專利名稱：一種合成百草枯抗原的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種合成百草枯抗原的方法，尤其是提供了應用多克隆抗體術研制的檢測百草枯的直接競爭ELISA試劑盒，同時還公開了其制備方法，屬于酶聯免疫技術領域。
背景技術：
百草枯(paraquat，PQ)，化學名為1，I' - 二甲基_4，4'-聯吡啶陽離子鹽，是一種聯吡啶類滅生性除草劑，廣泛應用于園林除草、非耕地化學除草，能殺滅大部分禾本科及闊葉雜草，綠葉接觸藥液數小時后便開始枯死。藥液接觸土壤后能被土壤膠體迅速、強烈吸附，并完全鈍化而不影響作物根部。 人百草枯急性中毒后肺毛細血管損傷、肺泡性肺水腫，最后是肺纖維化急性爆發性百草枯中毒(> 40ml)患者很快發生多器官衰竭，死亡率高達100% ;中重度中毒(20 40ml)可導致急性腎功能衰竭，重度中毒還可并發肺纖維化及中毒性肝炎，并多于中毒后2 3周死亡；而輕度中毒者(< 20ml)多表現為口腔及胃腸道粘膜灼傷，癥狀有惡心、嘔吐、腹瀉、腸胃，多數可以痊愈。國外早在上世紀70年代就開始對百草枯的檢測方法進行研究，近年來在這方面的研究工作取得了較快的進展。高靈敏度的儀器分析法和快速有效的免疫分析法正逐漸被應用于百草枯的檢測。國內起步較晚，而且對于食品中百草枯的快速檢測未受到足夠的重視。國內起步較晚，而且對于百草枯的快速檢測未受到足夠的重視。目前已有的測定方法可概括為三類活生物體分析法、儀器分析法、免疫化學分析法。生物體分析法是從自然界篩選對生長環境中有毒化合物敏感的物種，作為環境監測的工具。Rioboo等用淡水微藻C. Moewusii和C. Vulgaris檢測水中百草枯和乙丙隆。最低檢測濃度定為使生長率降低50% 的濃度(EC50)，百草枯對 C. Moewusii 的 EC50 為 O. 28 μ mol/L,乙丙隆對 C. Vulgaris的EC50為O. 15ymol/L0用于測試的生物一般生活周期短，容易操作，檢測成本低。可考慮作為一種在基層應用的大面積生態環境監測手段。Khan SU利用氣相色譜(GC)檢測萵苣、蘿卜和洋蔥中的百草枯，用5M H2S04提取樣品中的PQ并對提取物催化加氫，然后進行氧化鋁柱純化后進行GC檢測。加標O. 5、O. I和O. 05ppm時，回收率在75 86 %，絕對誤差最高為4%，最低檢出限在O. 05ppm左右。液相色譜適用于檢測熱穩定性差，極性強、分子量大、不易揮發的化合物及離子型化合物。百草枯是一種極性很強的離子型化合物，比較適合用HPLC進行分析。自20世紀80年代以來，液相色譜法占據了主導地位，并與質譜聯用，廣泛應用于水體、人血漿和血清等生物檢材中百草枯的檢測。有學者直接采用紫外分光光度法進行測定，檢出限為O. 01 μ g/mL,回收率為90. 0% 102. 4%，操作簡便快速，適合于臨床上肝中百草枯濃度的測定。Masafumi Tomita利用毛細管電泳同時檢測血清中的對草快(PQ)和敵草快(DQ)，檢測靈敏度為O. 05 μ g/mL。此后十多年，許多國外學者將毛細管電泳用于血清、水等樣品中百草枯的檢測。由于百草枯的沸點比較高，極性強，需要對樣品進行特殊的衍生或裂解處理后才能進行檢測，操作比較復雜，用氣相色譜分析比較困難。因此，利用GC進行檢測的報道較少。薄層層析法可利用特殊的顯色劑觀察斑點顏色和利用Rf值來定性，其測定準確性較差，檢測靈敏度不高，因此只能用于半定量分析。免疫分析是以抗原與抗體的特異性結合為基礎，其原理是利用生物分子識別，靈敏度高，特異性強，故在臨床醫學上有極其重要的地位。酶聯免疫法(Enzyme Immunoassay,EIA)是將抗原、抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來的一種免疫分析方法。酶免疫法的檢測原理與放射免疫法類似，通過測定結合于固相的酶的活力來測定被測定物的量。用作標記物的酶有辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)。酶標試劑制備容易、穩定、價廉。酶免疫分析的靈敏度接近放射免疫技術，而可借助于簡單的儀器作定量測定，是目前農藥監測中應用最廣泛的免疫分析技術。本發明的百草枯的ELISA檢測試劑盒避免了現有檢測手段存在的問題，相比較其他的檢測手段，建立的百草枯ELISA試劑盒檢測方法具有特異性強、敏感度高、檢測周期短、操作簡單方便，可大量生產等的特點。
