用于流感病毒m2離子通道阻斷劑篩選的熒光細胞模型及其應用方法

專利名稱：用于流感病毒m2離子通道阻斷劑篩選的熒光細胞模型及其應用方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及抗流感藥物的篩選，更具體涉及流感 病毒M2離子通道的熒光細胞模型及利用該細胞模型篩選M2離子通道阻斷劑的 方法。
背景技術：
流感是由流行性感冒病毒引起的嚴重危害人類健康的一種急性病毒性呼吸 道傳染病。M2離子通道蛋白分布于流感病毒表面，是由97氨基酸組成的跨膜 蛋白，四個M2離子通道蛋白單體通過二辟J建和疏水作用形成四聚體，并構成一 個離子通道，是抗流感藥物的重要靶標。阻斷M2離子通道的功能可以有效地抑 制病毒感染細胞和復制，阻斷病毒感染的擴散。目前臨床上使用的M2離子通道 阻斷劑金剛胺和金剛乙胺在治療流感中發揮了重要作用，但流感病毒對金剛胺 和金剛乙胺產生了嚴重的抗藥性。有必要建立新的M2離子通道阻斷劑篩選模 型，從化合物庫中隨機篩選，發現新的M2離子通道阻斷劑，特別是發現對金剛 烷胺耐藥型M2離子通道有效的新阻斷劑。目前篩選抗流感藥物方法包括體外實驗和體內實驗，體外實驗有病毒抑制實 驗和噬斑實驗病毒抑制試驗是利用化合物抑制病毒感染或復制，進而保護細 胞，通過檢測細胞活力達到篩選抗流感藥物的目的；噬斑實驗也是利用化合物 抑制病毒感染或復制保護細胞，但通過檢測噬斑數來篩選藥物。體外實驗即動 物實驗，以小鼠，雪貂等為對象，對動物給藥后檢測化合物是否具有保護作用。 這些實驗方法難以進行高通量篩選，且靶標不明，動物實驗的成本又高，影響 因素多。M2作為離子通道，其高通量篩選方法的建立還有一定難度首先由于M24離子通道在細胞上表達時對細胞有毒性作用，建立M2離子通道的模型困難；而 且現有的離子通道研究方法有限，如電生理(膜片鉗)，配體結合，離子流量測定 等，而利用這些方法實現高通量還有一定難度。發明內容為了克服上述技術缺陷，本發明提供了 一種用于流感病毒M2離子通道阻斷 劑篩選的熒光細胞模型。同時，本發明還提供了利用該細胞模型篩選流感病毒 M2離子通道阻斷劑的方法。本發明的用于流感病毒M2離子通道阻斷劑篩選的熒光細胞模型是含pH敏 感的焚光物質的細胞。優選的，所述的熒光物質為萸光指示劑或熒光蛋白。優選的，所述的熒光指示劑包括熒光探針SNARF( seminaphthorhodafluors )、 熒光探針SNARP -AM、 8-羥基-l，3，6-三磺酸芘(HPTS， pyranine)、熒光素 Fluoresceins' J^^萸光素carboxyfluoresceins、 1， 2， 7-雙-(叛乙基)陽數基-焚光素 (BCECF)、雙羧乙基碳氧熒光素四乙酰氧曱酯(BCECF-AM)。優選的，所述的熒光蛋白包括綠色熒光蛋白、增強型黃色熒光蛋白或熒光 蛋白pHluorin。優選的，所述的所述的綠色熒光蛋白包括含有S65T突變的綠色熒光蛋白突 變體。優選的，所述的含有S65T突變的綠色熒光蛋白包括S65T綠色熒光蛋白突 變體、增強型綠色萸光蛋白、F64L/S65T/T203Y/L231H綠色熒光蛋白突變體或 C48S/S65T/H148C/T203C綠色熒光蛋白突變體。本發明提供的M2離子通道阻斷劑篩選的細胞模型，是指將pH敏感的熒光 指示劑和熒光蛋白標記M2表達細胞，標記方法 一是將熒光指示劑微量注射入 細胞內；二是熒光指示劑與細胞一起孵育，脂溶性的熒光指示劑如BCECF-AM 等通過細胞膜進入細胞內；三是利用M2離子通道和熒光蛋白表達載體(如pEGFP-Cl)共轉染細胞，建立M2離子通道與焚光蛋白共表達的穩定細胞。上述的細胞模型在流感病毒M2離子通道阻斷劑篩選中的應用方法是測定 在酸性緩沖液條件下所述細胞模型中熒光值的變化。優選的，酸性條件為pH值 低于6.2的條件。在低于pH6.2的酸性環境中M2離子通道打開，細胞外的H+通過M2離子 通道迅速內流，導致細胞內pH下降，pH的變化引起熒光值的改變。如果存在 M2離子通道阻斷劑，在酸性環境中H+的內流收到抑制，細胞內pH下降減慢。 通過檢測細胞熒光值，反映M2離子通道的抑制情況，從而反映M2離子通道阻 斷劑的活性。