專利名稱：微波輔助連續流大規模多肽合成方法與裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽合成方法及其裝置，特別是一種微波輔助連續流大規模多肽合成方 法及其裝置，屬于有機化學和藥物化學領域。
背景技術：
多肽是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質，人工方法合成多肽已有百年的歷史 。隨著生物技術的發展，多肽在醫藥領域有著廣泛的應用，如多肽疫苗、抗腫瘤多肽、抗病 毒多肽、多肽導向藥物、細胞因子模擬肽、抗拒活性肽等。多肽不僅作為新藥開發目標，同 時也成為開發其它藥物的篩選目標。因此，多肽的合成成為各國學者研究的重要課題。
多肽合成的方法可分為液相合成法和固相合成法。自Merrifield創立并發展了固相合 成多肽的方法，使多肽合成領域取得了重大突破，對化學、生化、醫藥、免疫及分子微生物 學等領域也都起了巨大的推動作用。目前，人工合成多肽主要以固相合成為主。
微波是指頻率大于無線電波而小于紅外光的電磁波，其頻率范圍在300腿z 30GHz，相 應的波長lm lcm范圍。大量研究結果表明，經由微波照射可以大幅度提升許多反應的反應 速率，大大縮短反應時間，產率也有所提高。目前研究涉及的反應包括Diels-Alder反應、 Claisen重排、氧化反應、酯化反應、自由基反應、水解反應、親核取代反應等液相反應。 此外，微波照射應用在固相合成反應和酶催化的反應上，也可以很好地促進反應的進行( J. Z. Carrillo-Munoz， D. Bouvet， E. Guibe-Jampel ， J. Org. Chem.， 1996， 61-7746)
Wang等的研究指出，在使用微波照射的條件下，使用固相合成儀器合成目標多肽，一 方面使偶聯反應的時間縮短在6min內(常規的液相合成這一多肽大約需要3h)，另一方面偶 聯效率也大大提高(比液相合成法大約提高了16%) (H.M.Yu， S.T.Chen， K. T. Wang ， J. Org. Chem. ， 1992， 57-1781)。據此，美國CEM公司生產出Liberty微波多肽合成儀，使多肽 合成的時間由過去以小時為單位計算的歷史改寫為以分鐘為單位計算。此外，中國發明專利 CN1298732C公開了一種多肽微波固相合成法，將微波技術用于多肽的固相合成，取得了一 定的成果。
但是，目前國內多肽合成企業的產量較低，大部分僅達到克級水平，而國外已經有很多企業的生產水平已經達到公斤級甚至幾十公斤級，但是合成的效率及得率都不是很高。因此 ，開發一種可以高效率的大規模合成多肽的方法和裝置，對于促進我國多肽藥物的發展，實 現高效低成本多肽的合成具有積極意義。
發明內容
本發明的目的是針對上述不足之處，提供一種微波輔助連續流大規模多肽合成方法及其 裝置，將多肽的產量提高到公斤級甚至幾十公斤級，從而實現了多肽的大規模生產。 本發明為達到以上目的，是通過如下技術方案實現的
一種微波輔助連續流大規模多肽合成裝置，包括反應釜和微波反應中心，微波反應中心 設有出樣孔和進樣孔；反應釜的上端設有加料口和回流進口，回流進口與微波反應中心的出
樣孔通過管路連接，反應釜的下端設有出料口和回流出口，回流出口與微波反應中心的進樣 孔通過管路連接，在反應釜和微波反應中心的連接管路上設有在線檢測裝置和動力裝置。此 微波輔助連續流大規模多肽合成裝置可以在短時間里，化學合成任何肽鏈長度的多肽以及多 肽化合物，合成的多肽化合物可以方便地經在線檢測裝置檢測。微波反應中心所采用的微波
發射為單模形式，所用的微波頻率可以是915腿z、 2450腿z、 5800腿z或22125腿z，其中較為 常用的是2450 MHz。經由微波輻射，大幅度提升了整個合成反應的反應速率，大大縮短反應 時間，產率也有所提高。
