(室溫)和25°C(水浴)測量的。折射率測量在富含水的溶液(〉9oy。)中，溶液的折射率是線性增加的性能。制造了單獨的已知濃度的PEG-水，聚丙烯酸鈉-水，和鹽-水溶液的標準曲線。折射率儀器獲自CarlZeiss(Oberkochen，Wtirttemberg,德國)。PEG的確定因為鹽和聚丙烯酸鈉在甲醇中的溶解度非常低(<0.lwtW,而PEG具有非常高的溶解度，因此能夠選擇性的將PEG萃取到曱醇中，并且通過蒸發甲醇重量分析來確定PEG。將1.OOg的上部相或者底部相與至少6g的曱醇進行混合。形成了聚丙烯酸鈉和鹽的沉淀物，并且在3000xg離心分離10min。收集含有PEG的上清液，并且放入高度已知的15ml玻璃管中。用2g甲醇進一步清洗沉淀物，隨后進行離心分離。將后者的上清液部分與第一個部分進行合并。將這個管敞開放置在排風罩中3天。大部分的曱醇被蒸發，并且將殘留的曱醇在7(TC的烘箱中蒸發。稱重所迷的管，并且重量分析來確定干燥的PEG。Na2S(h的確定硫酸鈉鹽可以通過用硫酸鋇滴定來確定。但是，因為聚丙烯酸鈉是通過二價陽離子沉淀的，因此在分析之前必須將這個聚合物除去。這是如下來進行的將lg樣品(上部-或者底部相)加入到15ml玻璃管(A)中。將0.lgNa-polyacrylate8000，(濃度:45wt。/。水溶液)和0.3gPEG8000(濃度30wt。/。水溶液)和0.2gHCL(37wt。/。)加入到所述樣品中，并且產生渦流，最后在3000xg離心分離。形成了含有底部粘稠相的兩相系統，該相包含高濃度的PEG和聚丙烯酸。上部相是富含水的相。體積比是高的(〉10)。仔細的收集富含水的相，并且放入具有已知重量的另一個15ml玻璃管(B)中。加入1.5g到玻璃管(A)中的粘稠相中，旋渦化，并在3000xg離心分離。重新仔細收集富含水的相，并且放入管(B)中。在這個程序中，將PEG和聚丙烯酸與含有全部的Na2S04的水溶液分離除去。現在將1.5g的13'w't。/。Ba(NO^溫水溶液加入到含有疏酸鹽的管(B)中，并且立即形成BaS04的沉淀。將該管(B)在3000xg離心分離，丟棄上清液。將這個過程重復3次來除去痕量的可溶材料。將帶有BaSO,沉淀物的管(B)在70。C的烘箱中干燥3天。重量分析來確定BaS04的量，然后可以計算Na2S0^的濃度。聚丙烯酸鈉的確定聚丙烯酸鈉的濃度是通過下面的方法，由折射率(RI)來確定的。測定稀釋3倍的相的RI。該值包含了PEG和鹽的貢獻。由所確定的已知濃度的PEG和鹽來確定它們對于折射率的貢獻。所產生的值歸因于聚丙烯酸鈉，其是通過以前所確定的標準曲線來確定的。相分離含水聚合物相系統是根據用于這樣的系統的標準來制備的。為了獲得將干燥聚合物變成完全水合(其在靜置的溶液中可以花費24小時)所需的大致的時間，配制了典型的30-40重量％的聚合物的儲備溶液。在NaPAA的情況中，這樣的儲備溶液可能是市購的。在PEG的情況中，這樣的儲備溶液是通過操作者配制的。所以NaCl(1M)或者其他鹽的儲備溶液例如0.5M磷酸鈉pH6.8也是配制的。為了制備1000g(大約1L)的由6%PEG,6。/。NaPAA，300mMNaCl，50mM磷酸鈉組成的相系統，簡單地混合150g的PEG儲備溶液、150g的NaPAA儲備溶液、300g的NaCl儲備溶液和100g的磷酸鈉儲備溶液，然后加水到所期望的總量。一旦進行了配制，則這樣的系統可以攪拌幾分鐘來確保完全混合，然后使其自然地分成兩相。為了制備10ml相同的系統，將簡單的需要IOO倍的更少量的每個儲備溶液。兩相系統是通過將PEG、聚丙烯酸鈉和鹽的儲備溶液混合到12ml的規格的玻璃管中來形成的。該系統的總重量是10g。將系統上下混合大概15次，該系統變得完全混濁。然后使得該系統在25。C的水浴中分離。該系統通常在30min內完全分離。但是，可以將該系統放置1-2小時。所述相的折射率非常類似，所以難以發現界面。分離的相是透明的，并且具有相當低的粘度(目視觀察)。下表1提供了關于不同的測試的含有PEG4000或者8000和NaPAA8000或者30000和NaCl或者硫酸鈉的兩相系統的信息。