本發明中所用的pEGFP-Cl表達質粒為Clontech公司的商業化產品， BCECF-AM為Invitrogen公司的商業化產品。由于M2離子通道是H+通道，H+的流動將改變M2離子通道兩端的pH值。 M2離子通道表達于細胞膜上時，N端在膜外而C端在膜內。當細胞外pH下降 至pH6.2以下時，M2離子通道打開，H+由胞外流向胞內，胞內pH隨之下降。 因此，可以利用熒光pH指示劑雙羧乙基碳氧熒光素四乙酰氧曱酯(BCECF-AM)、 增強型綠色熒光蛋白(GFP)等建立M2離子通道阻斷劑篩選的細胞^t型，測定 細胞內熒光值反映pH的變化，同時也反映M2離子通道的打開情況。根據此原 理可建立M2離子通道阻斷劑的高通量篩選方法。本發明的優點在于，通過測定熒光值反映細胞內pH的變化，直接反映通過 M2離子通道的H+流動情況，利用該細胞;漠型建立的M2離子通道阻斷劑篩選 方法藥物作用機制明確，方法簡便、快速、直接，適合M2離子通道阻斷劑的高 通量準確篩選。


圖1為本發明的H5N1 A型流感病毒M2離子通道的表達的一個優選實施例 的結果圖；圖2為本發明的細胞內增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的熒光強度與pH值相關的 一個優選實施例的結果圖；圖3為本發明的在酸性緩沖液中細胞內增強型綠色熒光蛋白(EGFP)熒光強 度與M2離子通道相關的一個優選實施例的結果圖；圖4為本發明的M2表達細胞中增強型綠色熒光蛋白(EGFP)熒光強度下 降與未表達M2細胞之間的比較的一個優選實施例的結果圖；圖5 - 1為本發明的M2離子通道的表達水平western blot的一個優選實施例 的結果圖；圖5-2為本發明的pH5.49時熒光強度下降的一個優選實施例的曲線圖； 圖6為本發明的細胞內源性酸敏感離子通道(ASICs)對M2離子通道活性-險測的影響的 一個優選實施例的結果圖；圖7為本發明的金剛烷胺阻斷M2離子通道的IC500imol/L)的一個優選實施例的結果圖；圖8為本發明的金剛烷胺不能抑制耐藥型M2離子通道活性的一個優選實 施例的結杲圖；圖9為本發明的雙羧乙基碳氧熒光素四乙酰氧曱酯(BCECF-AM) M2表達 細胞中熒光強度下降與未表達M2細胞之間的的一個優選實施例的比較結果圖；圖10為本發明的金剛烷胺抑制M2離子通道的劑量反應的一個優選實施例 的曲線圖。
具體實施方式
為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應 理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例一H5N1 A型流感病毒M2離子通道與增強型綠色熒光蛋白 (EGFP)共表達細胞的建立1. H5N1 A型流感病毒M2離子通道蛋白基因的獲得以H5N1病毒抹的共有氨基酸序列為模板，經過優化后，適合哺乳動物表達 的基因序列由人工合成(廣州復能基因有限公司)，命名為H5M2。同時還構建了 H5N1流感病毒M2的耐藥突變體(S31N-L26I雙突變)表達質粒，該質粒命 名為H5M2 ( S31N-L26I) 。 二者通過fimwHI和Wal酶切克隆于pcDNA4/TO 質粒，該質粒在T-REx293細胞中需在四環素的誘導下才能表達目的基因。野生 型H5M2基因序列為CGG GAT CCAT gtc cct get gac aga ggt gga gac ccc cac cag gaa tga gtg gga gtg cag gtg etc tga etc etc tga CCC CCT GGT GGT GGC TGC CTC CAT C att ggc ate ctg cat ctg ate ctg tgg att ctg gac agg ctg ttc ttc aag tgc ate tac agg agg ctg aag tat ggc ctg aag agg ggc cct gcc aca get ggc gtg cct gag tec atg agg gag gag tac agg cag gag cag cag tct get gtg gat gtg gat gat ggc cac ttt gtg aac att gag ctg gag taa ate tag