本發明的動力裝置優選泵，通過調節泵的流速可以很好地控制反應物質流經微波反應中 心的時間，使反應更為充分。
作為優選，反應釜和微波反應中心設有自動調節速度的攪拌裝置，該攪拌裝置為外接機 械攪拌或磁力攪拌。
作為優選，微波反應中心設有紅外測溫裝置、壓力檢測裝置和冷卻裝置，冷卻裝置優選 為冷凝回流裝置。紅外測溫裝置、壓力檢測裝置和冷卻裝置可以更好的控制反應過程，使合 成反應較為充分。
作為優選，加料口設有多通道的閥門，與原料罐、試劑罐和洗脫液罐連接；出料口設有 兩通道閥門，分別與樣品收集器和廢液罐連接；所述的出料口還設有篩網，能有效地將固體 反應基質與反應溶劑分離。
作為優選，在線檢測裝置選用紫外檢測器、紅外檢測器、拉曼光譜儀中的一個或兩個以上。
作為優選，反應釜由耐酸、耐堿、耐有機溶劑的材料制成，更為理想的材料是高密度聚 丙烯。本發明裝置可設置閥門控制、各種溫度和壓力控制及各種動力系統的控制，將其連接到 工作站，達到自動化控制的目的。
此方法并不只局限于Fmoc、 t-Boc或NSC化學合成法。
此方法并不只局限于多肽的合成，也可以用于其它分子，如碳水化合物、蛋白質化合物 等的大規模合成。
本發明使用的專用術語名稱以及多肽載體的制備，多肽的偶聯合成反應以及多肽偶聯反 應的監測方法都是本領域中為人熟知和常用的，除非有另外不同的定義，本文所使用的技術 與科學術語與本發明所屬領域一般技術人員通常所理解的一樣。但是關于本發明的實施或實 驗，現對以下術語予以定義，并對本發明中的設計與材料加以描述。
多肽反應載體反應載體是一種具有硬性或半硬性表面，但同時具有功能鏈團的高分子 材料。 一般以聚苯乙烯或聚乙烯為基本骨架，通過化學修飾，氨基酸可連接到反應載體上。 反應載體的孔徑一般為100 200目或70目，如此可以保持在過濾時反應載體與溶劑的徹底分 離。
多肽合成反應指按照多肽的自然序列，通過化學合成的方法將多種氨基酸連接起來。 多肽合成需要反應釜、反應載體、洗脫試劑、偶聯試劑等。本發明將反應物通過微波反應中 心的微波輻射來提升整個多肽合成反應的反應速率，縮短反應時間。本發明的反應載體是氨 基酸樹脂。
常用氨基酸雖然本發明可適用于任何保護氨基酸、小分子化合物的固相合成，但本發 明僅采取L-型常用保護氨基酸作為實例。
使用該合成裝置來大規模合成多肽的操作過程如下
① 取適量氨基酸-樹脂復合物投入反應釜，加入脫保護基試劑，在微波反應中心的微波 輻射下脫除氨基保護基，之后濾掉脫保護基試劑，用試劑DMF洗滌樹脂；根據多肽序列，向 反應釜中加入下一個預先活化的帶保護基氨基酸和偶聯試劑，在微波反應中心的微波輻射下 進行氨基酸偶聯反應，之后濾掉殘留的氨基酸與試劑液體，用試劑DMF洗滌樹脂；
② 按照氨基酸從羧基端到氨基端的順序，更換氨基酸，重復步驟①，合成所需的多肽；
③ 多肽完成所有的序列與反應后，加入切割試劑，在微波反應中心的微波輻射下進行切 割，得到多肽粗品。
本發明中所述的在微波反應中心的微波輻射下脫除氨基保護基和進行氨基酸偶聯反應的 時間可以根據實際情況和需要進行調節。
作為優選，脫除氨基保護基的反應時間為1 15分鐘，洗滌后采用通氮氣的方法脫液，
6重復洗滌、脫液操作3 5次；多肽偶聯反應的時間為1 15分鐘，洗滌后采用通氮氣的方法 脫液，重復洗滌、脫液操作2 3次。通氮脫液的方法使固液分離更為充分，減少了洗滌的次數。
本發明的方法使用能夠吸收微波的溶劑如二甲基甲酰胺(DMF)為介質，將微波技術應 用在多肽合成中，利用微波的特殊效應，降低反應的活化能，提高反應速度。
本發明通過使反應物質在反應釜和微波反應中心之間的循環流動，來達到在反應體系局 部加入微波輻射的目的，縮短了反應時間，實現了目標產物的大規模快速合成。本發明不僅 提高了反應效率，減少了副反應的產生，而且提高了合成收率，將多肽的產量提高到公斤級 或幾十公斤級，同時降低了多肽的生產成本，有效解決了多肽生產成本高、合成周期長等問 題，具有顯著的社會價值和經濟效益。
