專利名稱：一種從牛肺中直接提取純化抑肽酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種從牛肺中直接提取純化抑肽酶的方法，特別是一種采用親和雙水相萃取工藝直接從牛肺中提取純化抑肽酶的方法。
背景技術：
抑肽酶(Aprotinin)，又稱為牛胰蛋白酶抑制劑(Bovine pancreatic trypsininhibitor，BPTI)，激肽釋放酶抑制劑(Kallikrein inhibitor)，Kunitz抑制劑(Kunitz inhibitor)和抗蛋白酶肽等。其分子式為C284H432N84079S7，為一含58個氨基酸殘基的堿性多肽鏈，其分子量為6.5KD，等電點為10.5。抑肽酶為一種白色或微黃色粉末，無臭，易溶于水，溶于70％乙醇和50％丙酮等，有可透析性。抑肽酶自上世紀60年代開始使用，發現它有抗激肽和抗休克的作用，進而有人成功使用大劑量抑肽酶治療急性胰腺炎，因而引起了生化與臨床醫務工作者的高度重視。許多報道表明，抑肽酶對多種絲氨酸蛋白酶具有很強的廣譜抑制作用，可以抑制胰蛋白酶(Trypsin)，胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)、纖維蛋白溶酶(Plasmin)、彈性蛋白酶(Elastin)、激肽釋放酶(Kallikrein)等。被用作于治療急性胰腺炎、肺氣腫喘息性支氣管哮喘的首選藥物，也可用于腫瘤的治療。
中國專利96120494X公開了一種從黃牛肺中制備抑肽酶的方法為將牛肺絞碎，用硫酸和80℃保溫等“極端”條件將雜蛋白變性，然后用活性碳起脫色和過濾作用，再用10％氫氧化鈉調整pH值后靜置，離心收集上清液。上清液經過硫酸銨鹽析沉淀或有機溶劑分級沉淀制成粗品，再經過胰蛋白酶親和層析操作后，進行超濾、去熱原、冷凍干燥等步驟后獲得抑肽酶產品。其中的關鍵步驟為胰蛋白酶親和層析步驟，目前采用的層析基質主要有珠狀交聯瓊脂糖和經過化學改性與修飾的微珠殼聚糖等。采用瓊脂糖珠為親和層析的基質時，其缺點是此吸附劑的機械強度小，使用條件苛刻，成本高，故不適合于工業化生產。采用傳統的層析純化工藝有著生產周期長(每個生產批次約需三天以上，其中親和層析的上樣吸附約需要1天以上)，產品的效價低(只能達到5000-6000KIU/mg)，回收率低下，生產步驟多，勞動強度大等缺點。并且采用傳統的層析方法雖然有分離度大等優點，但由于受到基質機械強度的限制，存在著柱的容量較小，流速小，處理量低下等諸多缺點，在大規模工業化生產中受到一定的限制。
發明內容
本發明的目的是提供一種采用親和雙水相萃取工藝從牛肺中直接提取純化抑肽酶的方法。
本發明是這樣來實現的，它包括親和雙水相萃取劑的制備、親和雙水相萃取體系的建立和純化抑肽酶的親和雙水相萃取工藝，具體步驟工藝如下(1)將胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上制備親和雙水相萃取劑首先活化甲氧基化的聚乙二醇(MPEG)，稱取MPEG 100g和無水碳酸鈉20g，溶于苯500mL中，加入均三氯三嗪1.5g，MPEG與均三氧三嗪的摩爾比為2∶1，MPEG分子量為4000-10000，優選為6000，80℃攪拌回流24小時，離心，將上清液傾入石油醚中(30-60℃)中，得活化MPEG2粗品沉淀。抽濾，將粗品用體積比為1∶1的苯∶丙酮混合液溶解，再用石油醚沉淀。同樣溶解、沉淀，反復5次，抽干，即得到活化的MPEG。然后用活化后MPEG與胰蛋白酶進行偶聯，取活化后的MPEG 3.0g并溶解于0.025mol/L的硼砂緩沖液中，然后加入若干胰蛋白酶(效價為3000KIU/mg以上)，輕緩攪拌(50rpm)，偶聯條件為15℃、8小時、胰蛋白酶∶PEG為1∶5，pH值7.0。