age,其跨膜區(aa25至aa42)序列CCC CTG GTG GTG GCT GCC TCC ATC ATT GGC ATC CTG CAT CTG ATC CTG TGG ATT經點突變后為耐藥型H5M2 ( S31N-L26I)的跨膜區基因序列CCC ATT GTG合成的引物序列為上游引物5-cgggatccatgtccctgctga-3下游引4勿5-cggaattcttactccagctcaatgttca-3 2.EGFP基因的獲得為了建立EGFP與H5M2共表達的穩定細胞，本研究以質粒p-EGFP-Cl為模 板，通過PCR擴增EGFP基因，通過Bg/II和五coRl酶切后連接到pQCXIP載 體上。由于pQCXIP帶有嘌呤霉素抗性基因，便于篩選EGFP表達的細胞克隆。 EGFP序列為atg gtg age aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc ate ctg gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc age gtg tec ggc gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc ate tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc etc gtg acc acc ctg acc tac ggc gtg cag tgc ttc age cgc tac ccc gac cac atg aag cag cac gac ttc ttc aag tec gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag cgc acc ate ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc ate gag ctg aag ggc ate gac ttc aag gag gac ggc aac ate ctg ggg cacaag ctg gag tac aac tac aac age cac aac gtc tat ate atg gec gac aag cag aag aac ggc ate aag gtg aac ttc aag ate cgc cac aac ate gag gac ggc age gtg cag etc gec gac cac tac cag C3g aac acc ccc ate ggc gac ggc ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg age acc cag tec gec ctg age aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc gtg acc gec gec ggg ate act etc ggc atg gac gag ctg tac aag taaEGFP的PCR擴增？ 1物序列為上游引物ggaagatctatggtgagcaagggcgaggag下游引物cggaattctacggatcccttgtacagctcgtccatgc (由invitrogen公司合成)。 與野生型GFP相比，EGFP的64位笨丙氨酸突變為亮氨酸，65位絲氨酸突 變為蘇氨酸，前者增強GFP的熒光強度，后者使得GFP蛋白對pH敏感。3.建立共表達穩定細胞抹按以下操作步驟建立誘導型A型流感病毒M2離子通道的穩定細胞林 1 )取狀態良好的T-REx 293細胞2><105個/孔鋪于6孔板中，加2ml完全 培養基(DMEM， 10%FBS，青霉素lOOunits/ml,鏈霉素100ug/ml)，置于37 。C 恒溫培養箱中，5%C02培養24h。2)轉染前lh吸去細胞上清，沿壁緩緩加入不舍青鏈審素的DMEM培養基 (舍10。/。FBS)。3 )質粒pcDNA4/T0 -H5M2 (wild )， pcDNA4/T0 -H5M2 ( S3 IN -L26I)各 取2嗎，分別與6^1的脂質體(lipofectamin)加入lOOpl的DMEM (Dulbecco's modified eagle medium)中混勻，靜置20分鐘。