專利名稱：一種抗植物青枯病基因及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物抗病領域，具體涉及一種抗植物青枯病基因及其制備方法和應用。
背景技術：
茄子作為中國栽培的主要蔬菜之一，2006年全國播種面積70. 27萬hm2，總產量 2247萬t。但是在茄子的生產過程中常由于病害的發生給廣大的菜農造成嚴重經濟損失， 危害茄子的主要病害有黃萎病、青枯病、綿疫病、褐紋病等，例如茄子青枯病的發生一般會 減產20 30%，嚴重時損失達50 60%，已成為影響茄子高產的主要因素。而且這種病 很難根除，采取化學防治為主的綜合防治措施也只能收到40 50%的防治效果，用輪作可 起到一定的防治作用，但實施比較困難。要防治這些病害的經濟，有效的主要對策就是選育 抗病茄子品種，既能提高茄子產量，又能減少農藥的使用，防止環境污染，而想選育出抗病 性強的品種必須有比較理想的育種材料。目前各國開展茄子育種的所用資源遺傳基礎比較 狹窄，是制約茄子抗病育種取得突破性進展的主要因素，野生的茄子材料由于存在生殖隔 離的問題，也難以將有利的抗病基因轉移到栽培種中。因此要選育優良抗病品種，必須不斷 地發掘和創新抗病材料，才是解決問題的根本途徑。隨著植物基因工程的深入研究，分離植 物抗病基因已成為現實，將抗病基因導入到受體植物后既可增強植物的抗病性又能保持優 良的經濟性狀，從而為開展植物抗病育種成找到一條新的途徑。目前有關茄子抗青枯病基因工程研究比較落后，大多數主要集中在與抗青枯病性 狀相連鎖的分子標記篩選研究，還沒有茄子抗青枯病基因分離的研究報道。
發明內容
本發明的目的在于根據現有植物育種中存在的遺傳基礎狹窄、青枯病侵害問題嚴 重且農藥的使用會對環境造成污染的問題，提供一種具有抗青枯病功能的基因。本發明另一目的在于提供上述抗植物青枯病基因的制備方法。本發明還有一個目的在于提供上述抗植物青枯病基因的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現一種抗植物青枯病基因，其DNA序列如SEQ ID NO :1所示，該基因編碼的蛋白如 SEQ ID NO 2 所示。本發明抗植物青枯病基因是從半野生茄子E-31中擴增得到的。本發明抗植物青枯病基因的制備方法是通過cDNA-AFLP差異顯示法及RACE法從 抗青枯病的半野生茄子E-31中克隆得到的，步驟如下(1)對E-31、E-32、Fl和F2茄子植株進行人工抗青枯病鑒定，得到抗病植株和感 病植株；(2)分別提取上述抗病植株和感病植株的總RNA，合成cDNA ；(3)利用cDNA-AFLP差異顯示法進行篩選，用序列如SEQ ID NO :3 4所述引物
3擴增出與抗病基因連鎖的抗病基因片段，序列如SEQ ID N0:5所示；(4)利用RACE法擴增抗青枯病基因片段的全長序列根據步驟(3)所得抗病基因 片段設計引物，擴增5’端序列，如SEQ ID NO :6所示；所述引物序列如SEQ ID N0:7 8所 示；(5)根據步驟(3)所得抗病基因片段設計引物，擴增3’端序列，如SEQID NO 9所 示；所述引物序列如SEQ ID NO 10 11所示；(6)根據擴增出的5’端序列和3’端序列進行連接，得到抗青枯病基因的全長序 列。本發明從半野生茄子E-31分離到一個茄子抗青枯病基因，通過轉基因把該基因 導入到表現優良的感病品種中，可以提高茄子的抗病性，從而可以快速培育出新的茄子抗 病品種。具體方法如下將抗植物青枯病基因序列構建到克隆載體上，利用限制性內切酶進 行雙酶切，獲得目的基因片段，利用內切酶雙酶切植物正義表達載體，把酶切獲得的基因片 段和正義表達載體通過連接酶進行連接，將構建好的植物表達載體轉化到農桿菌中，利用 農桿菌導入法進行轉化，通過篩選，得到具有抗青枯病能力的轉基因植株。其中，所述克隆 載體優選為PMD19-T;所述限制性內切酶優選為sma I和sac I。本發明抗青枯病基因還可用于其它抗青枯病資源比較缺乏的植物，如番茄的基因 工程育種。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明從半野生茄子E-31中分離出抗青枯病基因，將該基因倒入到受體植物后 既可增強植物的抗病性又能保持優良的經濟性狀，改良了植物品種；通過本發明將基因導 入植物中以提高植物的抗青枯病能力，既能提高植物的產量，還可以減少農藥的使用，防止 環境污染，適合在農業生產中進行推廣。