發明內容
本發明公開一種合成百草枯抗原的方法，可用于制備多克隆抗體。本發明還提供了應用多克隆抗體檢測百草枯的直接競爭ELISA檢測試劑盒的制備方法，適合工廠化生產。本發明公開的人工合成百草枯抗原是通過以下方法得到的免疫抗原PQ-h-BSA的制備43mgBSA溶于3ml水中，用0. IM的NaOH調pH至9. O。9mgN-甲基-N'-戊酸基-二吡啶陽離子化合物(PQ-h)溶于500 U I 二噁烷中，進行超聲處理。加入無水三正丁胺^^匕將此混合物在口^冰浴中冷卻’并攪拌^!^!!。加入重蒸的氯甲酸異丁酯8iU，15°C以下攪拌30min。將攪拌后的PQ_h溶液逐滴加入到溶解的蛋白中，并于4°C輕微攪拌4h，整個過程維持pH在9. O。然后，將混合物于4°C在0. IM的PBS中透析72h，每隔6h換透析液一次。冷凍干燥后于-20°C保存。包被抗原PQ-h-OVA的制備28mg OVA溶于3ml水中，用0. IM的NaOH調pH至9. O。9mgN-甲基-N'-戊酸基-二吡啶陽離子化合物(PQ-h)溶于500 U I 二噁烷中，進行超聲處理。加入無水三正丁胺15 u I，將此混合物在12°C冰浴中冷卻，并攪拌15min。加入重蒸的氯甲酸異丁酯8 yl，15°C以下攪拌30min。將攪拌后的PQ_h溶液逐滴加入到溶解的OVA中，并于4°C輕微攪拌4h，整個過程維持pH在9. O。然后，將混合物于4°C在0. IM的PBS中透析72h，每隔6h換透析液一次。冷凍干燥后于-20°C保存。N-甲基-N'-戊酸基-二吡啶陽離子化合物(PQ-h)的合成方法4，4-聯吡啶和碘甲烷(CH3I)以摩爾比1.05 I在無水丙酮中反應，4°C，磁力攪拌，于密閉三頸圓底燒瓶通氮氣保護下在暗處反應。反應混合物完全加入后，低溫(4V左右)攪拌過夜。過濾，用無水丙酮洗滌，抽干，得產品N-甲基-二吡啶陽離子化合物(MQ)，真空干燥，得黃色針狀結晶，然后存放于真空干燥器中。將得到的MQ和5-溴戊酸乙酯以摩爾比I : 2混合，120°C油浴，磁力攪拌，在新鮮蒸餾的無水二甲基甲酰胺(DMF)中回流5h，然后室溫放置過夜。抽濾，用無水DMF洗滌，真空干燥，得黃色片狀結晶N-甲基-N'-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物，存放于真空干燥器中。將得到的N-甲基-N'-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物與適量濃HCl混合，加熱回流3h左右。在旋轉蒸發器上蒸去過量的酸和水，保持水浴溫度不超過60°C，蒸干，得固體殘留物。冷卻后，加入少量丙酮結晶(析出白色晶體)，過濾，抽干，真空干燥，得粗品，再經95 %乙醇重結晶，真空干燥，得到高純度N-甲基-N'-戊酸基-二吡啶陽離子化合物。
本發明還提供了一種ELISA檢測試劑盒，具體而言其組成如下百草枯酶標物、百草枯標準液、包被百草枯多克隆抗體的酶標板、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標物稀釋液及樣品稀釋液等。所述多克隆抗體為以百草枯為半抗原，通過上訴方法合成全抗原，并通過新西蘭大白兔免疫制備，具體方法如下I、抗血清制備免疫前一周從耳緣靜脈采血作陰性對照。稱取Img PQ-h-BSA,用5mL O. lmol/L的PBS (經高壓滅菌)溶解，然后取O. 5mL溶解的抗原與O. 5mL完全福氏佐劑充分混合，乳化后供首次免疫用。初次免疫在新西蘭大白兔背部進行多點皮下注射，ImL/只。一個月后進行第一次加強免疫，采用四肢內部肌肉注射，劑量與首次免疫相同，與等量不完全福氏佐劑混合充分乳化。共加強免疫4次，每次間隔2周。