圖l是本發明的微波輔助連續流大規模多肽合成裝置示意圖。
標號說明l反應釜，2微波反應中心，3動力裝置，4在線檢測裝置，5加料口， 6出料口 ，7回流出口， 8回流進口， 9出樣口， IO進樣口， ll原料罐，12試劑罐，13洗脫液罐，14廢 液罐，15樣品收集器。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例對本發明作進一步說明。
由圖1所示，本發明的大規模多肽合成裝置包括反應釜1和微波反應中心2。微波反應中 心2設有出樣孔9和進樣孔10。微波反應中心2外部設有微波發生裝置，所采用的微波發射為 單模形式，微波頻率為2450腿，也可以是915腿z、 5800腿z或22125腿z。微波反應中心設有 紅外測溫裝置、壓力檢測裝置及冷卻回流裝置。紅外測溫裝置和壓力檢測裝置能監控整個化 學反應的溫度和壓力，使整個化學反應在最佳反應溫度下進行，以達到最佳的合成得率，并 最大限度地減少副反應。冷卻回流裝置能保證微波反應中心溫度過高時調節至化學反應最佳 的溫度。
反應釜1的上端設有加料口5和回流進口8，回流進口8與微波反應中心2的出樣孔9通過管 路連接，反應釜1的下端設有出料口6和回流出口7，回流出口7與微波反應中心2的進樣孔10 通過管路連接。加料口5接有多通道的閥門，分別與原料罐ll、試劑罐12和洗脫液罐13連接 。為方便固態物料的加入，可以設置開口較大的加料口；也可以在反應釜l上端加設可密封 的蓋子，固態物料通過蓋子加入，之后使其密封。出料口6接有兩通道閥門，分別與樣品收 集器15和廢液罐14連接。出料口蓋有篩網，以防止排液時固態物料隨廢液流出。可以根據需要設置多個原料罐，放置合成目標肽所需要的各種氨基酸，根據肽序列設計 進樣順序。試劑罐也可以根據需要設置，以保證整個化學反應能夠順利完成，洗脫罐也可以 根據化學反應的需要來設計。
在反應釜1和微波反應中心2的連接管路上設有在線檢測裝置4和動力裝置3。在線檢測裝 置4為紫外檢測器，也可以選用紅外檢測器和拉曼光譜儀中的一個或兩個。動力裝置3為泵， 通過調節泵的流速可以很好地控制反應物質流經微波反應中心2的時間，使反應更為充分。 反應釜1和微波反應中心2均設有自動調節速度的攪拌裝置，使反應物混合均勻。
反應釜由高密度聚丙烯制成，也可以由其它耐酸、耐堿、耐有機溶劑的材料制成。本裝 置的連接管路均為耐酸、耐堿、耐有機溶劑的材料制成。本發明的裝置可設置閥門控制、各 種溫度和壓力控制及各種動力系統的控制，將其連接到工作站，達到自動化控制的目的。
一般的Fmoc固相合成的技術與步驟均適用于這里。雖然所有的氨基酸(包括D-型)在這 里都適用，此實施例僅選用L-型的保護氨基酸。所有的氨基酸載體取代度控制在0.4mmol/g 左右。所用溶劑如DMF、偶聯劑如HBTU等為常規用法。
實施例l 胸腺五肽的制備
① 取5. 25kg取代度O. 4 mmol/g的Fmoc-Tyr (tBu) -Wang樹脂投入反應釜，加入脫保護基 試劑30L，啟動泵使反應物在微波反應中心與反應釜間循環流動，同時開啟微波反應中心的 微波發生裝置使其產生微波，微波設置在7CTC， 1.2MPa。反應物經過微波反應中心時，在 微波輻射下加速了脫除氨基保護基的反應。5分鐘后，關閉泵并停止微波輻射，濾掉脫保護 基試劑，加入試劑DMF 10.5L洗滌樹脂3次，通氮氣排液。根據多肽序列，向反應釜中加入預 先活化的Fmoc-Val-OH和偶聯試劑HBTU，所用試劑的摩爾比為原料樹脂
:Fmoc-Val-0H:HBTU=1:3: 3，在微波反應中心的微波輻射下偶聯氨基酸，5分鐘后，濾掉殘 留的氨基酸與試劑液體，用試劑DMF洗滌樹脂2次。
② 按照胸腺五肽中氨基酸從右往左的順序(H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH)，更換氨基酸 ，氨基酸和偶聯試劑的用量和Fmoc-Val-OH相同，重復步驟①，合成胸腺五肽。