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。實施例1抗病基因的制備1.對所用的材料(E-31，E_32及其F1、F2代植株)用灌根法進行人工抗青枯病抗 性鑒定，確定抗病材料與感病材料。2.抗病材料E-31，感病材料E-32及它們F1、F2代抗病植株，感病植株的總RNA分 離提取，采用Trizol法。3. cDNA 的合成雙鏈cDNA 合成方案參照 CL0NTECH 公司 SMART cDNA Library constructionkit Manual。 其中 Powerscript Reverse Transcriptase 購于 Invitrogen 公司，而 50 X advantage 2 polymerase Mix 購置于 CL0NTECH 公司。cDNA Synthesis (CDS)、SMART Π 引物及5' -PCR primer由上海生工合成，SMARTn序列如SEQ ID NO 12所示，CDS序列如 SEQ ID NO 13 所示，PCR Primer 序列如 SEQ ID NO 14 所示。第一鏈cDNA的合成(1)在一無菌的0. 5mL的微量離心管中加入下列試劑
應產物
RNA (0. 025 0. 5 μ g 的 poly A+RNA 或 0. 05 1 μ g 的 total RNA) 1 3 μ g cDNA Synthesis(CDS)Primer(IOyM)1 μ L
SMART Π Oligonucleotide(10 μ Μ)1 μ L
加入DEPC處理水至總體積為5yL
(2)混合樣品，短暫離心；
(3)70°C保溫2min ；
(4)短暫離心收集樣品于管底，保持試管于室溫；
(5)加入下列試劑于反應管中 5X First-Strand Buffer DTT(20mM) dNTP Mix(IOmM)
Powerscript Reverse Transcriptase
2μ L 1 μ L
1 μ L 1 μ L.
總體積為IOyL
(6)輕輕地渦旋且短暫離心試管；
(7)42°C溫浴lh。如用PCR儀保溫，樣品上要加一滴礦物油；
⑶通過補充適合體積的TE緩沖液(IOmM Tris [pH7. 6]，ImM EDTA)稀釋第一鏈反
若用總RNA作為開始材料，補充40 μ L的TE緩沖液； 若用多于0. 2 μ g poly A+RNA作為開始材料，補充450 μ L TE緩沖液； 若用少于0. 2 μ g poly A+RNA作為開始材料，補90 μ L TE緩沖液；
(9)加熱試管72°C，7min;
(10)如不進行第二鏈的反應，第一鏈的cDNA存于-20°C可保存3個月
4. cDNA的LD-PCR擴增每個樣品準備3個管。
(1)預熱PCR儀到95°C；
(2)加入下列試劑于反應管中 IOXadvantage 2PCR buffer 5' -PCR primer(10 μ Μ) dNTP Mix(IOmM)
50 X advantage 2polymerase Mix 第一鏈cDNA
ddH20
5 μ L 2μ L 1 μ L 1 μ L 8μ L
33 μ L
總體積為50 μ L
(3)混合樣品，短暫離心收集樣品于管底；
(4)加兩滴礦物油于反應液上，將反應管置于預熱好的PCR儀上
(5)PCR反應程序如下
95 0C預變性Imin ；
95 "C15s65 °C15s68 °C6min循環次數全部先進行15個循環，加入1 μ L 0. 5Μ EDTA到各自的反應中，終止反 應，4°C保存；
5. cDNA酶切和連接酶切取合成好的cDNA酶切進行，先用Taq I進行酶切，酶切溫度為65°C，時間 3h。酶切體系為cDNA (約 IOOng)8μ L Taq I(IOU) 1 μ L 10XNEB buffer 3 2μ L10XBSA 0. 2μ LddH90 9μ L總體積為 20μ l
Ase I酶切在上述酶切體系中加入下列成分
