專利名稱：一種石斑魚mhc iib基因及其克隆方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種石斑魚MHC IIB基因及其克隆方法和 應用。
背景技術：
主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)是在脊椎動物
中普遍存在的一類編碼免疫球蛋白樣受體的高度多態的基因群，該基因群在免疫系統中 具有重要作用，是近年來免疫方向研究的熱點之一。MHC基因分為I型、II型和III型， II型基因又分為IIA和IIB。MHC II類基因編碼產物是MHC II類分子，它們與外源性抗 原肽結合并遞呈給T輔助細胞，引起下游的免疫應答。許多研究表明，MHCII基因的多 態性與個體的抗病能力密切相關。MHC II類分子是一個異源二聚體，由一條α多肽鏈和一條β多肽鏈組成。這 兩條鏈都由兩個核外區(α1/α2*β1/β2)、一個結合區、一個跨膜區和一個胞漿區組 成。α 1/β 1組成多肽結合區(Peptide Binding Region，PBR),具有高度多態性，其作用
是與抗原分解成的小肽結合，以將其遞呈給T細胞；α 2/β 2組成的區域不具有高度多態 性，是MHC分子與T細胞結合的重要結構域。MHC II類分子具有高度多態性，尤其是在其多肽結合區 (peptide-bindingregion, PBR),該區域直接與抗原裂解成的抗原肽產生作用，進而引起 下游的免疫級聯反應。MHC II的等位基因通常在PBR區域存在較高比例的非同義替換 (non-synonymous Substitution)。事實上，MHC在脊椎動物中是所有已知基因中表現出最 高多態性的一個基因，在人類的研究中發現僅一個基因座上就有超過500個等位基因。 MHC基因通過平衡選擇來保持其多態性，MHC基因在遺傳上具有連鎖不平衡(linkage disequilibrium)和單元型(Haplotype)遺傳兩個特點。MHC分子的高度多態性具有深遠的意義，它賦予種群適應多變的環境條件的能 力，實現對機體免疫應答的遺傳控制，并使MHC成為個體的終身遺傳標志。MHC的多 態性亦與個體抗病能力息息相關，在雞、哺乳類、魚類中都已發表MHC多態性與機體抗 病力相關性研究的文章。MHC多態性在系統進化的研究、種群保護的研究和遺傳育種等 方面都是一個極其重要的材料，是當今MHC基因研究的一個熱點。魚類MHCII的α和β基因一般是連鎖遺傳的。目前已在超過30種硬骨魚類中 克隆得到MHC基因并證明了其多態性，如斑馬魚、鯉魚、大西洋鮭、牙鲆、條紋石鯧、 真鯛等。魚類MHC基因功能與哺乳類相同，參與抗原遞呈引起免疫級聯反應。研究表 明，魚類MHC基因中編碼PBR結構域的基因片段(通常為MHC基因上的第二個外顯子) 亦具有高度多態性，且與魚類的免疫抗病能力密切相關。Kj0gIum等將7個家系約2000 尾的大西洋鮭以5種MHC I等位基因和4種MHC II等位基因組合并結合傳統家系選育方 式篩選針對ISA(傳染性貧血病)的抗病群體，成功篩選出有效的抗病基因型組合，這開創了使用MHC進行魚類抗病輔助育種的先河。此后，在牙鲆、鯉魚中也有類似研究被報 道。目前，國內外尚無任何關于石斑魚MHC基因的研究被報道。
發明內容
本發明的目的在于根據現有技術中對MHC基因的研究尚未完全的問題，提供 一種與石斑魚抗病相關的石斑魚MHC IIB基因。本發明另一目的在于提供上述石斑魚MHC IIB基因上的等位基因。本發明另一目的在于提供上述石斑魚MHC IIB基因編碼的蛋白。本發明另一目的在于提供上述石斑魚MHC IIB基因的克隆方法。本發明另一目的在于提供上述石斑魚MHC IIB基因的序列多態性的檢測方法。本發明還有一個目的在于提供上述石斑魚MHC IIB基因的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現一種石斑魚MHCIIB基因，其序列如SEQ ID NO: 1所示，該基因是通過同源克
