專利名稱：用于蛋白質二維電泳分離的微流控芯片接口的制備方法
技術領域：
本發明涉及微流控芯片，尤其是涉及一種用于蛋白質二維電泳分離的微流控芯片接口的制備方法。
背景技術：
蛋白質是最主要的生命活動的載體和功能執行者，最早于1994年提出的蛋白質組學(Proteome)是指基因所能表達的全部蛋白質，即細胞或組織或機體在特定時間和空間上表達的所有蛋白質。探索蛋白質的作用模式、功能機理、調節調控以及蛋白質組群內的相互作用，能為臨床診斷、病理研究、藥物篩選、新藥開發、新陳代謝途徑等研究提供理論依據和基礎。進行蛋白組學研究的主要方法包括二維電泳分離、質譜、微陣列芯片等(Domon， B.，Aebersold, R.，Science 2006，312，212. ；Kung, L. A.，Snyder, Μ.，Nat. Rev. Mo 1. Cell Biol. 2006，7，617. ；Service, R. F.，Science 2001，四4，2074.)，其中二維電泳分離是最常用的蛋白質分離方法，以等電聚焦(isoelectric focusing, IEF)作為第一維，聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)作為第二維。二維電泳的突出優點是具有很高的分辨率，在一塊膠上能夠分離3000 5000個蛋白質，有些報道甚至可以分辯出5000 10000個蛋白質斑點。但是還是存有以下不足耗時費力，重復性不好，對極端蛋白、低豐度蛋白和疏水性蛋白的分離能力不足，這些不足嚴重地阻礙了相關研究的進一步快速發展。微流控芯片技術自從20世紀90年代首次提出以來得到迅速發展(Manz，Α.， Graber, N.，Widemer, H. M. Sens. Acturators, B, 1990，Bi, 244.)，已經被廣泛應用到各個方面。微流控芯片由于具有以下優點而特別適合快速和高通量分析1集成化，便于集成大量功能單元；2微型化，便于攜帶實現現場與移動分析；3消耗低，能量與試劑的消耗大幅降低；4效率高，高熱導和快速傳質能夠提高效率并縮短分析時間。利用微流控芯片進行蛋白質二維電泳分離，由于比表面積大，有利于散熱，能有效降低區帶擴展，提高峰容量并能應用更高的分離電壓；分離距離較短能產生更大的場強，實現更快的分離和更高的分辨率； 分離過程完全在微通道內，減少了外界干擾和污染還能有效提高重現性；樣品在兩維間能進行直接轉移而無需額外操作；第二維凝膠電泳分離過程中，蛋白質被限制在間隔開的通道中而完全排除了橫向擴散，最大程度地保證了峰容量。在微流控芯片上進行蛋白質二維電泳分離的關鍵就是加工合適的兩維間接口 能有效地隔離兩維所需的不同緩沖體系；在等電聚焦期間將蛋白質限制在第一維通道中；在等電聚焦完成后，能通過電轉移等方法迅速有效地將蛋白質轉移進入第二維通道以進行進一步分離。已經有多篇報道加工不同的接口用于二維分離，如在兩維通道之間加工超細的通道進行連接，產生的阻力以阻止擴散并同時降低擴散的體積(Emrich, C. A.，Medintz, I. L.，Chu, W. K.，Mathies, R. A.，Anal. Chem. 2007,79,7360.)；在接口處制作多孔的凝膠，凝膠中細小的孔洞能提供阻力降低自由擴散(Das, C.，Zhang, J.，Denslow，N. D.，Fan, Ζ. H.，Lab Chip 2007，7，1806.)；在第一維通道兩側設計空氣隔離閥進行隔離，在等電聚焦完成后再將緩沖液加入到隔離閥中以連通(Tsai, S. W. ，Loughran, M. ，Karube, I. ，J. Micromech. Microeng. 2004,14,1693.)；禾I」 用第一維通道兩側額外的通道內的電場對第一維的緩沖液和蛋白質樣品進行局限(Lerch， Μ. Α.，Jacobson, S. C.，Anal. Chem. 2007，79，7485.)。但是這些方法都還存有一定的不足 操作繁瑣復雜，孔徑過大，阻力太小，無法簡單有效的降低兩維通道間的自發擴散。