4) 轉染混合液輕輕滴入上述6孔板細胞培養孔中。5) 4-6h后換液，每孔用2ml完全培養基代替轉染混合液。6) 24h后細胞按1:18傳入10cm培養皿中，加入200ng/ml的zeocin (博來 霉素)壓穩定細胞株。7) 3天換液一次，并補加20(Hig/mL的zeocin,維持200ng/mL的zeocin培 養3周，待單克隆細胞長到肉眼可見(單個克隆約400-600個細胞)時，挑出單 細胞克隆至24孔板，放大培養后取樣做Western Blot鑒定。結果見圖1，圖1表明M2離子通道蛋白在細胞中表達時以四聚體、二聚體、單體形式存在。8 )鑒定得到的穩定細胞抹在2jLig/ml的四環素誘導下可以穩定表達突變型或 野生型M2,取每個穩定林lxl()S個細胞至24孔板的一個孔中，置于37 。C恒溫 培養箱中，5。/。C02培養24h。9 ) 24h后轉染編碼EGFP的質粒pQCXIP-EGFP,轉染lh前培養基換成不 含青鏈霉素的DMEM,但含10%FBS。10 )取2pg的pQCXIP-EGFP質粒DNA與6pl lipofectin-2000分別加入50pl 無血清無抗生素的DMEM培養基中中，靜置3min后將二者混勻，靜置20分鐘。11) 轉染混合液輕輕滴入6孔板中。12) 4-6h后吸去上清，沿壁加入50(Hil完全培養基，36h后細胞按l: 18傳 入10cm培養亞，加入終濃度為1)ig/ml的嘌呤霉素。13) 3天換液一次，并補加嘌呤霉素，維持嘌呤霉素抗性2周。待單細胞克 隆長至400-600個細胞，在熒光顯微鏡下鑒定EGFP的表達情況，挑取焚光比較 強的細胞克隆放大培養。4.穩定細胞抹的鑒定綠色熒光蛋白的鑒定直接在熒光顯微鏡下進行，M2離子通道的鑒定按以下 步驟進行1 )將上述T-REx 293穩定林細胞按2xl05個/孔接入6孔板中，加入2pg/ml 的四環素誘導表達24h后收取細胞，細胞置于37 。C恒溫培養箱中，5%0)2培養 24h。2)細胞收至1.5mlEP管中，PBS(0.01M, pH7.2)洗細胞一次，離心去上清。 3 )用lx上樣緩沖液60^1重懸細胞，水浴煮沸10分鐘。 4)各取樣lOpl進行SDS PAGE電泳(恒壓80V) 2h，半干轉膜lh (恒流 60mA )。5 )蛋白條帶轉至PVDF上，用10ml的5%脫脂乳(PBST中溶解)封閉1 小時，100mL的PBST洗膜三次后加入自制抗M2多抗(血清用PBST按1: 800 稀釋)，孵育lh, 10mL的PBST洗膜三次，每次5min,加入HRP標記的羊抗鼠IgG 二抗(1: 2000)孵育lh, lOmL的PBST洗膜三次。6)加入等體積混合的化學發光A，B顯色液，反應lmin后暗室中用富士/> 司的醫用X光膠片曝光。結果見圖1.5. GFP的表達及其對pH的敏感性1) 取2xl04個/孔T-REx 293穩定抹細胞至96孔板中，每孔加入100^1的完 全培養基，置于37 。C恒溫培養箱中，5。/。C02培養24h。另增加一個轉染pQCXIP 空質粒的T-REx 293作為陰性對照。2) 24h后，吸去96孔板中細胞培養基3 )用含10jimol/L透膜劑nigericin的PBS緩沖液處理細〗包10min4)棄透膜PBS緩沖液，加入不同pH值的緩沖液(含20mmol/L MES的PBS緩沖液)，呈梯度，分別為pH7.28， pH6.3, pH5.91， pH 5.52， pH 5.2, pH 4.89,pH4.58,每個濃度3個復孔，靜置5min。5 )在熒光顯孩i鏡下鏡檢GFP表達及其對pH的反應。結果見圖2，圖2表明細胞內的EGFP的焚光強度與pH相關。6. EGFP熒光強度與pH的關系1) 取2xl(^個EGFP穩定細胞接種10cm培養皿中(野生型和突變型)，加 lOml完全培養基置二氧化碳培養箱中37°C， 5。/。C02恒溫培養24h。無炎光表達 細胞作為陰性對照。2) 24h后收集細胞，不用胰酶消化，棄上清，用lml的PBS緩沖液將細胞 輕輕吹下，收集至1.5ml的EP管中。