Taq I酶切體系20 μ LAse I(IOU)1 μ LIOXAse I buffer 31 μ LddH208 μ L_總體積為30 μ L溫度為37°C，時間3h。雙酶切結束后，取8 μ L體積的酶切產物進行1. 2%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測。Taq I和Ase I接頭的配制取25 μ g T1和22 μ g T2混合后水定容到100 μ L，此 為5pM Taq I的接頭。另取2. 6 μ g A1和2 μ g A2混合后水定容到100 μ L，此為終濃度為 5pM Ase I的接頭。
連接16°c恒溫槽下進行，連接過夜。取5 μ L于1. 0%電泳，檢測連接結果t雙酶切后的產物22 μ LTaq I 接頭IyLAse I 接頭IyLT4Ligation buffer3 μ LT4DNA連接酶1 μ L補充ddH20總體積為30 μ L連接后產物稀釋20倍最適宜用于模板的預擴增。 6.模板的預擴增和選擇性擴增預擴增反應體系稀釋的連接產物5 μ L，引物T3(K)Ong/ μ μ L，引物A3(K)Ong/μ L) IyL, IOX PCR Buffer (含 Mg2+ (25mM)) 2· 5 μ L，Mg2+25ml) 1 μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L, Taq酶(5U) 0. 4 μ L，補充ddH20至總體積為25 μ L。PCR反應條件為94°C預變性Imin ;94°C 30s，退火溫度分別對56 °C 30s, 72 °C lmin,30個的循環次數，PCR產物取10μ L，在1. 5%瓊脂糖膠上電泳比較。PCR產物稀釋到 約Ing/ μ L (稀釋20倍)，用于選擇性擴增。選擇性擴增體系13.8yL ddH20,2. 5μ L PCR buffer(含 Mg2+(25mM))， Mg2+(25mM) 1· 0 μ L，0· 5 μ L dNTP，1 μ L 弓丨物 T，1 μ L 弓丨物 A，5 μ L 預擴稀釋產物，0· 2 μ L Tag 聚合酶，總體積25 μ L0 94°C, 5min ；94°C，30s，65°C，30s，72°C，Imin，以后每輪擴增溫度遞 減 0. 7°C，擴增 12 個循環后；940C，30s, 56°C，30s, 72°C，Imin,共 28 個循環；72°C延伸 7min。cDNA-AFLP的引物和接頭由上海生工生物程技術服務有限公司合成，Taq I、Ase I接頭和選擴的引物見表1。表1引物和接頭序列表Table 1 Adaptor and primer sequence of Tag I and Ase I 7.變性選擴反應結束后，加入等體積的甲酰胺上樣緩沖液，95°C變性5min后迅速放置冰 上2min，-2(TC貯藏備用。甲酰胺上樣緩沖液的配制二甲苯青lmg，溴酚藍lmg，0. 5M EDTA溶于去離子甲酰胺。8.測序膠電泳(1)洗板用洗衣粉洗凈有機玻璃板和玻璃板的雙面，再用ddH20沖洗干凈，注意玻 璃板不要有劃痕；(2)涂板洗凈的玻璃板及有機玻璃板，晾干后用Eppendorf槍均勻的在板的上部 點灑ImL無水乙醇擦拭，注意擦拭朝同一方向進行，不要在板上來回劃，重復擦3次，晾干； 玻璃板用ImL稀釋的親和硅烷(100 μ L親和硅烷+900 μ L ddH20)均勻涂抹；有機玻璃板用 ImL的剝離硅烷均勻涂抹一遍。5min后各用無水乙醇均勻涂抹3次；(3)制板晾干后，將兩塊板組裝，梳子斜向倒插，兩邊用夾緊，注意受力均勻；(4)凝膠配制尿素 21g，10XTBE 2. 5mL，40 % Arc :Bis 貯液 7. 5mL，重蒸水 26mL， 400 μ L 10%的過硫酸氨(Ammonium persulfate)，用磁力攪拌機攪拌溶解，加水定容至 50mL。灌膠前加入40 μ L TEMED ；10ΧΤΒΕ :108g Tris+55g 硼酸+3. 72gEDTA，定容 IL ；40%測序膠貯存液(40% Arc :Bis) :38g丙烯酰胺+2g N-甲叉雙丙烯酰胺溶于 60mL水中，37°C助溶，定容至IOOmL;10%過硫酸氨，4°C可貯數周；(5)灌膠將固定好的板一方傾斜放置，將凝膠通過注射器從下至上快速注入，注意 排除氣泡，保證膠面通過毛細作用左右方呈直線水平前進，當膠填滿底部后，將斜向倒插的 梳子小心插入兩夾板間，凝固3h以上；(6)電泳待膠凝固好后，拔出注射器，將膠板組裝好，清洗板表面和上部點樣孔附 近的膠，將梳子齒向下插入，稍微接觸膠面，形成點樣孔。