隆的方法從斜帶石斑魚脾臟中分離得到的。所述基因中至少存在12個不同的等位基因， 其核苷酸序列如SEQ IDNO 3 14所示。上述石斑魚MHC IIB基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列SEQ ID NO 2所示， 共249個氨基酸，等電點為6.53，分子量為28.31千道爾頓，石斑魚MHC IIB蛋白主要 分為4個結構域，分別是Exonl編碼的信號肽(SP)、Εχ0η2編碼的多肽結合區(即β 1 結構域，PBR)、Εχοη3編碼的IGcl區(即β 2結構域)與Εχοη4和部分Εχοη5編碼的 跨膜區。石斑魚MHC IIB基因所編碼的蛋白與大菱鲆、真鯛、虹鱒、斑馬魚、小鼠和人 MHC IIB基因所編碼蛋白的同源性分別為74.0%、79.1%、58.4%,。55.2%、32.0% 和 31.5%。本發明石斑魚MHC IIB基因的克隆方法包括如下步驟(1)提取石斑魚總RNA，反轉錄得到CDNA第一條鏈，制備RACE PCR反應模 板；(2)根據不同物種MHC IIB的氨基酸序列的同源性設計簡并引物，得到石斑魚 MHC IIB基因的cDNA片段；所述簡并引物的序列如SEQ ID NO 15 16所示；(3)根據所得片段設計引物進行RACE PCR,所述引物序列如SEQ IDNO: 17 22 所示，獲得 1338bp 的 MHC IIB 全長 cDNA ；(4)根據與石斑魚親緣關系相近魚類的已知MHC IIB外顯子和內含子的分界位 點設計引物，進行內含子擴增，得到石斑魚MHC IIB的全基因序列，所述引物如SEQ ID NO 23 30所示。本發明石斑魚MHCIIB基因多態性研究，根據石斑魚MHC IIB基因的第一外顯 子上合成特異性上游引物EpcoMHC2bPl_F，序列如SEQ ID NO: 31所示，在第二外顯子 的末端和第二內含子前端合成特異性下游引物EpcoMHC2bH_R，序列如SEQ ID NO: 32 所示；在45條不同石斑魚個體中進行PCR擴增，挑取145個陽性克隆并送測序后，得到 MHC IIB基因PBR區域多態性的原始數據。測序結果表明，MHC IIB基因在石斑魚中存 在兩個不同位點，其分子量大小差異在于Intran 1的長度不同。其中一個位點的Intranl 大小為138bp，命名為DAB2;另一位點的Intronl大小在不同魚種差異很大，但總是大于138bp，命名為DAB 1。在45條魚145個陽性克隆中共存在12個不同序列，這表明在石 斑魚MHC IIB基因中至少存在12個不同的等位基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO 3 14所示。其中10個等位基因屬于DABl位點，2個等位基因屬于DAB2位點。將10個 屬于DABl位點的等位基因命名為EpcoDAB*l_01到EpcoDAB*l_10，將2個屬于DAB2 位點的等位基因命名為EpcoDAB*2-01和EpcoDAB*2_02。上述石斑魚MHC IIB抗病相關標記篩選，采用自然選擇和人工感染途徑獲得 抗病群體和不抗病群體。在發病旺季，從養殖場收集發病后存活的個體，同時用病原 菌感染收集來的魚苗，根據對病原菌感染的抵抗存活能力大小獲得抗病群體和不抗病群 體。總共對81個個體的321個陽性克隆進行了測序，結果表明，有6種MHC基因型 高頻率出現在抗病個體中，其中 EpcoDAB*l_01，EpcoDAB*l_02，EpcoDAB*l_04， EpcoDAB*l_05，EpcoDAB*2_01 和 EpcoDAB*2_02，所出現的頻率分別為 14.81 %、 7.41%, 7.41%, 14.81%, 7.41%, 11.11 % 和 37.04%。