3) lOOOrcf離心lmin,棄上清，將細胞分成四份，調整細胞濃度為lx106、 0.5xl06、 0.25xl06、 0.125xl06、 0.0625x106 cell/ml，加入透膜劑nigericin (尼日 利亞菌素)(終濃度lO^mol/L),混勻，靜置5min。4) 將不同濃度的細胞分別取5(Vl/孔加入到黑色96孔板中，檢測初始熒光 值，設立無熒光細胞陰性對照孔(初始測得焚光值與陰性對照熒光值)。5) 加入等體積不同pH值的40mM MES (2-(N- morpholino)改hanesulfonic acid)緩沖液，每個pH值設置3個復孔，lOmin后再次;險測熒光值(第二次測得熒光值和陰性對照熒光值)。
熒光強度計算即GFP熒光值的相對比值'
_ ^ 第二次測得熒光值-陰性對照熒光值 熒光強度=-
初始測得熒光值-陰性對照熒光值
在后續的實驗中均以此公式計算熒光強度，并以熒光強度作圖。 儀器UVstar-Microplates Synergy HT,激發波長485nm,發射波長525nm. 通過軟件GraphPad分析得到熒光強度與pH值之間的關系曲線。結果見圖3， 圖3表明在pH5至pH6.5之間EGFP的熒光強度與pH呈線性相關。
7. M2表達細胞中EGFP熒光強度與pH之間的曲線關系
1) 取2xl(^個細胞接入10cm培養皿中(野生型和突變型)，四環素2pg/ml 誘導24h,力。10ml完全培養基置二氧化碳培養箱中37°C， 5%C02恒溫培養。
2) 24h后收集細胞，不用胰酶消化，棄上清，用lml的PBS緩沖液將細胞 輕輕吹下，收集至1.5ml的EP管中
3 ) 3000rpm離心lmin，棄上清，用PBS緩沖液調整細胞濃度至2xl05 (含 0.5%BSA),
4 )取50^1/孔加入到黑色96孔板中，檢測初始熒光值。
5)隨后加入等體積的pH在2.3-8.07區間內的40mMMES緩沖液，每個 pH值設置3個復孔，動力檢測IO分鐘內熒光值變化曲線。結果見圖4，圖4表 明M2離子通道表達細胞中熒光強度下降速度比無M2離子通道細胞快。
8. M2離子通iU^達水平與細胞內GFP熒光強度的關系
1) 取2xl(^個細胞接入100mm培養皿(野生型和突變型)，四環素2嗎/ml 分別誘導Oh, 6h, 12h, 18h， 24h，加2ml完全培養基置二氧化碳培養箱中37。C, 5%C02恒溫培養。
2) 24h后收集細胞，不用胰酶消化，吸取上清，用lml的PBS緩沖液將細 胞輕輕吹下，收集至1.5ml的EP管中。3 ) 3000rpm離心lmin，棄上清，用PBS緩沖液調整細胞濃度至2xl05 (含 0.5%BSA )。
4)取50pl/孔加入到黑色96孔板中，檢測初始熒光值。
5 )隨后加入等體積的pH值為4.57的40mMMES緩沖液(PBS緩沖液2 倍稀釋后pH值為5.49 )，每個pH值設置3個復孔，動力檢測10分鐘內熒光值 變化。
6 )M2表達水平由Western blot鑒定。結果見圖5,圖5-1為M2離子通道 的表達水平western blot結果；圖5 - 2為pH5.49時熒光強度下降曲線；由此說 明在M2離子通道表達細胞中，EGFP熒光強度的下降速度與M2離子通道的數 量相關，也就是說，不同程度的阻斷M2離子通道可以通過萸光強度反映出來。
9. 細胞內源性酸敏感離子通道ASICs對M2離子通道活性檢測的影響
在本研究中利用阿米洛利來抑制細胞內源性酸敏感離子通道ASICs。 1 )取2"06個細胞接種100mm培養皿(野生型和突變型)，分別由l昭/ml
四環素誘導或不誘導，加10ml完全培養基置二氧化碳培養箱中37°C, 5%C02
恒溫培養。
2) 24h后收集細胞，不用胰酶消化，吸取上清，用lml的PBS緩沖液將細 胞輕輕吹下，調整細胞濃度為2xl05/ml，分成2份， 一份用40pmol/L的阿米洛 利處理5min。
3) 取5(Vl/孔加入到黑色96孔板中，檢測初始熒光值。
4)隨后加入等體積的pH值為4.57的40mMMES緩沖液(PBS緩沖液2倍稀釋 后pH值為5.49),每個pH值設置3個復孔，動力檢測IO分鐘內熒光值變化。
結果見圖6,圖6表明內源性酸敏感離子通iM"M2離子通道的活性沒有明 顯的影響。
