專利名稱：滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法
技術領域：
本發明涉及一種藥用生物制品制備方法，尤其涉及一種將從人尿提取的胰蛋白酶抑制劑中所含病毒滅活的方法。
背景技術：
人尿膜蛋白酶抑制劑(human Urinary Trypsin Inhibitor, hUTI)是一種從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的糖蛋白，由143個氨基酸組成，SDS-PAGE測得的相對分子質量范圍40kDa-45kDa(Eur.J.Biochem.，158，417-422)。其屬于蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、α -糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細胞彈性蛋白酶、透明質酸酶、巰基酶和纖溶酶等多種酶具有抑制作用。此外，其還具有穩定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子(MDF)產生，清除氧自由基及抑制炎癥介質釋放的作用。人尿胰蛋白酶抑制劑還可改善手術刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，治療關節炎，治療嚴重急性呼吸綜合征，防止手術刺激引起的對內臟器官與細胞的損傷以及改善休克時的循環狀態等(CN102205115A、CN101024075A、CN1751740A、CN1449823A、CN101837121A、CN101954072A、CN101954071A、CN101972471A、CN101020048A 和 CN101095948A)。對于人尿胰蛋白酶抑制劑的分離純化的研究已開展幾十年，已知的這些純化方法有陰離子交換色譜、金屬螯合樹脂分離、超濾、凝膠過濾、親和性色譜、無機吸附劑處理、鹽析、等電點沉淀法、脫乙酰殼多糖吸附和不溶性胰蛋白酶處理等(特開昭51-51579、特開昭51-118810、特開昭 51-123810、特開昭 55-160724、特開昭 56-99427、特開昭 57-140728、特開昭60-260518、特開昭61-37736和特開平5-9200)。中國發明專利ZL 200610000200.2和ZL 200610000601.8在特開平5-9200所公開技術的基礎上分別提供了一種獲得高純度烏司他丁的方法，所得烏司他丁濃度為5萬單位/ml時，在405nm處光吸收值不超過0.2，人尿激肽原酶含量不超過0.0005PNAU，抑制胰蛋白酶的活性不低于3500單位/mg蛋白(凱氏定氮法測定蛋白含量)。由于人尿胰蛋白酶抑制劑一般從新鮮人尿中分離提取而得，具有被病毒污染的潛在風險。前述這些研究大都集中于對人尿胰蛋白酶抑制劑的分離純化，但是對于其中所可能含有的病毒(如:人免疫缺陷病毒、腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒、水皰性口炎病毒和肝炎病毒等)去除方面所給予的關注較少。特開昭61-37736公開了一種去除人尿胰蛋白酶抑制劑中所含肝炎病毒的方法，該方法采用在pH2-8(尤以3-5為佳)溶液中60°C加熱處理10小時，去除混雜在原料中的病原性肝炎病毒。其結果表明經過10小時60°C加熱處理，人尿胰蛋白酶抑制劑在 酸性下穩定，而在PH8以上的堿性則表現出不穩定。除了熱處理法(包括干熱處理、蒸汽處理和巴斯德加熱處理法)以外，其它方法如:有機溶劑/表面活性劑(S/D)處理法、胃蛋白酶處理方法、紫外線照射處理方法、低pH孵化法、納米膜過濾法和低溫乙醇分離法等也可被用于病毒滅活。周錫鵬等人驗證了人尿胰蛋白酶抑制劑生產工藝中采用的60°C水浴10小時和乙醇處理3小時的病毒滅活方法(中國生化藥物雜志[J]，2009，6，407-410)，雖然具有較好的滅活效果，但有機溶劑(乙醇)會殘留在終產品中，進而影響用藥的安全。雖然現有技術已在滅活人尿胰蛋白酶抑制劑所含病毒方面進行了初步研究，但是這些技術或適用于滅活肝炎病毒，或仍對用藥安全性產生影響。
發明內容
本發明的目的在于提供一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，通過綜合運用多種病毒滅活方法，不斷調整滅活條件和其它手段相配合，進一步提高病毒的滅活效果。本發明的另一個目的在于提供一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離純化過程相配合，在分離過程中實現病毒的滅活。本發明提供的一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下:將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于PH5.0緩沖液，并于60°C加熱10小時，然后吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經超濾后，于25°C，低pH孵化5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。人尿胰蛋白酶抑制劑粗品的配置濃度，與病毒的去除有一定的關聯。本發明優先選擇濃度為50mg/ml-100mg/ml的溶液。本發明采用的低pH孵化，其pH為1.5-4.5，優先選擇2.5-4,如:但不僅限于，2.5、
2.7、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9 和 4。