上述石斑魚MHC IIB抗病相關標記輔助育種的方法將在抗病群體中高頻率出 現的MHC IIB基因型作為抗病相關MHC IIB基因標記，將攜帶這些抗病基因標記的親魚 進行繁殖，培育后代，分離后代中的MHC IIB基因，研究MHC IIB基因多態性，同時進 行病原微生物感染實驗，研究抗病MHC IIB基因標記的遺傳規律及其與魚體抗病力的關 系，從中篩選出既含有抗病MHC IIB基因標記，抗病力又提高的魚苗，進行多代繁殖和 培育后即可建立抗病新品種。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明采用功能基因組技術，在石斑魚中篩選到抗病相關的MHC基因標記，初 步建立石斑魚抗病MHC基因標記輔助育種技術，該技術操作簡單、選育效率高，適宜在 所有海水養殖魚類上推廣應用，對石斑魚抗病品種培育具有重要意義和應用價值。
圖1是石斑魚MHC IIB 12種不同的基因型在抗病群體中的分布頻率。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。實施例1 1.石斑魚脾臟總RNA的提取取健康斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)，2齡，體重約750g， 以 MS-222 (tricaine methanesulphonate)麻醉約lmin，經尾靜脈取血后立即分離出脾臟。采
用Trizol試劑法提取獲得石斑魚脾臟總RNA，其OD260/280 = 1.85，電泳結果顯示，28S rRNA，18SrRNA條帶清晰，28S條帶亮度為18S的兩倍，表明所得總RNA未被蛋白質、 酚和基因組DNA污染，純度高。2.CDNA第一鏈的合成取5 μ g斜帶石斑魚脾臟總RNA樣品進行DNA酶處理以去除基因組DNA的污 染，與RNA Oligo dT(序列如SEQ ID NO: 33所示)混合，進行反轉錄，所的產物置于-20°C保存備用。3.引物設計從GenBank數據庫中下載獲得近源物種，如舌齒鱸(DQ821113)，牙鲆 (AY848955)和真鯛(AY190711)等MHC II B同源基因CDS序列，利用ClustalX軟件進行 多序列比對，確定保守區，根據所確定保守區設計簡并引物，擴增片段大小約為300bp。引物序列如SEQ ID NO 15 16所示。4.斜帶石斑魚MHC IIB基因cDNA全序列的克隆以實施例2合成的第一鏈cDNA作為模板，以簡并引物進行PCR擴增，所得PCR 產物上樣至1.8wt%瓊脂糖凝膠，以低電壓電泳分離DNA片段，從凝膠中純化回收目的 產物。將純化后的目的產物連接至pGEM-T Easy載體，轉化DH5a大腸桿菌，挑選 陽性克隆測序。Blast同源分析表明，目的產物為MHC IIB基因的中間片段。根據已得到的cDNA片段序列設計特異性引物，利用cDNA末端快速擴增技術 (RapidAmplification ofcDNA ends, RACE)對目的基因的 3 ‘-禾Π 5 ‘-末端進行 PCR 擴增。 按照RACE試劑盒GeneRacerTM Kit說明書對斜帶石斑魚脾臟總RNA進行去磷 酸，去mRNA5'帽子結構，與RNA Oligo連接，最終通過反轉錄合成cDNA第一鏈。 用斜帶石斑魚MHC IIB cDNA的3 ‘-禾口 5 ‘ -RACE特異弓|物(MHOF2，MHC-F3和 MHC-R2，MHC-R3)禾Π GeneRacerTM Kit 的通用引物，以 GeneRacerTM Kit 反轉錄合成 的第一鏈cDNA為第一輪PCR模板，以稀釋的第一輪PCR產物為第二輪PCR模板，擴增 MHC IIB cDNA 3'端和5'端片段，對所得到的PCR產物的回收純化、連接T載體、轉 化大腸桿菌、陽性克隆鑒定及DNA測序。測序所得序列再與簡并引物擴增所得的序列利 用Clustal X軟件進行拼接。