首先在IXTBE中，50W預電泳 30min,使電泳槽溫度達到45°C。取8 μ L變性的選擴PCR產物上樣。45°C，50W恒功率電泳 90min，至二甲苯青指示帶距底部約IOcm處。9.銀染方法銀染液按照下列配方配制固定/終止液(900mL ddH20+5mL冰醋酸+IOOmL無水 乙醇)；染色液(2g AgNO3+固定液)；顯色液(20g NaOH+IOOOmL ddH20+5mL甲醛)；(1)固定在托盤A中加入固定/終止液，將在膠的短板放入托盤，輕搖20min或直 到指示劑顏色消失為止。也可在溶液中浸泡過夜(不搖動)。將溶液回收留用，清洗托盤；(2)洗膠在托盤B中用ddH20漂洗凝膠3次，每次2min，在將玻璃板取出時，讓玻 板豎直滴干10 20s ；(3)染色在長盤A中加入IL染色液，將有膠的玻板放入托盤，輕搖30min ；(4)顯色準備完全配制好顯色液，將IL預冷的顯色液置于托盤B中剩下產溶液仍 置于冰上，將膠從染色液中拿出放在一邊；(5)洗膠將膠浸入裝有ddH20的托盤中，拿出滴干水，立即將膠置于預冷的顯色液 中。注意，從將膠置于水中到將其放入顯色液中，時間不超過5 10s。如洗膠時間過長，重 復染色過程；(6)顯色輕搖顯色液，至膠上條帶出現(或第一條條帶出現)后，將膠移入剩余的 IL預冷顯色液繼續顯色2 3min或直到所有條帶都出現；(7)固定將IL固定液加入到顯色液中，終止顯色反應；
8
(8)洗滌用ddH20洗凝膠兩次，每次2min ；(9)干膠室溫下自然晾干。10.差異片斷的回收和二次PCR擴增(1)差異條帶的回收先用少量ddH20浸潤差異表達的條帶，然后用手術刀在酒精燈 上滅菌后沿條帶邊緣小心切下條帶，溶解在50 μ L ddH20中，4°C冰箱浸泡過夜，100°C煮沸 15min，其間用槍頭或牙簽小心搗碎凝膠，12000rpm室溫離心lOmin，取上清液可以用作二 次PCR反應的模板。(2)差異片段擴增的PCR反應體系及反應條件利用與回收條帶相匹配的引物進 行 二 次 PCR, 25uL 擴增體系中含有10 X PCR buffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L, Mg2+ (25mM) 1 μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L，引物 A (50ng/ μ L) 1 μ L，引物 T (50ng/ μ L) 1 μ L, Taq 酶(5U) O. 2 μ L，回 收模板 5 μ L，力口 ddH20 M 25 μ L0 PCR 條件為94°C變性 2min ；94°C變性 30s, 56°C退火 30s， 72°C延伸lmin，30個循環；72°C延伸IOmin終止反應。(3)差異片段PCR擴增產物的純化差異條帶PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測 后，若只有一條亮帶，則該產物可直接用于后續的連接反應，若有兩條或更多的條帶則需經 辨別后，從膠上回收目的條帶(用于回收PCR反應體系增加到50 μ L)11.目的片段的測序經過差異篩選后，發現Τ3/Α8的引物組合得到與抗病材料緊密連鎖的片段，經過 測序后得到序列如SEQ ID NO 5所示。12.利用RACE擴增出該基因片段的全長序列(1)所有錨定引物均由上海生工合成，用于3’和5’ RACE第一鏈cDNA合成的引物 序列如下3' -CDS(12yM)如 SEQ ID NO :13 所示，其中 N = A，C，G，or T ;V = A，G，or C5' -CDS (12 μ Μ) 5' -(T)25V Ν_3' (N = Α，C，G，or T ;V = Α，G，or C)，如 SEQ IDNO 37 所示；用于3’和5’ RACE PCR擴增的錨定引物序列如下IOXuniversal Primer A Mix(UPM)Long (0. 4 μ M)如 SEQ ID NO 38 所示；Short (2 μ Μ)如 SEQ ID NO 39 所示。Nested universal Primer A(NUP ； 10μΜ)女口 SEQ ID N0:40 所示。