③ 向制備好的胸腺五肽中加入三氟乙酸50L，在微波反應中心的微波輻射下進行切割， 得到多肽粗品1.2kg。用液相色譜測得其純度為91.6%，產率為84%。
實施例2胸腺五肽的制備
本實施例要合成的多肽和操作與實施例l完全相同，僅采用的工藝條件有所不同。 ①微波輻射的時間為20分鐘，濾掉脫保護基試劑后洗滌樹脂5次，濾掉殘留的氨基酸與 試劑液體后洗滌樹脂3次，其余同實施例l。②、③步驟同實施例1。得到多肽粗品1.38kg。用液相色譜測得其純度為92. 5%，產率為
96%。
實施例3 胰高血糖素樣肽-1 (Glucagon-Like P印tide I)的制備
① 取1.26kg取代度0. 4mmol/g的Fmoc-Arg (Pbf) -Amide樹脂投入反應釜，加入脫保護 基試劑10L，啟動泵使反應物在微波反應中心與反應釜間循環流動，同時開啟微波反應中心 的微波發生裝置使其產生微波，微波設置在7CTC， 1.2MPa。反應物經過微波反應中心時， 在微波輻射下加速了脫除氨基保護基的反應。l分鐘后，關閉泵并停止微波輻射，濾掉脫保 護基試劑，加入試齊IJDMF 12.6L洗滌樹脂3次，通氮氣排液。根據多肽序列，向反應釜中加入 預先活化的Fmoc-Gly-OH和偶聯試劑HBTU，試劑的摩爾比為原料樹脂
:Fmoc-Gly-0H:HBTU=1:3: 3，在微波反應中心的微波輻射下偶聯氨基酸，l分鐘后，濾掉殘 留的氨基酸與試劑液體，用試劑DMF洗滌樹脂2次。
② 按照胰高血糖素樣肽-l中氨基酸從右往左的順序
(His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gin-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-lie-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2)，更換氨基酸，氨基酸和偶聯試劑的用 量和Fmoc-Gly-0H相同，重復步驟①合成胰高血糖素樣肽-1 。
③ 向制備好的胰高血糖素樣肽-l中加入三氟乙酸12. 6L，在微波反應中心的微波輻射下 進行切割，得到多肽粗品1.5kg。用液相色譜測得其純度為86. 4%，純化后產率為90%。
實施例4 胸腺肽(Thymosin Alpha 1)的制備
① 取13.4kg取代度0.3mmol/g的Fmoc-Asn (trt) -Wang樹脂投入反應釜，加入脫保護基 試劑134L，啟動泵使反應物在微波反應中心與反應釜間循環流動，同時開啟微波反應中心的 微波發生裝置使其產生微波，微波設置在7CTC， 1.2MPa。反應物經過微波反應中心時，在 微波輻射下加速了脫除氨基保護基的反應。10分鐘后，關閉泵并停止微波輻射，濾掉脫保護 基試劑，加入試劑DMF 134L洗滌樹脂3次，通氮氣排液。根據多肽序列，向反應釜中加入預 先活化的Fmoc-Glu(tBu)-OH和偶聯試劑HBTU，所用試劑的摩爾比為原料樹脂
:Fmoc-Glu-0H:HBTU=1:3: 3，在微波反應中心的微波輻射下偶聯氨基酸，10分鐘后，濾掉殘 留的氨基酸與試劑液體，用試劑DMF洗滌樹脂2次。
② 按照胸腺肽中氨基酸從右往左的順序 (Ac—Ser—Asp—Ala—Ala—Val—Asp—Thr—Ser—Ser—Glu—Ile—Thr—Thr—Lys—Asp—Leu—Lys—Glu—Lys— Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn)更換氨基酸，氨基酸和偶聯試劑的用量和 Fmoc-Glu-0H相同，重復步驟①，合成胸腺肽。