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本發明吸附于DEAE層析柱所用的緩沖液為pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋
酸緩沖液。本發明超濾所用的超濾膜分子量為10K。本發明提供的另一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下:將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為50mg/ml-100mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時，然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的
0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經IOK膜超濾后，于25°C，pH2.5-3.5條件5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。本發明所使用的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品，其活性為200單位/mg-3000單位/mg，可采用目前現有各種方法制得，如:但不僅限于，特開昭51-51579、特開昭51-118810、特開昭 51-123810、特開昭 55-160724、特開昭 56-99427、特開昭 57-140728、特開昭 60-260518、特開昭61-37736、特開平5-9200、中國發明專利ZL200610000200.2和中國發明專利ZL200610000601.8。為配合本發明病毒滅活方法，本發明提供的一種人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法，其步驟如下:I)將新鮮收集的尿液傾入攪拌池中，邊攪拌，邊將pH調至8.5-9.0，靜置后取上清尿液；2)調節上清尿液pH至4.5-6.5后，按每噸上清尿液加入25kg脫乙酰殼多糖，邊加邊攪拌，靜置后取沉淀，并濾干得吸附物。3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并濾干，重復2次以上；4)每千克吸附物加入1.0-2.0升pH為10.5-12.0的3N氨水溶液，洗脫吸附物，并收集氨水洗脫液；5)根據按每升氨水洗脫液加入400g_450g固體硫酸銨，至全部溶解，靜置過夜；6)以硅藻土作底，抽濾，即得抽濾物；7)每公斤抽濾物加入10升水溶解，將pH調至5.5-6.5后，離心，取上清液；8)上清液用IOK超濾膜，得超濾濃縮液；9)每升超濾濃縮液加入I倍體積無水乙醇沉淀，并靜置過夜；之后取下層混懸液離心，得清液，再加入和清液相同體積的無水乙醇沉淀，并靜置過夜；再取下層混懸液離心，將沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制劑粗品。本發明提供的人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法，與本發明滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法相配合，能在分離過程中實現病毒的滅活，無需再經其它病毒滅活步驟即可完成。
本發明技術方案實現的有益效果:本發明提供的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，通過綜合運用多種病毒滅活方法，尤其是先經熱處理法再由低PH孵化法兩種病毒滅活手段，實現了產品無有機溶劑殘留，提高了用藥安全性。此外，還綜合了其它分離介質(陰離子和疏水介質)實現了多種病毒(如:人免疫缺陷病毒、腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒和水皰性口炎病毒)的滅活，進一步提高了人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒滅活效果，使用藥的安全性得到進一步提聞。本發明還通過與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法的綜合，在分離人尿胰蛋白酶抑制劑的過程中實現了其中所含病毒的同步滅活，無需再經其它病毒滅活步驟即可完成，有效減少了物料損失。
具體實施例方式以下詳細描述本發明的技術方案。本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。本發明所用的試劑若未明確指明，則均購自于西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實施例1I)將新鮮收集的尿液傾入攪拌池中，邊攪拌，邊將pH調至8.5，靜置后取上清尿液；
