專利名稱：一種檢測細胞內鋅離子的分子熒光開關及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物分析檢測技術領域，具體涉及高選擇性檢測鋅離子，尤其涉及一 種可用于活細胞中鋅離子測定的分子熒光開關。
背景技術：
分子熒光開關檢測金屬離子相對于其他檢測手段優點有可以實現對于單個離 子的高檢測靈敏性；鋅離子最外層3(^48°電子構型，通常使用許多常規的分析手段如紫 外-可見光譜、Mtossbauer譜、核磁共振譜(NMR)、順磁共振譜(EPR)等都得不到合適的光譜 信號或者磁信號。但使用熒光分子探針檢測鋅離子和銅離子具有快速響應、高靈敏度、低檢 測閾值和易于操作等特點，是非常行之有效的方法。鋅是人體必需的重要微量元素，鋅能提高人體免疫功能，并能達到抗衰老的作用； 鋅可加速創傷愈合，刺激性機能；微量鋅可強化記憶力，延緩腦的衰老；鋅能保護心肌免遭 異丙腎素導致的心肌損害；鋅與利尿劑合用能加強降壓作用，有利于控制高血壓、冠心病的 發生。對生長發育中的嬰兒、兒童和青少年具有更重要的營養價值。鋅是人體內200多種 酶和蛋白質的重要組成成分，也是許多酶的催化劑，廣泛參與了生命活動的各個方面。其中 最重要的含鋅的酶和蛋白質有DNA聚合酶、RNA聚合酶、蛋白轉錄因子、堿性磷酸酶、味覺蛋 白、消化酶等。鋅是這些重要生命大分子的活性結構成分。DNA聚合酶是DNA復制的關鍵 物質之一，缺乏鋅元素時DNA聚合酶數量減少，活性降低，導致DNA復制速率減慢，結果使細 胞的分裂速度降低甚至停滯。鋅缺乏還使RNA聚合酶的數量與質量降低，直接影響基因的 表達，從而使上述含鋅蛋白質和酶的合成受到阻礙。所以說鋅直接參與核酸蛋白質的合成、 細胞的分化和增殖以及許多代謝，人體內還有一些酶需要鋅的激活，而發揮其活性作用。因 此，采用熒光分子探針的方法檢測鋅離子，尤其是跟蹤其化學反應及其在生命中的作用過 程就變成一件非常有意義的事情。中國專利01805747. 0 “鋅熒光探針”及中國專利200410019339. 2 “稀土 -過渡混
和金屬配合物型鋅離子熒光探針”報道的鋅離子熒光探針制備相對復雜。而且相應的熒光 探針分子在生物檢測方面的應用未見報道。為此，在現有研究基礎上發現性能更優、合成更 易和生產成本更低的新型熒光分子探針則具有非常重要的使用價值。
發明內容
本發明目的之一提供一種具有良好的選擇性、能檢測鋅離子的熒光探針；目的之 二是提供該熒光探針在生物檢測鋅離子中的應用。本發明熒光探針分子具有以下結構通式 通式中R1代表烷基，R2代表烷基、羥基。在上述通式的熒光分子探針中，烷基是具有1-20個碳原子的直鏈或異構烷基，如 甲基、乙基、正丙基、異丙基等短鏈烷基。在上述通式中酰胺保護的萘啶希夫堿芳基衍生物 具有多個配位原子，可以識別特定半徑及電子結構的金屬離子。熒光基團的光誘導電子轉 移受控于識別基團。烷基和羥基的引入有助于改善探針分子在不同極性的溶劑中的溶解 性，芳基的引入有助于調節熒光探針分子的共軛長度從而通過改變激發態電子云分布調節 探針發光在可見光區和發光顏色。本發明熒光探針通過如下路徑合成 從
中可以看出，在多種的金屬離子中，該類熒光探針只對鋅離子表現出 良好的選擇性，對其他金屬具有抗干擾性。因此，該類熒光探針可以應用于金屬離子檢測， 特別是在生物組織中鋅離子的檢測。本發明設計、合成的生物熒光分子探針具有結構相對簡單、易于合成等特點。并且 在細胞中的識別效果良好，可實現生物細胞或組織的實時熒光成像、在有干擾離子存在的 情況下實現痕量鋅離子熒光檢測。在鋅離子的濃度最小為0. 68% g · L—1時，1分鐘以內熒 光強度可以增強到探針分子起始強度的九倍以上。
圖1為本發明熒光探針分子(濃度為5. OX 10_5M)乙醇溶液對于Zn2+的熒光光譜 響應圖。在圖1中，橫坐標為熒光發射波長(nm)，縱坐標為熒光強度；圖中箭頭表示鋅離子 濃度增加，直至探針分子濃度的12倍為止。圖2為本發明熒光探針分子(濃度為5. OX I(T5M)乙醇溶液對Zn2+紫外-可見吸 收光譜圖。在圖2中，橫坐標為吸收波長(nm)，縱坐標為吸收強度；圖中箭頭表示鋅離子濃 度增加，直至探針分子濃度的12倍為止。圖3為本發明熒光探針分子(濃度為5. OX I(T5M)乙醇溶液對于不同的金屬離子 的熒光響應圖。圖中橫坐標為熒光發射波長(nm)，縱坐標為熒光強度，激發波長為370nm。