9③向制備好的胸腺肽中加入三氟乙酸134L，在微波反應中心的微波輻射下進行切割，得 到多肽粗品11.3kg。用液相色譜測得其純度為88. 1%，產率為91%。
以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明 的具體實施只局限于這些說明。實施例中所述的在微波反應中心的微波輻射下脫除氨基保護 基和進行氨基酸偶聯反應的時間可以根據實際情況和需要進行調節。對于本發明所屬技術領 域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，做出的若干簡單推演或替換，都應 當視為屬于本發明所提交的權利要求書確定的專利保護范圍。
權利要求
1.一種微波輔助連續流大規模多肽合成裝置，包括反應釜，其特征在于本裝置還包括微波反應中心，微波反應中心設有出樣孔和進樣孔；所述反應釜的上端設有加料口和回流進口，回流進口與微波反應中心的出樣孔通過管路連接，反應釜的下端設有出料口和回流出口，回流出口與微波反應中心的進樣孔通過管路連接；在反應釜和微波反應中心的連接管路上設有在線檢測裝置和動力裝置。
2.根據權利要求l所述的合成裝置，其特征在于所述的反應釜和微 波反應中心設有自動調節速度的攪拌裝置，該攪拌裝置為外接機械攪拌或磁力攪拌。
3.根據權利要求1或2所述的合成裝置，其特征在于所述的微波反 應中心設有紅外測溫裝置、壓力檢測裝置和冷卻裝置。
4.根據權利要求1或2所述的合成裝置，其特征在于所述的加料口 設有多通道的閥門，與原料罐、試劑罐和洗脫液罐連接；所述的出料口設有兩通道閥門，分 別與樣品收集器和廢液罐連接；所述的出料口還設有篩網。
5.根據權利要求3所述的合成裝置，其特征在于所述的加料口設有 多通道的閥門，與原料罐、試劑罐和洗脫液罐連接；所述的出料口設有兩通道閥門，分別與 樣品收集器和廢液罐連接；所述的出料口還設有篩網。
6.根據權利要求1或2所述的合成裝置，其特征在于所述在線檢測 裝置是紫外檢測器、紅外檢測器、拉曼光譜儀中的一個或兩個以上。
7.根據權利要求3所述的合成裝置，其特征在于在線檢測裝置是紫 外檢測器、紅外檢測器、拉曼光譜儀中的一個或兩個以上。
8.根據權利要求1或2所述的合成裝置，其特征在于所述的反應釜 由耐酸、耐堿、耐有機溶劑的材料制成。
9. 一種利用權利要求l所述的合成裝置來大規模合成多肽的方法，其 操作過程如下①取適量氨基酸-樹脂復合物投入反應釜，加入脫保護基試劑，在微波反應中心的微波輻射下脫除氨基保護基，之后濾掉脫保護基試劑，用試劑DMF洗滌樹脂；根據多肽序列，向 反應釜中加入下一個預先活化的帶保護基氨基酸和偶聯試劑，在微波反應中心的微波輻射下 偶聯氨基酸，之后濾掉殘留的氨基酸與試劑液體，用試劑DMF洗滌樹脂；② 按照氨基酸從羧基端到氨基端的順序，更換氨基酸，重復步驟①，合成所需的多肽③ 多肽完成所有的序列與反應后，加入切割試劑，在微波反應中心的微波輻射下進行 切割，得到多肽粗品。
10.根據權利要求9所述的大規模合成多肽的方法，其特征在于所 述脫除氨基保護基的反應時間為1 15分鐘，洗滌后采用通氮氣的方法脫液，重復洗滌、脫 液操作3 5次；多肽偶聯反應的時間為1 15分鐘，洗滌后采用通氮氣的方法脫液，重復洗 滌、脫液操作2 3次。
全文摘要
本發明提供了一種微波輔助連續流大規模多肽合成方法與裝置，該裝置主要包括反應釜、微波反應中心以及連接管路，在反應釜和微波反應中心的連接管路上設有在線檢測裝置和動力裝置。本發明通過使反應物質在反應釜和微波反應中心之間的循環流動，來達到在反應體系局部加入微波輻射的目的，縮短了反應時間，實現了目標產物的大規模快速合成，將多肽的產量提高到公斤級或幾十公斤級。
文檔編號C07K1/00GK101538310SQ20091030105
公開日2009年9月23日 申請日期2009年3月23日 優先權日2009年1月13日
發明者卜遠波, 琪 徐, 湘 李 申請人:杭州中肽生化有限公司