10. 金剛烷胺與金剛乙胺阻斷M2離子通道的研究
1)分別取lxl()6個T-REx293穩定抹細胞接入2個10cm培養皿中(野生型 和突變型)，四環素lpg/ml誘導24h,另外分別取相同穩定林細胞至2個10cm 培養皿中(野生型和突變型)，不誘導，作為對照。加10ml完全培養基置二氧化碳培養箱中37。C, 5%C02恒溫培養。
2) 24h后收集細胞，不用胰酶消化，棄上清，用lml的PBS緩沖液將細胞 輕輕吹下，收集至1.5ml的EP管中。
3) 3000rpm離心lmin，棄上清，轉移至千凈的培養皿中，用PBS緩沖液 調整細胞濃度至4xl05 (含0.5%BSA )。
4 )取細胞30pl/孔加入黑色96孔板中。
5)稀釋化合物金剛烷胺或金剛乙胺，起始濃度為0.5mmol/L, 5倍倍比稀 釋，稀釋至6xlO"mmol/L。
6 )在加入細胞的孔中每孔加入30^1不同濃度的金剛烷胺或金剛乙胺，作用 5min，檢測熒光值。設置未誘導M2表達的細胞作為對照。 7)而后迅速加入60h1含40mM MES的PBS緩沖液(pH4.57 )，檢測熒光值， 間隔90s,動力法;險測10min (溶液的最終pH為5.49 )。
8 )通過軟件Graph Prism分析數椐。結果見圖7,圖7表明，野生型M2離 子通道能被金剛烷胺阻斷，利用本方法測得IC50值為1.28 ± 0,38 ja mol/L。而且 在酸性緩沖液處理后的5分鐘內測得的結果相近，給實驗實施提供了足夠時間。 11.建立M2阻斷劑篩選方法
1) 取狀態良好的GFP-M2 T-REx293穩定抹細胞2乂106個接入10cm培養皿 中(野生型和突變型)，四環素2ng/ml誘導培養24h;另外分別擬目同穩定抹細胞 至2個10cm培養皿中(野生型和突變型)，不誘導，作為對照。力。10ml完全培 養基置二氧化碳培養箱中37。C, 5。/。C02恒溫培養。
2) 24h后收集細胞，不用胰酶消化，吸取上清，用lml的PBS (O.OIM， pH7.4)緩沖液將細胞輕輕吹下，收集至1.5ml的EP管中。
3) 室溫下3000rpm離心lmin，棄上清，轉移至干凈的培養皿中，并加PBS 稀釋至6ml。
4) 加PBS重懸細胞，調整細胞濃度至2xl05 (含0.5%BSA),取30^1/孔加 入黑色96孔板中，
5) 稀釋化合物:金剛烷胺作為陽性對照，與化合物同樣稀釋。起始濃度為0. 5.M, 5倍倍比稀釋，稀釋至6.4xl(T6mM。 96孔板中設置以下孔，誘導表達 的細胞，未誘導的細胞，不表達GFP的T-REx293細胞作為陰性對照。
6) 向每孔細胞中加入30ji1不同濃度的化合物，作用5min后，；險測初始萸 光值。
7) 實驗設置未誘導的細胞作為對照
8 )而后迅速加入60jlU含40mM MES的PBS緩沖液，檢測熒光值，間隔90s， 動力法4企測10min。
9 )通過軟件GraphPAD Prism分析數據。
12.金剛烷胺不能抑制耐藥型M2離子通道和B型流感病毒的M2離子通道，因 而在耐藥M2離子通道與GFP共表達的細胞中，金剛烷胺不影響GFP熒光值的 下降，結果見圖8。進一步證實該模型的可靠性和準確性。此;f莫型為篩選耐藥型 M2離子通道和B型流感病毒的M2離子通道的阻斷劑提供可靠方法。
實施例二、熒光指示劑標記M2表達細自型
1. 取狀態良好的M2 T-REx293穩定林細胞2xl06個接入10cm培養皿中(野生型 和突變型)，四環素2pg/ml誘導培養24h;另外分別取相同穩定林細胞至2個10cm 培養m中(野生型和突變型)，不誘導，作為對照。力。10ml完全培養基置二氧化 碳培養箱中37°C， 5%C02恒溫培養。
2. 24h后收集細胞，不用胰酶消化，去上清，用lml的PBS (O.OIM， pH7.4) 緩沖液將細胞輕輕吹下，收集至1.5ml的EP管中。pH7.4的PBS洗細胞三次。
3. 用lml Hanks緩沖液重懸細胞，加入雙羧乙基碳氧熒光素四乙酰氧曱酯 (BCECF-AM,終濃度5|iimol/L)標記15min BCECF-AM在細胞內經酯酶裂
解生產能發熒光的BCECF。
4. 用PBS (pH7.4)洗滌細胞3次，并用PBS (pH7.4)重懸細胞，濃度2xl0八5 cell/ml.