發明內容
本發明的目的是針對目前在微流控芯片上進行蛋白質二維分離方面的不足，提供一種用于蛋白質二維電泳分離的微流控芯片接口的制備方法。本發明包括以下步驟1)在微流控芯片豎直通道內預先制作好聚丙烯酰胺凝膠并充滿緩沖水溶液；2)將有機相通過微流控芯片水平通道的入口引入并充滿水平通道，在水平通道與豎直通道的連接處形成水相-有機相的兩相界面；3)將溶解有鈦酸四異丙酯的有機相引入并充滿水平通道，水平通道內的鈦酸四異丙酯會在水相-有機相的界面處發生水解反應并產生TiO2,使水解產生的TiA形成具有很多微孔的薄膜；4)將鈦酸四異丙酯的有機溶液排出水平通道，并將水平通道清洗干凈；5)往水平通道內加入溶解有蛋白質和兩性電解質的等電聚焦緩沖液，在水平通道兩端施加電場進行等電聚焦，兩性電解質在電場作用下沿水平通道形成一個PH梯度，蛋白質根據各自不同的等電點在水平通道內實現第一維分離，兩維連接處的TiO2薄膜在等電聚焦過程中能夠阻止蛋白質擴散進入第二維通道；6)等電聚焦完成后，在豎直通道兩端施加電場進行第二維凝膠電泳分離，TiO2薄膜上的微孔能夠通過電場，并且蛋白質在電場作用下能夠穿過TiO2上的微孔進入到第二維通道以進行第二維分離。在步驟1)中，所述微流控芯片可由玻璃、石英、硅或高聚物等材料所制，經可逆或不可逆鍵合組成完整的微通道，微通道內表面根據需要不進行或進行一定的表面處理，通道的尺寸為Inm 5cm。在步驟2~)中，所述有機相可為與水不混溶的各種有機溶液，所述有機溶液可選自醇、酯、礦物油等中的一種。本發明的優點在于微孔薄膜包圍在等電聚焦通道兩側，將面向凝膠電泳通道的開口封閉起來形成一個虛擬的閉合通道，薄膜上的納米孔徑能夠提供足夠的流體阻力來阻止蛋白質的擴散，又能提供導通的電場，在凝膠電泳通道兩端施加電場時，蛋白質能夠穿越納米微孔進入第二維凝膠電泳通道；薄膜恰好位于兩維的接口處，沒有死體積；制作簡便快速。
圖1是本發明實施例的微流控芯片結構示意圖。
具體實施例方式參見圖1，以下實施例將詳細描述根據本發明作進一步的說明。
實施例11.微流控芯片設計及接口加工設計如圖1中所示的微流控芯片1，其中水平通道作為第一維，進行等電聚焦，豎直的平行通道(100 500根)作為第二維，進行凝膠電泳。通道寬度為50 μ m，間隔也為 50μπι，深度為25μπι。平行的豎直通道是為了保證已按等電點分離的蛋白質在進行凝膠電泳時仍保持分離，豎直通道的數目和等電聚焦的高分辨率相結合共同保證二維分離的高峰容量。在微通道內(包括等電聚焦通道2和凝膠電泳通道幻加入丙烯酰胺前聚體和引發劑，利用光聚合反應加工聚丙烯酰胺凝膠，其中等電聚焦通道2在曝光過程中用掩膜進行保護而不發生聚合反應。將礦物油加入到水平通道，由于表面張力，礦物油會與豎直通道內的水相在通道交叉處形成兩相界面(如圖1中4所示)。將溶解有鈦酸四異丙酯的礦物油引入到水平通道，鈦酸四異丙酯會在界面處發生水解反應而產生二氧化鈦納米顆粒，并組成具有納米微孔的薄膜，控制反應時間和反應物濃度控制形成具有不同厚度、微孔孔徑以及微孔分布的薄膜。2. 二維電泳分離將熒光標記后的蛋白質樣品和兩性電解質混合在緩沖液中，并加入到水平通道。 