2)調節上清尿液pH至4.5后，按每噸上清尿液加入25kg脫乙酰殼多糖，邊加邊攪拌，靜置后取沉淀，并濾干得吸附物。3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并濾干，重復2次；4)每千克吸附物加入1.0升pH為10.5的3N氨水溶液,洗脫吸附物,并收集氨水洗脫液；5)根據按每升氨水洗脫液加入400固體硫酸銨，至全部溶解，靜置過夜；6)以硅藻土作底，抽濾，即得抽濾物；7)每公斤抽濾物加入10升水溶解，將pH調至5.5后，離心，取上清液；8)上清液用IOK超濾膜，得超濾濃縮液；9)每升超濾濃縮液加入I倍體積無水乙醇沉淀，并靜置過夜；之后取下層混懸液離心，得清液，再加入和清液相同體積的無水乙醇沉淀，并靜置過夜；再取下層混懸液離心，將沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制劑粗品；10)人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為50mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時，然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于2.0M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經IOK膜超濾后，于25°C，pH3±0.1條件5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。選擇不同的種類的病毒為代表分別進行病毒滅活效果檢測，如:以人免疫缺陷病毒代表逆轉錄病毒；腦心肌炎病毒和`水皰性口炎病毒代表單鏈RNA病毒；偽狂犬病毒代表雙鏈DNA病毒。將制得的人尿胰蛋白酶抑制劑送至軍事醫學科學院微生物流行病研究所和上海生物制品研究所分別進行人免疫缺陷病毒(HIV-1)和腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒以及水皰性口炎病毒的病毒滅活委托檢測。結果表明，60°C條件下，經10小時可使初始滴度值(LgTCID50Ail) % 11.50 的 HIV-1 病毒下降 6 個 Lg 以上，初始滴度值(LgTCID50M)為 6.50的腦心肌炎病毒病毒60°C 1/2小時處理后下降4個Lg，I小時后檢測不到活體病毒。25°C，pH3±0.1條件下，經5小時可使初始滴度值(LgTCID5tZml)為5.6的偽狂犬病毒下降4個Lg以上，初始滴度值(LgTCID5Q/ml)為6.50的水皰性口炎病毒病毒下降4個Lg以上。熱處理(pH5.0，60°C，10小時)蛋白回收彡90%，效價回收95%。低pH孵化法(25°C, pH3±0.1，5小時)蛋白回收彡90%，效價回收95%。實施例2I)將新鮮收集的尿液傾入攪拌池中，邊攪拌，邊將pH調至9.0，靜置后取上清尿液；2)調節上清尿液pH至6.5后，按每噸上清尿液加入25kg脫乙酰殼多糖，邊加邊攪拌，靜置后取沉淀，并濾干得吸附物。3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并濾干，重復3次；4)每千克吸附物加入2.0升pH為12.0的3N氨水溶液,洗脫吸附物,并收集氨水洗脫液；5)根據按每升氨水洗脫液加入450g固體硫酸銨，至全部溶解，靜置過夜；
6)以硅藻土作底，抽濾，即得抽濾物；7)每公斤抽濾物加入10升水溶解，將pH調至6.5后，離心，取上清液；8)上清液用1OK超濾膜，得超濾濃縮液；9)每升超濾濃縮液加入I倍體積無水乙醇沉淀，并靜置過夜；之后取下層混懸液離心，得清液，再加入和清液相同體積的無水乙醇沉淀，并靜置過夜；再取下層混懸液離心，將沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制劑粗品。10)人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為70mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時，然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于2.0M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經IOK膜超濾后，于25°C，pH3±0.1條件5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。將制得的人尿胰蛋白酶抑制劑按實施例1的方法分別進行人免疫缺陷病毒HIV-1和腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒以及水皰性口炎病毒的病毒滅活委托檢測。結果表明，60°C條件下，經10小時可使初始滴度值(LgTCID5ciAil)為11.31的HIV-1病毒下降6個Lg以上，初始滴度值(LgTCID5ciAil)為6.70的腦心肌炎病毒病毒60°C 1/2小時處理后下降4個Lg，1小時后檢測不到活體病毒。25°C，pH3±0.1條件下，經5小時可使初始滴度值(LgTCID5tl/ml)為5.5的偽狂犬病毒下降4個Lg以上，初始滴度值(LgTCID5(l/ml)為6.50的水皰性口炎病毒病毒下降4個L g以上。熱處理(pH5.0，60°C，10小時)蛋白回收≥90%，效價回收95%。低pH孵化法(25°C，pH3±0.1，5小時)蛋白回收≥90%，效價回收95%。實施例31)將新鮮收集的尿液傾入攪拌池中，邊攪拌，邊將pH調至9.0，靜置后取上清尿液；2)調節上清尿液pH至6.5后，按每噸上清尿液加入25kg脫乙酰殼多糖，邊加邊攪拌，靜置后取沉淀，并濾干得吸附物。