采用20KD的超濾膜進行超濾去掉未偶聯的MPEG，偶聯好的MPEG-胰蛋白酶親和萃取劑采用冷凍干燥的方法保存；(2)和雙水相萃取體系的建立將胰蛋白酶-PEG或PEG溶液，硫酸銨溶液和一定量的抑肽酶粗提液(總蛋白濃度達到15mg/mL，抑肽酶活性為23KIU/mL)，雙水相系統的總體積為25mL，磁力攪拌一定時間，調節pH值，在500rpm的轉速下離心15min，分別測定上下相的體積、雙水相中的抑肽酶活性及總蛋白的含量。其中抑肽酶分配系數Ke＝上相總酶活ct/下相總酶活cb；總蛋白分配系數Kp＝上相總蛋白含量/下相總蛋白含量；抑肽酶的回收率＝上相中抑肽酶的含量/抑肽酶粗提液中抑肽酶的含量；相比R＝上相體積vt/下相體積vb。建立的親和雙水相萃取體系的萃取條件為萃取溫度為20-30℃、萃取體系中萃取劑的濃度為8-16％(W/V)、(NH4)2SO4的濃度為10-20％(W/V)、pH值為6.0-8.0、攪拌萃取時間為30-45min、萃取體系中初始蛋白濃度為5-25mg/mL。此時蛋白質分配系數Kp達到0.28，Ke達24；
(3)純化抑肽酶的親和雙水相萃取工藝取新鮮牛肺20Kg，經過硫酸酸解后(pH1.5)，進行板框過濾，濾液調整pH值為7.0-8.0后成為抑肽酶粗提液，用于親和萃取。每次親和萃取體系的的體積定為1L，平均每批產品約萃取50次，每批產品的處理量達到0.2億KIU左右，平均萃取能力為40萬KIU/次。親和萃取后含抑肽酶的上相組分經過調整pH值至1.5-2.0后用截留分子量為10KD的超濾膜進行超濾后的濾出液過3KD的超濾膜進行超濾脫鹽和濃縮。截留液重新用于親和萃取的萃取劑。將上述中獲得的濃縮液進行冷凍干燥獲得高純度抑肽酶精品。
本發明采用胰蛋白酶固定化技術將胰蛋白酶固定到聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)上，控制偶聯條件，獲得適當分子量胰蛋白酶-PEG聚合物，并采取胰蛋白酶-PEG/(NH4)2SO4親和萃取體系進行提取牛肺中的抑肽酶，然后采用超濾的方法將結合到胰蛋白酶上的抑肽酶與胰蛋白酶-PEG分離，超濾的濾出液經過超濾脫鹽、凍干后獲得高效價的抑肽酶產品。產品的純度或效價遠遠高于國家標準，效價達到6300KIU/mg。
具體實施例方式
以下為本發明的一個具體實施實例。
甲氧基化的聚乙二醇(MPEG)的活化稱取MPEG 100g和無水碳酸鈉20g，溶于苯500mL中，加入均三氯三嗪1.5g，80℃攪拌回流24小時，離心，將上清液傾入石油醚中(30-60℃)中，得活化MPEG2粗品沉淀。抽濾，將粗品用體積比為的1∶1的苯∶丙酮混合液溶解，再用石油醚沉淀。同樣溶解、沉淀，反復5次，抽干，即得到活化的MPEG。
活化后MPEG與胰蛋白酶的偶聯取活化后的MPEG 3.0g并溶解于0.025mol/L的硼砂緩沖液中，然后加入若干胰蛋白酶(效價為3000KIU/mg以上)，輕緩攪拌(50rpm)，偶聯條件為15℃、8小時、胰蛋白酶∶PEG為1∶5，pH值7.0。采用20KD的超濾膜進行超濾去掉未偶聯的MPEG。
胰蛋白酶-PEG/(NH4)2SO4親和萃取體系的建立在一個小燒杯(50mL)中按要求加入一定比例的胰蛋白酶-PEG或PEG溶液，硫酸銨溶液和一定量的抑肽酶粗提液(總蛋白濃度達到15mg/mL，抑肽酶活性為23KIU/mL)，雙水相系統的總體積為25mL，磁力攪拌一定時間，調節pH值，在500rpm的轉速下離心15min，分別測定上下相的體積、雙水相中的抑肽酶活性及總蛋白的含量。其中抑肽酶分配系數Ke＝上相總酶活ct/下相總酶活cb；總蛋白分配系數Kp＝上相總蛋白含量/下相總蛋白含量；抑肽酶的回收率＝上相中抑肽酶的含量/抑肽酶粗提液中抑肽酶的含量；相比R＝上相體積vt/下相體積vb。
根據單因素實驗的結果，建立的親和雙水相萃取體系的萃取條件為萃取溫度為25℃、萃取體系中萃取劑的濃度為12％(W/V)、(NH4)2SO4的濃度為15％(W/V)、pH值為7.0、攪拌萃取時間為30min、萃取體系中初始蛋白濃度為15mg/mL。此時蛋白質分配系數Kp達到0.28，Ke達24。