最后2次加強免疫前從兔耳靜脈采血，采用間接ELISA法測定抗血清的效價。效價合格后，兔頸動脈放血，將采集的血液于室溫下靜置，待血液凝集后放入37°C保溫箱靜置lh，4°C靜置過夜后，4°C、3000rpm離心20min后，得上清液即為抗血清。每只兔子的血清量大約在35mL。2、抗血清純化采用飽和硫酸銨二步沉淀法純化抗體。I)取IOmL血清于50mL離心管中，加IOmL pH 7. OPBS,于冰上輕輕振蕩下逐滴加入4°C預冷的飽和硫酸銨20mL，于4°C冰箱中靜置過夜，此時硫酸銨的終濃度為50%。2)于4°C 4000r/min離心25min，棄上清，以6mL pH 7. OPBS溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨4mL，4°C靜置lh，此時硫酸銨的終飽和度為40%。3)重復步驟2)離心，用6. 7mLpH 7. OPBS溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨3. 3mL,4°C靜置lh，此時硫酸銨的終飽和度為33%。4)重復步驟2)離心，沉淀用6mL PBS溶解，裝入透析袋中。5)于4°C冰箱中，對20倍以上的PBS透析，期間換液數次，直至用萘氏試劑檢測透析液無黃色為止。6)將透析好的溶液冷凍干燥后分裝，于_20°C保存備用。3、間接競爭標準曲線的制作I)取酶標板，以最佳包被濃度的PQ-h-OVA稀釋液進行包被，100 μ L/孔，4°C冰箱保存過夜。2)洗液洗滌I次，每次2min，拍干。3)以含 3% BSA-PBS 溶液封閉，200 μ L/ 孔，37°C溫育 I. 5h。4)洗液洗滌3次，每次lmin，拍干。5)力卩 A Ong/mL,O. 001ng/mL,0. 01ng/mL,0. Ing/mL,0. 5ng/mL,Ing/mL,2. 5ng/mL,5ng/mL, I Ong/mL, 20ng/mL, 50ng/mL, lOOng/mL 的 PQ 標準品，50 μ L/ 孔；再加入最佳稀釋度的抗體，50 μ L/孔，不設置平行，37°C溫育lh。6)洗液洗滌3次，每次3min，拍干。
7)加入I : 5000稀釋的酶標二抗(羊抗兔IgG_HRP)，100iiL/孔，37°C溫育0. 5h。8)洗漆后拍干,加入顯色液，100 V- L/孔,暗處反應15min。9)加終止液(2mol L-1 硫酸)，50 ii L/ 孔。10)酶標儀上測定450nm吸光值。以B/B0為縱坐標，以100倍的標準溶液濃度的對數值為橫坐標在EXCEL上作圖，即得PQ的競爭標準曲線。對標準曲線的范圍進行截取，并擬合標準曲線方程。 所述百草枯酶標物辣根過氧化酶；底物顯色液:A液(0. lmol/L檸檬酸水溶液)檸檬酸 21. Olg，雙蒸水定容至 IOOOmL ；B 液(0. 2mol/LNa2HP04) :71. 6g Na2HP04 12H20,雙蒸水溶解后，定容至IOOOmL,保存備用。使用時，24. 3mLA液與25. 7mLB液混合，加入50mL雙蒸水及30% H20218. 3u L ;洗滌液含0. 05% Tween-20的PBS溶液；終止液2mol L-I的 H2S04 溶液；抗原稀釋液0. 05M、pH9. 6 的 Na2C03_NaHC03 緩沖液(CBS) :0. 315g Na2C03,0. 588g NaHC03，加100ml超純水溶解；抗體稀釋液0. 01mol/L、pH7. 4磷酸鹽緩沖液(PBS，含 1%BSA) 3. Og Na2HP04. 12H20,0. 25g NaH2P04 *2H20,8. 7g NaCl, IOg BSA，1L超純水。另一方面，本發明還提供了檢測樣品中百草枯含量的方法，步驟如下(I)樣品前處理(2)用權利要求2所述的ELISA檢測試劑盒檢測，向包被百草枯多克隆的酶標板孔加入標準品或樣品溶液，加入百草枯酶標物，孵育30分鐘，洗滌液洗滌，加入顯色液孵育20分鐘，終止液終止反應，用酶標儀測定吸光度值。