特異引物序列如SEQIDNO 17 22所示。5.斜帶石斑魚MHC IIB基因組DNA全序列的獲得從石斑魚肝臟中提取其總DNA，使用海洋動物基因組提取試劑盒，用層析柱的 方法提取基因組DNA。根據其他親緣關系相近魚類的已知MHC IIB基因外顯子與內含 子的分界點設計特異性引物(序列如SEQ ID NO 23 30)進行內含子的擴增。與其它 脊椎動物的MHC IIB基因組結構類似，石斑魚MHC IIB基因組包含有5個外顯子和4個 內含子，其中5個外顯子的長度分別為74bp，273bp，282bp，114bp和595bp，而內含子 1，2，3和4的長度分別為192bp，273bp，118bp和108bp ；測定了全部5個外顯子和4 個內含子的序列，獲得了石斑魚MHC IIB全基因序列。實施例2斜帶石斑魚MHC IIB基因序列多態性根據石斑魚MHC IIB基因的第一外顯子上合成特異性上游引物 EpcoMHC2bPl-F,序列如SEQ ID NO: 31所示，在第二外顯子的末端和第二內含子前端 合成特異性下游引物EpcoMHC2bH_R，序列如SEQ ID NO 32所示；在45條不同石斑 魚個體中進行PCR擴增，挑取145個陽性克隆并送測序后，得到MHC IIB基因PBR區 域多態性的原始數據。測序結果表明，MHC IIB基因在石斑魚中存在兩個不同位點， 其分子量大小差異在于Intron 1的長度不同。其中一個位點的Intronl大小為138bp， 命名為DAB2;另一位點的Intronl大小在不同魚種差異很大，但總是大于138bp，命名為DAB1。在45條魚145個陽性克隆中共存在12個不同序列，這表明在石斑魚MHC IIB基因中至少存在12個不同的等位基因。其中10個等位基因屬于DABl位點，2個 等位基因屬于DAB2位點。將10個屬于DABl位點的等位基因命名為EpcoDAB*l_01 到EpcoDAB*l_10，將2個屬于DAB2位點的等位基因命名為EpcoDAB*2_01和 EpcoDAB*2-02。實施例3斜帶石斑魚MHC IIB基因抗病相關標記的篩選采用自然選擇和人工感染途徑獲得抗病群體和不抗病群體。在發病旺季，從養 殖場收集發病后存活的個體，同時用病原菌感染收集來的魚苗，根據對病原菌感染的抵 抗存活能力大小獲得抗病群體和不抗病群體。總共對81個個體的321個陽性克隆進行了 測序，結果表明，有6種MHC基因型高頻率出現在抗病個體中，其中EpcoDAB*l_01， EpcoDAB*l_02，EpcoDAB*l_04，EpcoDAB*l_05，EpcoDAB*2_01 和 EpcoDAB*2_02， 所出現的頻率分別為 14.81%、7.41%, 7.41%, 14.81%, 7.41%, 11.11 %和 37.04% (圖 1)。實施例4斜帶石斑魚MHC IIB基因抗病相關標記輔助育種方法將在抗病群體中高頻率出現的MHC IIB基因型作為抗病相關MHC IIB基因標 記，將攜帶這些抗病基因標記的親魚進行繁殖，培育后代，分離后代中的MHCIIB基 因，研究MHC IIB基因多態性，同時進行病原微生物感染實驗，研究抗病MHC IIB基因 標記的遺傳規律及其與魚體抗病力的關系，從中篩選出既含有抗病MHC IIB基因標記， 抗病力又提高的魚苗，進行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品種。將在抗病群體中高頻率出現的MHC IIB基因型作為抗病相關MHC IIB基因標 記，通過對親魚MHC IIB基因型進行篩選，挑選出含有EpcoDAB*2-01和EpcoDAB*2-02 基因型的雌雄斜帶石斑魚親魚進行繁殖，培育后代。分離后代中的MHC IIB基因，研 究他們MHC IIB基因多態性，同時進行病原微生物感染實驗，收集來的魚苗，檢測對病 原菌感染的抵抗存活能力。結果表明含有EpcoDAB*2-01和EpcoDAB*2_02基因型的魚 苗，存活能力比有普通魚苗增加27%，因此EpcoDAB*2-01和EpcoDAB*2_02可以作為 抗病MHC IIB基因標記，生產抗病力高的魚苗，進行多代繁殖和培育后即可建立抗病新 品種。