抑肽酶的親和雙水相萃取工藝取新鮮牛肺20Kg，經過硫酸酸解后(pH1.5)，進行板框過濾，濾液調整pH值為7.5后成為抑肽酶粗提液，用于親和萃取。每次親和萃取體系的的體積定為1L，平均每批產品約萃取50次，每批產品的處理量達到0.2億KIU左右，平均萃取能力為40萬KIU/次。親和萃取后含抑肽酶的上相組分經過調整pH值至1.5-2.0后用截留分子量為10KD的超濾膜進行超濾后的濾出液過3KD的超濾膜進行超濾脫鹽和濃縮。截留液重新用于親和萃取的萃取劑。將上述中獲得的濃縮液進行冷凍干燥獲得高純度抑肽酶精品。
權利要求
1.一種從牛肺中直接提取純化抑肽酶的方法，其特征是它包括親和雙水相萃取劑的制備、親和雙水相萃取體系的建立和純化抑肽酶的親和雙水相萃取工藝，具體步驟工藝如下(1)將胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上制備親和雙水相萃取劑首先活化甲氧基化的聚乙二醇(MPEG)稱取MPEG 100g和無水碳酸鈉20g，溶于苯500mL中，加入均三氯三嗪1.5g，80℃攪拌回流24小時，離心，將上清液傾入石油醚中，溫度控制在30-60℃中，得活化MPEG2粗品沉淀，抽濾，將粗品用體積比為的1∶1的苯∶丙酮混合液溶解，再用石油醚沉淀，同樣溶解、沉淀，反復5次，抽干，即得到活化的MPEG，然后用活化后MPEG與胰蛋白酶進行偶聯，取活化后的MPEG 3.0g并溶解于0.025mol/L的硼砂緩沖液中，然后加入若干胰蛋白酶，輕緩攪拌，胰蛋白酶∶MPEG的摩爾比為1∶5，pH值7.0，采用20KD的超濾膜進行超濾去掉未偶聯的MPEG；(2)親和雙水相萃取體系的建立將胰蛋白酶-MPEG、硫酸銨溶液和一定量的抑肽酶粗提液加入到燒杯中，雙水相系統的總體積為25mL，磁力攪拌一定時間，調節pH值，在500rpm的轉速下離心15min，分別測定上下相的體積、雙水相中的抑肽酶活性及總蛋白的含量，建立的親和雙水相萃取體系的萃取條件為萃取溫度為20-30℃、萃取體系中萃取劑的濃度為8-16％(W/V)、(NH4)2SO4的濃度為10-20％(W/V)、pH值為6.0-8.0、攪拌萃取時間為30-45min、萃取體系中初始蛋白濃度為5-25mg/mL；(3)純化抑肽酶的親和雙水相萃取工藝取新鮮牛肺20Kg，經過硫酸酸解后，進行板框過濾，濾液調整pH值為7.0-8.0后成為抑肽酶粗提液，用于親和萃取，每次親和萃取體系的的體積定為1L，平均每批產品約萃取50次，每批產品的處理量達到0.2億KIU左右，平均萃取能力為40萬KIU/次，親和萃取后含抑肽酶的上相組分經過調整pH值至1.5-2.0后用截留分子量為10KD的超濾膜進行超濾后的濾出液過3KD的超濾膜進行超濾脫鹽和濃縮，截留液重新用于下一批親和萃取的萃取劑，將從上述操作中獲得的濃縮液進行冷凍干燥獲得高純度抑肽酶精品。
2.根據權利要求1所述的一種直接從牛肺中純化制備高純度抑肽酶的方法，其特征是活化反應中采用的MPEG與均三氧三嗪的摩爾比為2∶1，采用的MPEG分子量為4000-10000。
3.根據權利要求1所述的一種直接從牛肺中純化制備高純度抑肽酶的方法，其特征是采用冷凍干燥的方法保存偶聯好的MPEG-胰蛋白酶親和萃取劑。
全文摘要
一種從牛肺中直接提取純化抑肽酶的方法，它是將胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上，并獲得適當分子量的胰蛋白酶－PEG聚合物，從而建立親和雙水相萃取體系，牛肺經過除雜、切塊、搗碎后用硫酸酸解，然后過濾，濾液經過親和雙水相萃取后，最終的上相經過超濾脫鹽和冷凍干燥后獲得高純度的抑肽酶產品。本發明制得的產品符合英國藥典98版對于抑肽酶產品的要求，即大分子物質不得檢出(分子篩層析)。產品的效價達到6300KIU/mg以上。
文檔編號C12N9/00GK1587394SQ20041006066
公開日2005年3月2日 申請日期2004年7月29日 優先權日2004年7月29日
發明者張萬山, 劉蘭花, 李菊根, 王啟要 申請人:南昌市萬華生化制品有限公司