在22。C的PEG4000和NaPAA8000兩相系統分別接近于5.28和5.68%,這與低的PEG聚合物MW相一致。比較起來，PEG4000和NaPAA30000臨界濃度是大約4.7重量％的每個聚合物。表l:PEG4000或者8000和NaPAA8000或者30000兩相系統*PEG聚丙烯酸鈉鹽類型和濃度在給定溫度2小時后觀察的相分離Mw4000,Mw30000,NaCl22'C明顯處于雙峰，并且接近于臨界濃'4.7wt%4.7wt%150mM度**Mw4000,Mw8000,NaCl22。C兩相系統接近于雙節點(參見圖1)5.42wty。5.77wt。/。200mMMw4000，Mw8000,NaCl22'C單相系統，接近于雙節點5.28wt%5.68wt%200mMMw8000,Mw謂O,Na肌25'C兩相系統(參見圖2)5.OOwty。5.00wt%230mM*pH~7.5,1.05wt°/。NaCl是大約150mM，3.00wt°/。Na2SO4是大約230mM。**低于這個的聚合物濃度或者低于這個的鹽濃度導致了系統在2小時的期間不出現分離成兩相。實施例2-鹽和pH對于本發明兩相系統的作用如上所述來制備兩相系統。研究了pH對于EOPO3900和NaPAA15000系統的作用。結果表示在下表2中，其提供在200mMNaP緩沖液中的含有EOPO和NaPAA的兩相系統中，pH對于相體積比和相系統形成的作用的觀察。在這些聚合物分子量、濃度和鹽條件時，兩相是在pH6-8形成，而非pH5。表2:鹽和pH對于EOPO3900NaPAA15000兩相系統的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例3-生物分子在聚合物兩相系統中的分配將質粒DNA和RNA如下分配到本發明的兩相系統中pDNA和RNA的分配結果進一步使用Phast⑧系統，和DRIgest111⑧分子量標準物(GEHealthcare)和用于這樣的樣品的出版的GEHealthcare協議，通過凝膠電泳來-險證。運行時間對于pDNA(圖1，通道l-3)來i兌是47分鐘，對于RNA(圖1，通道4-6)來說是30分鐘。結果表示在圖4和下表中。表3:質粒DNA，RNA和模型蛋白質在本發明的不同的APTP系統中的單步分配<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>a.聚合物和鹽的組成以Q/。w/w給出。系統處于20。CpH7。/。分配結果是平均值(X),典型的基于n=3試驗，并且典型的SD<0.IX。b.系統是使用45%(w/w)NaPAA8000Sigma-AldrichNo.416029(Batch12630LC)或者35%(w/w)NaPAA15000Sigma-AldrichNo.416037(Batch05206CA)來配制的。c.系統是使用質粒DNA(pDNA),RNA和測試蛋白質樣品來進行評價的。測試蛋白質是多克隆人類IgG樣品(Gammanorm,0ctapha函)。a/。分配結果是平均值(X),基于n=3試驗，并且典型的SD<0.IX。d.將0.25mg(360pl的0.683mg/ml儲備溶液U1504:IOO)總量的pDNA(6kbp的pJV4)初始時引入到每個管中。產生了總共-O.05mg/ml的[pDNA]。將RNA(U1489088)初始溶解在2.1M(NH4)2S04水溶液中，并且在使用之前，需要使用PD-10色譜柱(GEHealthcare代號No.17-0851-01)進行脫鹽。將該脫過鹽的RNA儲備溶液([RNA]0.16mg/ml)加入到每個管中(386pl的RNA儲備溶液，62.5pg的RNA)，來產生0.025mg/ml的總[RNA]/管。權利要求1.一種能夠形成多相系統的液體混合物，該液體包含第一聚合物、第二聚合物和至少一種鹽，該第一聚合物是聚酸，該第二聚合物是聚醚，其中該第一聚合物的分子量范圍是1000-100000Da。2.根據權利要求1的液體混合物，其中該第一聚合物選自聚(丙烯酸)和聚(曱基丙烯酸)。