擴增5端序列所用的特異引物如SEQ ID NO :7 8所示；擴增3端序列所用的特異引物如SEQ ID NO 10 11所示。PCR反應的體系IyL cDNA 模板，2.5yL 10XPCR buffer(含 25mM Mg2+), Mg2+(25mM)0. 5 μ L，0. 5 μ L dNTP，1 μ L錨定引物，1 μ L 特異引物，0. 25 μ L Tag聚合酶(5U)， 加18. 25 μ L ddH20使總體積為25μ L。PCR反應程序:94°C預變性2min ；94°C 30s，退火溫度 600C 30s, 72°C延伸2min，30個循環，72°C再延伸7min。套式PCR的退火溫度提高到62°C。 PCR產物回收、連接和克隆等，送上海英駿生物技術有限公司測序。擴增3端的PCR反應為94°C預變性3min -MV 30s，退火溫度52°C 50s，72°C延 伸2. 5min, 30個循環，72°C再延伸IOmin0把擴增出來的片段克隆到pMD19-T載體上，進行測序。
得至IJ 5端序列如SEQ ID NO 6所示，得到3端序列如SEQ ID NO 9所示。13RE_bw全長序列的連接與擴增根據5端序列與3端序列的測序結果，進行連接得到全長序列如SEQ IDNO 1所 示；編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。提取抗病材料“E-31”的總RNA，而后合成cDNA。根據抗病基因序列SEQ ID NO :1設計引物P3和P4，序列如SEQ IDNO :41 42所示；以“E-31 ”的cDNA為模板，按照以下PCR反應體系進行2. 5 μ 1 10XPCR buffer(Takara, Bio USA)，0· 5 μ 1 IOmmol I-IdNTPs(Takara, BioUSA)，0· 5 μ 1(20 μ Μ)引 物(Ρ1+Ρ2)，0· 25 μ 1 5U/ μ L Taq 酶(Takara, Bio USA)，20 μ 1 ddH20 and 1 μ 1 (20_50ng) 的cDNA模板，放置在PCR儀上，按照程序94°C下預變性5分鐘，而后94°C 1分鐘，55°C 1 分鐘，72°C 2分鐘，循環35次，72°C放置10分鐘，在1. 2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，在成像 系統(Bio-Rad, sub-celImodel 192，USA)下分離出目的基因片段。利用PCR產物回收純化試劑盒(Takara，Bio USA)進行目的基因的回收，使用 Takara pMD-19 Ligation Kit進行即連接反應體系pMD19_T載體0. 5 μ L，回收純化產物 4. 5yL, Solution I 5 μ L，總體積為10 μ L，16°C反應12h。即可以把抗病基因連接到克隆 載體PMD19-T上。將含有目的基因的克隆載體可以通過熱激法轉化到大腸桿菌DH5 α中，在液體LB 培養基中培養后，添加15 %的甘油，可在-80V長期保存。實施例2將基因導入植物中的方法將含有目的基因的PMD19-T用sma I和sac I雙酶切，切下目的基因，而后同樣用 sma I和sac I雙酶切pBI121的⑶S基因，用T4連接酶把抗病基因與酶切后的pBI121進 行16°C連接12h，即可得到抗病基因的正義植物表達載體pBI121-RE-bw，用凍融法將構建 好的植物表達載體轉化到農桿菌EHA105或LBA4404，即可進行遺傳轉化。以感病茄子自交系“E-32”為轉化材料，介紹用農桿菌介導法具體的遺傳轉化方 法。具體的操作方法為培養茄子無菌幼苗，切下7d苗齡的上胚軸，浸泡于濃度為0D_0. 5 的農桿菌菌液中13分鐘，用濾紙吸干上胚軸外植體，而后在培養基MS+6-BA(2. Omg. U1)+IAA(0. lmg. L"1)+ZT(2. Omg. L-1)+ 蔗糖(30g. L-1)+ 瓊脂(6. 5g. L-1)，ρΗ5· 8上預培 養 2d，轉入篩選培養基[MS+6-BA (2. Omg. Γ1) +IAA (0. Img. Γ1) +ZT (2. Omg. Γ1) +Km (50mg. L-1) +Cb (500mg. L-1) + 蔗糖(30g. L-1) + 瓊脂(6. 