41為Zn2+的熒光光譜響應曲線；2為其它金屬離子Cu2+、Ca2+、Co2+、Cr3+、Fe2+、Hg2+、K+、Mg2+、 Mn2+、Na+、Ni2+熒光光譜響應曲線。圖4為本發明熒光探針分子(濃度為5. OX I(T5M)乙醇溶液對于不同的金屬離子 (數字 1 到 13 分別對應于無金屬離子、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Co2+、Cr3+、Fe2+、Hg2+、K+、Mg2+、Mn2+、 Na\Ni2+)及熒光探針分子與鋅離子識別后加入高濃度干擾離子(加入量為鋅離子的10倍， 數字從 14 到 23 干擾離子分別是 Na+、Mg2+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Co2+、Cr3+ 和 Ni2+)的最大 熒光強度變化。縱坐標為1/%。I表示加入金屬離子在505nm處的熒光強度，Itl表示未加 入金屬離子在505nm處的熒光強度，激發波長為370nm。圖5、圖6和圖7為37°C時使用激光共聚焦顯微鏡拍攝的在人體MCF-7活細胞內 探針分子對鋅離子識別的情況。圖5是加入10 μ M探針分子細胞照片，圖6是加入探針分 子后的細胞再引入鋅離子后的熒光照片，圖7是拍攝熒光照片時的明場像。
具體實施例方式為對本發明進行更好的說明，舉實施例如下實施例1本發明熒光探針的制備在配有球形冷凝管的IOOml的單口圓底燒瓶中，加入等當量的對羥基苯胺和4-甲 基-7-乙酰氨基-1，8-萘啶醛，使之充分溶解在甲醇中。密封體系，氬氣做為保護氣，除氣。 回流5h，反應結束。旋蒸，粗產物用硅膠層析(200 300目)分離純化，二氯甲烷作洗脫 劑，得產物，黃色固體。然后在甲醇中重結晶。熒光探針的基本數據1H-NMR δΗ(400ΜΗζ ；DMSO ；Me4Si) 11. 06 (s, 1H, -0H) ,9. 75 (s, 1H, NH)，8. 64 (m，1H， naph)，8. 52(m,1H, naph)，8. 37 (m,1H, naph)，8. 02(s,1H, CH = N)，7. 36(d,2H, phenyl)， 7. 06(d，2H，phenyl) ,2. 70(s，3H，CH3), 2. 18(s，3H，COCH3). 13C-NMR δ c(100MHz, DMSO) 170. 65，157. 49，154. 95，146. 94，141. 65，136. 52，123. 72，120. 92，117. 90，116. 35，115. 29， 24. 66，18. 36.4-甲基-7-乙酰氨基-1，8-萘啶醛的合成參見文獻Ζ. Χ. Li，W. F. Fu, Μ. Μ. Yu， Χ. J. Zhao, Y.Chen Dyes and Pigments 2007，75，516-520.。實施例2本發明熒光探針的應用配制5. 0 X ICT5M的熒光探針乙醇溶液，和各種金屬離子1. 0 X ICT2M的乙醇溶液，取 兩毫升上述配制的探針溶液于比色皿中，逐漸往比色皿中加入鋅離子溶液，用熒光光譜儀 檢測鋅離子的加入對探針的熒光光譜性質的影響。其它金屬離子對探針的熒光光譜的影響 測試和鋅離子的類似。其它金屬離子對鋅離子熒光探針的干擾性研究和鋅離子的類似。結合附圖，光譜分析表明，本發明熒光探針分子對于鋅離子具有很高的選擇性，熒 光探針分子的低濃度溶液加入鋅離子后熒光顯著增強，強度可以達到原來熒光強度的15 倍，顏色發生改變，該選擇性不受鉀、鈣、鈉、鎂離子的影響。該熒光探針可以在活細胞內完 成對鋅離子的熒光檢測。在鋅離子的濃度最小為0. 68% g · L—1時，1分鐘以內熒光強度可 以增強到探針分子起始強度的九倍以上。該類熒光探針結構簡單，合成方法簡單且效率高，具有實際應用價值。
權利要求
一種檢測細胞內鋅離子的分子熒光開關，其特征在于，熒光探針分子具有以下結構通式通式中R1代表C1 20烷基；R2代表C1 20烷基或羥基。FSA00000134585400011.tif
2.如權利要求1所述的檢測細胞內鋅離子的分子熒光開關，其特征在于，烷基優選甲 基、乙基、正丙基或異丙基。
3.如權利要求1或2所述的分子熒光開關在檢測生物細胞內金屬離子中的應用，其特 征在于，將其應用于鋅離子檢測。
全文摘要
本發明公開了一種檢測細胞內鋅離子的分子熒光開關及其應用，屬于生物分析檢測技術領域。該熒光探針分子具有以下結構通式通式中R1代表烷基，R2代表烷基、羥基。該熒光分子探針具有結構相對簡單、易于合成等特點。可應用于金屬離子檢測，特別是在生物組織中鋅離子的檢測。在細胞中的識別效果良好，可實現生物細胞或組織的實時熒光成像、在有干擾離子存在的情況下實現痕量鋅離子熒光檢測，具有較好的應用開發前景。
文檔編號C07D471/04GK101914375SQ20101018180
公開日2010年12月15日 申請日期2010年5月25日 優先權日2010年5月25日
發明者于明明, 劉金霞, 張利鋒, 李占先, 虞明, 魏柳荷 申請人:鄭州大學