權利要求
1.一種石斑魚MHC IIB基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示。
2.根據權利要求1所述石斑魚MHCIIB基因，其特征在于所述基因中至少存在12個 不同的等位基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3 14所示。
3.權利要求1所述石斑魚MHCIIB基因編碼的蛋白，其特征在于所述蛋白的等電點 為6.53，分子量為28.31千道爾頓，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.權利要求1所述石斑魚MHCIIB基因的克隆方法，其特征在于所述方法包括如下 步驟(1)提取石斑魚總RNA，反轉錄得到cDNA第一條鏈，制備RACEPCR反應模板；(2)根據不同物種MHCIIB的氨基酸序列的同源性設計簡并引物，得到石斑魚MHC IIB基因的cDNA片段；所述簡并引物的序列如SEQ ID NO 15 16所示；(3)根據所得片段設計引物進行RACEPCR，所述引物序列如SEQ IDNO : 17 22 所示，獲得1338bp的MHC IIB全長cDNA ；(4)根據與石斑魚親緣關系相近魚類的已知MHCIIB外顯子和內含子的分界位點設計 弓丨物，進行內含子擴增，得到石斑魚MHC IIB的全基因序列，所述引物如SEQ ID NO : 23 30所示。
5.權利要求1所述石斑魚MHCIIB基因序列多態性的檢測方法，其特征在于所述方 法包括如下步驟根據石斑魚MHC IIB基因的第一外顯子上合成特異性上游引物，序列 如SEQ ID NO: 31所示，在第二外顯子的末端和第二內含子前端合成特異性下游引物， 序列如SEQ ID NO: 32所示；在不同石斑魚個體中進行PCR擴增，挑取陽性克隆測序， 得到MHC IIB基因PBR區域多態性的數據。
6.權利要求1所述石斑魚MHCIIB基因的應用，其特征在于所述石斑魚MHC IIB基 因用于標記輔助育種。
7.根據權利要求6所述石斑魚MHCIIB基因的應用，其特征在于所述石斑魚MHC IIB 基因用于標記輔助育種的方法如下將在抗病群體中出現的MHCIIB基因型作為抗病相 關MHC IIB基因標記，將攜帶這些抗病基因標記的親魚進行繁殖，培育后代，分離后代 中的MHCIIB基因，進行病原微生物感染實驗，從中篩選出既含有抗病MHC IIB基因標 記、抗病力又提高的魚苗，進行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品種。
全文摘要
本發明公開了一種石斑魚MHC IIB基因及其克隆方法和應用。本發明石斑魚MHC IIB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，該基因編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發明通過同源克隆的方法，從石斑魚中分離得到MHCIIB基因，鑒定出12種不同的MHC IIB基因型，對MHC IIB基因的多態性和抗病力之間的相互關系進行了分析，篩選出與石斑魚抗病相關的MHCIIB基因的6種分子標記，適用于石斑魚抗病相關標記的篩選和抗病品種的選育。
文檔編號C07K14/74GK102010868SQ20101026294
公開日2011年4月13日 申請日期2010年8月24日 優先權日2010年8月24日
發明者劉曉春, 盧丹琪, 張勇, 張海發, 易詩白, 李水生, 林浩然, 王磊, 蒙子寧 申請人:中山大學