5g. L-1)，ρΗ5· 8上進行篩選，25 天后， 有抗性芽分化出現，對獲得的抗性芽在培養基上[MS+6-BA (2. Omg. L-1) +IAA (0. Img. Ι^)+ΖΤ(2. Omg. L—1) + 蔗糖(30g. L—1) + 瓊脂(6. 5g. L-1)，ρΗ5· 8進行 2-3 代的快繁，可以得到 大量的不定芽。對獲得的抗性芽進行Southern雜交鑒定，有雜交信號的為轉基因抗性 芽，沒有雜交信號出現的為加陽性不定芽，對獲得的轉基因不定芽在生根培養基上 [1/2MS+NAA(0. lmg. L—1) +蔗糖(30g. L—1)+瓊脂(6. 5g. L-1)進行生根，即可得到轉基因植 株。實施例3所得到的轉基因植株的抗病性評價轉基因當代植株，定植于田間，發病率低于20%，發病植株的發病癥狀表現為1-2 級(即整個植株有1 3片枯萎)，而對照(為轉化植株)發病率超過80%，發病植株的癥狀表現為4-5級(即整個植株葉片枯萎，甚至死亡)；轉基因植株進行人工接種青枯病鑒 定，發病時間較對照植株推遲15天，而對照植株在接種7天后即表現感病癥狀。轉基因植 株病情指數為8. 74，群體抗性表現為抗，而對照植株病情指數為76. 68，群體抗性表現為高感。
權利要求
一種抗植物青枯病基因，其DNA序列如SEQ ID NO1所示，該基因編碼的蛋白如SEQ ID NO2所示。
2.根據權利要求1所述的抗植物青枯病基因，其特征在于所述基因是從半野生茄子 E-31中擴增得到的。
3.根據權利要求1所述的抗植物青枯病基因，其特征在于所述植物為茄子。
4.權利要求1或2或3所述的抗植物青枯病基因的制備方法，其特征在于通過 cDNA-AFLP差異顯示法及RACE法從抗青枯病的半野生茄子E-31中克隆得到的，步驟如下(1)對E-31、E-32、Fl和F2茄子植株進行人工抗青枯病鑒定，得到抗病植株和感病植株；(2)分別提取上述抗病植株和感病植株的總RNA，合成cDNA；(3)利用cDNA-AFLP差異顯示法進行篩選，用序列如SEQID NO :3 4所述引物擴增 出與抗病基因連鎖的抗病基因片段，序列如SEQ ID N0:5所示；(4)利用RACE法擴增抗青枯病基因片段的全長序列根據步驟(3)所得抗病基因片段 設計引物，擴增5，端序列，如SEQ ID NO 6所示；所述引物序列如SEQ ID NO :7 8所示；(5)根據步驟(3)所得抗病基因片段設計引物，擴增3’端序列，如SEQIDNO 9所示； 所述引物序列如SEQ ID NO 10 11所示；(6)根據擴增出的5’端序列和3’端序列進行連接，得到抗青枯病基因的全長序列。
5.權利要求1或2所述的抗植物青枯病基因在制備抗青枯病轉基因植株中的應用。
6.根據權利要求5所述的抗植物青枯病基因在制備抗青枯病轉基因茄子中的應用。
7.根據權利要求5所述的抗植物青枯病基因的應用，其特征在于將抗植物青枯病基因 序列構建到克隆載體上，利用限制性內切酶進行雙酶切，獲得目的基因片段，利用內切酶雙 酶切植物正義表達載體，把酶切獲得的基因片段和正義表達載體通過連接酶進行連接，將 構建好的植物表達載體轉化到農桿菌中，利用農桿菌導入法進行轉化，通過篩選，得到具有 抗青枯病能力的轉基因植株。
8.根據權利要求7所述的抗植物青枯病基因的應用，其特征在于所述克隆載體為 PMD19-T。
9.根據權利要求7所述的抗植物青枯病基因的應用，其特征在于所述限制性內切酶為 sma I 禾口 sac 10全文摘要
本發明公開了一種抗植物青枯病基因及其制備方法和應用。本發明抗植物青枯病基因是從半野生茄子E-31中得到的，其DNA序列如SEQ ID NO1所示，該基因編碼的蛋白如SEQ ID NO2所示。將本發明抗植物青枯病基因轉入植株中，通過篩選可得到具有抗青枯病能力的轉基因植株，增強了植株的抗病性，改良了植物品種，可廣泛應用到農業生產中。
文檔編號C07K14/415GK101880672SQ20101019150
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月28日 優先權日2010年5月28日
發明者曹必好, 曾國平, 柯劍, 王勇, 陳國菊, 陳清華, 雷建軍 申請人:華南農業大學