3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并濾干，重復2次以上；4)每千克吸附物加入1.5升pH為11.0的3N氨水溶液,洗脫吸附物,并收集氨水洗脫液；5)根據按每升氨水洗脫液加入450g固體硫酸銨，至全部溶解，靜置過夜；6)以硅藻土作底，抽濾，即得抽濾物；7)每公斤抽濾物加入10升水溶解，將pH調至6.5后，離心，取上清液；8)濾過液用IOK超濾膜，得超濾濃縮液；9)每升超濾濃縮液加入I倍體積無水乙醇沉淀，并靜置過夜；之后取下層混懸液離心，得清液，再加入和清液相同體積的無水乙醇沉淀，并靜置過夜；再取下層混懸液離心，將沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制劑粗品。10)人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于ρΗ5.0緩沖液，制成濃度為100mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時，然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于2.0M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經IOK膜超濾后，于25°C，pH3±0.1條件5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。將制得的人尿胰蛋白酶抑制劑按實施例1的方法分別進行人免疫缺陷病毒HIV-1和腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒以及水皰性口炎病毒的病毒滅活委托檢測。結果表明，60°C條件下，經10小時可使初始滴度值(LgTCID5tZml)為12.1的HIV-1病毒下降7個Lg以上，初始滴度值(LgTCID5ciAil)為6.40的腦心肌炎病毒病毒60°C經半小時處理后下降4個Lg，I小時后檢測不到活體病毒。25°C，pH3±0.1條件下，經5小時可使初始滴度值(LgTCID5tl/ml)為5.5的偽狂犬病毒下降4個Lg以上，初始滴度值(LgTCID5Q/ml)為6.44的水皰性口炎病毒病毒下降4個Lg以上。熱處理(pH5.0，60°C，10小時)蛋白回收彡90%，效價回收95%。低pH孵化法(25°C，pH3±0.1，5小時)蛋白回收彡90%，效價回收95%。實施例4根據特開昭51-51579公開的方法制得的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為50mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時，然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于2.0M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經超濾IOK后，于25°C，pH3±0.1條件5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。結果表明，經60°C條件下，經10小時可使初始滴度值(LgTCID5Q/ml)為11.50的HIV-1病毒下降4個lg，初始滴度值(LgTCID5tZml)為6.50的腦心肌炎病毒病毒下降4個Ig ;25°C, pH3±0.1條件5小時可使初始滴度值(LgTCID5(l/ml)為5.6的偽狂犬病毒下降3個lg，初始滴度值(LgTCID5ci`Ail)為6.50的水皰性口炎病毒病毒下降3個lg。熱處理(pH5.0，60°C，10小時)蛋白回收彡90%，效價回收90%。低pH孵化法(25°C, pH3±0.1，5小時)蛋白回收彡90%，效價回收90%。比較1:根據特開昭51-51579公開的方法制得的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為50mg/ml的溶液，并于25°C，pH3±0.1條件5小時然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于2.0M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經超濾IOK后，于60°C加熱10小時，后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。結果表明，25 °C，pH3±0.1條件5小時可使初始滴度值(LgTCID5Q/ml)為5.6的偽狂犬病毒下降3個Lg，初始滴度值(LgTCID5tZml)為6.50的水皰性口炎病毒病毒下降3個Lg ;60°C條件下，經10小時可使初始滴度值(LgTCID50Ail)為11.50的HIV-1病毒下降4個Lg，初始滴度值(LgTCID5tZml)為6.50的腦心肌炎病毒病毒下降3個Lg。低pH孵化法(25°C，pH3±0.1，5小時)蛋白回收彡85%，效價回收80%。熱處理(ρΗ5.0，60。。，10小時)蛋白回收彡85%，效價回收80%。
權利要求
1.一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下: 將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于PH5.0緩沖液，并于60°C加熱10小時，然后吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將所述DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；所述疏水洗脫液經超濾后，于25°C，低pH孵化5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。