3.根據權利要求1或者2的液體混合物，其中該第一聚合物和第二聚合物中的至少一個是合成聚合物。4.根據任何一個前述權利要求的液體混合物，其中該第二聚合物的分子量范圍是900-100000Da。5.根據任何一個前述權利要求的液體混合物，其中該第二聚合物包含亞乙基氧。6.根據任何一個前述權利要求的液體混合物，其中該亞乙基氧聚合物選自聚乙二醇、環氧乙烷環氧丙烷共聚物(EOPO)、BreoxTM、Pluronic丁M和含有乙氧基的多糖。7.根據任何一個前述權利要求的液體混合物，其中所述鹽的濃度范圍是l-500mM,優選的范圍是100-300mM。8.根據任何一個前述權利要求的液體混合物，其中所述的鹽選自NaCl、Na2P04、KP04、NaS04、檸檬酸鉀、(NH,)2S04和乙酸鈉;或者其任意的組合。9.根據任何一個前述權利要求的液體混合物，其中總聚合物含量占到了大約8-20%(w/w)。10.根據任何一個前述權利要求的液體混合物，其包含三種或更多種聚合物。11.一種多相系統，其是通過權利要求1-10中任何一個所述的液體混合物來形成的。12.多相系統在至少一種的生物分子、細胞或者粒子的分離中的用途，該多相體系是根據權利要求1-10中任何一個的液體混合物來形成的。13.—種從液體中分離至少一種生物分子或者粒子的方法，該方法包含(a)將第一聚合物與第二聚合物和至少一種鹽進行合并，該第一聚合物是聚酸，該第二聚合物是親水性聚醚；(b)將包含至少一種生物分子或者至少一種粒子的液體與獲自(a)的系統進4亍合并；(c)柔和地混合獲自(b)的液體混合物，直到至少形成兩相；和任選的，(d)從一個相中回收期望的生物分子或者粒子。14.根據權利要求13的方法，其中該聚酸的分子量范圍是1000-100000Da。15.根據權利要求13或者14的方法，其中該聚醚包含亞乙基氧。16.根據權利要求13-15中任何一個的方法，其中在步驟(a)中，提供了根據權利要求1-9中任何一個的液體混合物。17.根據權利要求13-16中任何一個的方法，其中在步驟(a)中，通過優先潤濕將聚合物局限到基質上來提供。18.根據權利要求11-13中任何一個的方法，其中使用單粒子或者粒子的聚集體，并且其中所述粒子的直徑典型的是小于200微米和大于5nm。19.根據權利要求18的方法，其中該粒子和/或聚集體用聚合物共價改性或者以其它方式改性。20.—種用于分離至少一種的目標化合物，細胞或者粒子的試劑盒，該試劑盒包含根據權利要求1-10的任何一個的液體混合物，或者通過權利要求1-10任何一個的液體混合物所形成的多相系統。21.—種用于分離至少一種目標化合物的試劑盒，該試劑盒包含在分開的分隔間中的第一聚合物、第二聚合物和至少一種鹽，以及使用它的書面說明，該第一聚合物是聚酸，該第二聚合物是聚醚，其中該聚酸的分子量范圍是1000-100000Da。22.根據權利要求20或者21的試劑盒，其中所述的成分提供在塑料袋中。23.—種用于進行權利要求13-18中任何一個的方法的試劑盒，該試劑盒包含至少一種在水溶液中的聚酸或者干燥形式的聚酸。24.根據權利要求23的試劑盒，其還包含含有亞乙基氧的第二聚合物，和至少一種鹽，其中該聚酸的分子量范圍是1000-100000Da。25.—種試劑盒，這里一種或多種聚合物富集的相位于容器、粒子或者過濾器的表面上。全文摘要本發明涉及一種液體混合物，其包含第一聚合物、第二聚合物和至少一種鹽，該第一聚合物是聚酸，該第二聚合物是聚醚，其中該聚酸的分子量范圍是1000-100000Da。對該第二聚合物進行選擇，來使得其能夠在聚酸和鹽的存在下形成不混溶的水相。該聚酸可以選自聚(丙烯酸)和聚(甲基丙烯酸)，并且該第二合成聚合物可以包含亞乙基氧。本發明可以用于分離生物分子，細胞或者粒子。文檔編號C07K1/20GK101679480SQ200880020822公開日2010年3月24日申請日期2008年6月16日優先權日2007年6月19日發明者E·馬塞多,G·馬爾姆奎斯特,H·O·約翰松,J·沙納加,J·范阿爾施泰恩,K·拉基,R·約特申請人:通用電氣健康護理生物科學股份公司