在等電聚焦通道兩端的儲液池中分別加入少許酸堿溶液(PH值分別為3和10)作為陽極和陰極電解液，通電開始進行等電聚焦。兩性電解質會在電場作用下產生相應PH梯度，蛋白質分子向具有特定PH值的位置遷移，這個ρΗ值與蛋白質所特有的等電點相一致。在這個位置，蛋白質不帶任何額外電荷呈電中性而不再遷移，不同的蛋白質由于具有不同的等電點而實現等電聚焦分離。二氧化鈦薄膜能降低等電聚焦通道和凝膠電泳通道間不同緩沖液間的互相擴散以及蛋白質樣品向凝膠電泳通道的擴散。等電聚焦完成后，撤去等電聚焦通道兩端的電場并在凝膠電泳通道兩端施加電場，二氧化鈦薄膜上有許多細小的微孔，電場能夠穿過這些微孔形成完整回路，在電場的作用下，蛋白質分子會穿過這些微孔進入到平行的凝膠電泳通道并根據其分子量的不同大小實現第二維分離。
權利要求
1.用于蛋白質二維電泳分離的微流控芯片接口的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)在微流控芯片豎直通道內預先制作好聚丙烯酰胺凝膠并充滿緩沖水溶液；2)將有機相通過微流控芯片水平通道的入口引入并充滿水平通道，在水平通道與豎直通道的連接處形成水相-有機相的兩相界面；3)將溶解有鈦酸四異丙酯的有機相引入并充滿水平通道，水平通道內的鈦酸四異丙酯會在水相-有機相的界面處發生水解反應并產生TiO2,使水解產生的TiA形成具有很多微孔的薄膜；4)將鈦酸四異丙酯的有機溶液排出水平通道，并將水平通道清洗干凈；5)往水平通道內加入溶解有蛋白質和兩性電解質的等電聚焦緩沖液，在水平通道兩端施加電場進行等電聚焦，兩性電解質在電場作用下沿水平通道形成一個PH梯度，蛋白質根據各自不同的等電點在水平通道內實現第一維分離，兩維連接處的TiO2薄膜在等電聚焦過程中能夠阻止蛋白質擴散進入第二維通道；6)等電聚焦完成后，在豎直通道兩端施加電場進行第二維凝膠電泳分離，TiO2薄膜上的微孔能夠通過電場，并且蛋白質在電場作用下能夠穿過TiO2上的微孔進入到第二維通道以進行第二維分離。
2.如權利要求1所述的用于蛋白質二維電泳分離的微流控芯片接口的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述微流控芯片由玻璃、石英、硅或高聚物材料所制。
3.如權利要求1所述的用于蛋白質二維電泳分離的微流控芯片接口的制備方法，其特征在于在步驟2、中，所述有機相為與水不混溶的各種有機溶液。
4.如權利要求3所述的用于蛋白質二維電泳分離的微流控芯片接口的制備方法，其特征在于所述有機溶液選自醇、酯、礦物油中的一種。
全文摘要
用于蛋白質二維電泳分離的微流控芯片接口的制備方法，涉及微流控芯片。在微流控芯片豎直通道內制作聚丙烯酰胺凝膠并充滿緩沖水溶液；將有機相通過微流控芯片水平通道的入口引入并充滿水平通道；將溶解有鈦酸四異丙酯的有機相引入并充滿水平通道；將鈦酸四異丙酯的有機溶液排出水平通道，并將水平通道清洗干凈；往水平通道內加入溶解有蛋白質和兩性電解質的等電聚焦緩沖液，在水平通道兩端施加電場進行等電聚焦，蛋白質根據各自不同的等電點在水平通道內實現第一維分離；等電聚焦完成后，在豎直通道兩端施加電場進行第二維凝膠電泳分離，TiO2薄膜上的微孔通過電場，蛋白質在電場作用下穿過TiO2上的微孔進入到第二維通道以進行第二維分離。
文檔編號C07K1/26GK102504010SQ20111034311
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者宋站雨, 張博, 王秋泉, 陳宏 申請人:廈門大學