2.根據權利要求1所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于吸附于DEAE層析柱所用的緩沖液為pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液。
3.根據權利要求1所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述低PH孵化采用pH為1.5-4.5。
4.根據權利要求1所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述超濾所用的超濾膜分子量為10K。
5.一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下: 將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于PH5.0緩沖液，制成濃度為，并于60°C加熱10小時，然后將所述溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將所述DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；所述疏水洗脫液經超濾IOK后，于25°C，pH2.5-3.5條件5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。
6.根據權利要求1或5所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述人尿胰蛋白酶抑制劑粗品的配置濃度為50mg/ml-100mg/ml的溶液。`
7.一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下: 1)將新鮮收集的尿液傾入攪拌池中，邊攪拌，邊將PH調至8.5-9.0，靜置后取上清尿液； 2)調節所述上清尿液pH至4.5-6.5后，按每噸所述上清尿液加入25kg脫乙酰殼多糖，邊加邊攪拌，靜置后取沉淀，并濾干得吸附物。
3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并濾干，重復2次以上； 4)每千克所述吸附物加入1.0-2.0升pH為10.5-12.0的3N氨水溶液，洗脫所述吸附物，并收集氨水洗脫液； 5)根據按每升所述氨水洗脫液加入400g-450g固體硫酸銨，至全部溶解，靜置過夜； 6)以硅藻土作底，抽濾，即得抽濾物； 7)每公斤所述抽濾物加入10升水溶解，將pH調至5.5-6.5后，離心，取上清液； 8)所述上清液用IOK超濾膜，得超濾濃縮液； 9)每升所述超濾濃縮液加入I倍體積無水乙醇沉淀，并靜置過夜；之后取下層混懸液離心，得清液，再加入和所述清液相同體積的無水乙醇沉淀，并靜置過夜；再取下層混懸液離心，將沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制劑粗品； 10)將從人尿中提取的所述人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為50mg/ml-100mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時，然后將所述溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將所述DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；所述疏水洗脫液經IOK膜超濾后，于25°C，pH2.5-3.5條件5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。
8.根據 權利要求1、5和7之一所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述病毒為人免疫缺陷病毒、腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒、水皰性口炎病毒和肝炎病毒之一種或幾種。
全文摘要
一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于緩沖液中，并于60℃加熱，然后吸附于DEAE層析柱后洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用1M硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經超濾后，于低pH孵化，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。本發明通過綜合運用多種病毒滅活方法，尤其是先經熱處理法再由低pH孵化法兩種病毒滅活手段，并綜合了其它分離介質實現了多種病毒的滅活，進一步提高了人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒滅活效果，提高用藥的安全性。
文檔編號C07K1/18GK103102409SQ20111036006
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月14日 優先權日2011年11月14日
發明者紀向陽 申請人:上海楓華制藥有限公司