5. 化合物篩選
在96孔黑色板，每孔50pl細胞(lxl04cell/wdl)與50ul含化合物(不同濃度)的PBS混勻，靜置15min。每孔中加入50 pi PBS (150mM MES, pH5.06)并 混勻，(最終MES濃度:50mM, pH5.4),立即測定萸光值(動力學測定或lmin 后終點測定)。儀器UVstar-Microplates Synergy HT，激發波長485nm，發射波 長525nm. 6. 數據分析
圖9為在酸性條件下，BCECF熒光強度在M2表達細胞和無M2細胞中的 比較。由圖9可見，酸性緩沖液中BCECF熒光強度的下降速度在M2表達細胞 中比無M2細胞快。
圖10金剛烷胺抑制野生型M2離子通道與BCECF熒光強度的劑量反應曲 線。圖10中顯示酸性條件處理后O， 1， 2, 3， 4， 5分鐘時間點測得的BCECF 熒光強度與金剛烷胺濃度的相關性，表明BCECF可用于M2離子通道阻斷劑的 篩選。
最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本 發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的 普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而 不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
權利要求
1. 一種用于流感病毒M2離子通道阻斷劑篩選的熒光細胞模型，其特征在于，該細胞模型是含pH敏感的熒光物質的細胞。
2、 根據權利要求1所述的細胞模型，其特征在于，所述的熒光物質為熒光 指示劑或熒光蛋白。
3、 根據權利要求2所述的細胞模型，其特征在于，所述的熒光指示劑包括 熒光探針SNARF、熒光探針SNARF-AM、 8-羥基-l,3，6-三磺酸芘、熒光素 Fluoresceins,羧基焚光素carboxyfluoresceins、 1， 2, 7-雙-(歡乙基)-羧基-焚光素 或雙羧乙基碳氧熒光素四乙酰氧曱酯。
4、 根據權利要求2所述的細胞模型，其特征在于，所述的熒光蛋白包括綠 色熒光蛋白、增強型黃色熒光蛋白或熒光蛋白pHluorin。
5、 根據權利要求4所述的細胞模型，其特征在于，所述的綠色熒光蛋白包 括含有S65T突變的綠色熒光蛋白突變體。
6、 根據權利要求5所述的細胞模型，其特征在于，所述的含有S65T突變 的綠色熒光蛋白包括S65T綠色熒光蛋白突變體、增強型綠色熒光蛋白、 F64L/S65T/T203Y/L231H綠色焚光蛋白突變體或C48S/S65T/H148C/T203C綠 色熒光蛋白突變體。
7、 權利要求1 - 6之一所述的細胞模型在流感病毒M2離子通道阻斷劑篩選 中的應用方法，其特征在于，測定在酸性條件下所述細胞;漠型中焚光值的變化。
8、 根據權利要求7所述的應用方法，其特征在于，所述的酸性條件為pH值低于6.2的條件。
全文摘要
本發明提供了一種用于流感病毒M2離子通道阻斷劑篩選的熒光細胞模型，該細胞模型是含pH敏感的熒光物質的細胞。同時，本發明還提供了利用該細胞模型篩選流感病毒M2離子通道阻斷劑的方法。該方法是測定在酸性緩沖液條件下細胞模型中熒光值的變化。本發明優點在于，通過測定熒光值反映細胞內pH的變化，直接反映通過M2離子通道的H+流動情況，利用本發明的細胞模型建立的M2離子通道阻斷劑篩選方法藥物作用機制明確，方法簡便、快速、直接，適合M2離子通道阻斷劑的高通量準確篩選。
文檔編號G01N33/15GK101519648SQ20091003642
公開日2009年9月2日 申請日期2009年1月5日 優先權日2009年1月5日
發明者偉 徐, 李楚芳, 楊令芝, 肖益平, 凌 陳 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院