(3)分析檢測結果本發明人工合成百草枯完全抗原的原理為以4，4’ -聯吡啶和碘甲烷為起始原料，通氮氣保護下于暗處經三步反應合成了百草枯半抗原；混合酸酐法偶聯大分子蛋白載體牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)制備免疫抗原和包被抗原。本發明試劑盒的檢測原理為將抗百草枯的多克隆抗體包被與固相載體上，加入樣本或百草枯標準品溶液并加A百草枯酶標物，待檢樣品中的百草枯與百草枯酶標物競爭包被于固相載體上的多克隆抗體，通過洗滌除去未結合的百草枯酶標物，加入顯色液顯色后終止反應，檢測樣品吸光度值，該值與樣品中百草枯的量呈負相關，與標準曲線比較即可測定樣品中百草枯的濃度。本發明的積極效果在于本發明公開一種新的合成百草枯抗原的方法，為制備單克隆抗體或多克隆抗體奠定了基礎；并首次應用多克隆抗體建立了一種檢測百草枯的直接競爭ELISA試劑盒，可定性或定量分析樣品中的百草枯，適合工廠化生產。本發明的試劑盒縮短了檢測時間，對樣品的前處理要求低，處理過程簡單，并配備了相關的樣品處理試劑，能夠同時迅速檢測大批樣品。本發明的試劑盒所有試劑均為配置好的工作液，可以直接操作無需處理，減少了操作步驟，可以快速，靈敏檢測大豆中的百草枯，避免了復雜的操作，對設備要求低，可以適應多種檢測環境，以及多種檢測需要；并且本發明的試劑盒樣本用量小，試劑保存時間長，自動化程度高，對操作者無毒性，對環境無污染等；因此本發明應用多克隆抗體建立的ELISA檢測試劑盒具有重大的社會意義和廣闊的市場前景。
圖I百草枯抑制曲線圖2百草枯的分子結構式
具體實施例方式實施例I制備百草枯抗原I、百草枯半抗原的合成百草枯的分子結構式如圖2，本實驗以4，4’-聯吡啶和碘甲烷為起始原料，合成了N-甲基-N'-戊酸基-二吡啶二溴化物(簡稱PQ-h)，用于制備百草枯的人工抗原。其合成 反應分三步完成。I) N-甲基-二卩比唳陽離子化合物-Monoquat (MQ)的合成4，4-聯吡啶和碘甲烷(CH3I)以摩爾比1.05 I在無水丙酮中反應，4°C，磁力攪拌，于密閉三頸圓底燒瓶通氮氣保護下在暗處反應。反應混合物完全加入后，低溫(4V左右)攪拌過夜。過濾，用無水丙酮洗滌，抽干，得產品MQ，真空干燥，得黃色針狀結晶，然后存放于真空干燥器中。經計算產物得率約為86%。2) N-甲基-N'-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物的合成第一步反應得到的MQ和5-溴戊酸乙酯以摩爾比I : 2混合，120°C油浴，磁力攪拌，在新鮮蒸餾的無水二甲基甲酰胺(DMF)中回流5h，然后室溫放置過夜。抽濾，用無水DMF洗滌，真空干燥，得黃色片狀結晶，存放于真空干燥器中。經計算得率為57%。3) N-甲基-N'-戊酸基-二吡啶陽離子化合物(PQ-h)的合成將第二步得到的N-甲基-N'-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物與適量濃HCl混合，加熱回流3h左右。在旋轉蒸發器上蒸去過量的酸和水，保持水浴溫度不超過60°C，蒸干，得固體殘留物。冷卻后，加入少量丙酮結晶(析出白色晶體)，過濾，抽干，真空干燥，得粗品，再經95 %乙醇重結晶，真空干燥。經計算得率為69 %。2、半抗原-蛋白質連接物的制備——混合酸酐法l)9mgPQ_h溶于500 μ I 二噁烷中，進行超聲處理。加入無水三正丁胺15 μ 1，將此混合物在12°C冰浴中冷卻，并攪拌15min。加入重蒸的氯甲酸異丁酯8 μ 1，15°C以下攪拌30mino2) 43mg BSA溶于3ml水中，用O. IM的NaOH調pH至9. O。將上述PQ_h溶液逐滴加入到溶解的蛋白中，并于4°C輕微攪拌4h，整個過程維持pH在9. O。然后，將混合物于4°C在O. IM的PBS中透析72h,每隔6h換透析液一次。冷凍干燥后于_20°C保存。用同樣的方法合成包被抗原PQ-h-OVA。實施例2百草枯特異性多克隆抗體的制備用實施例I方法制備的抗原作為免疫原，取雄性新西蘭大白兔2只，健康，體重
I.5 2kg。免疫前一周從耳緣靜脈采血作陰性對照。稱取Img PQ-h-BSA，用5mL O. ImoI/L的PBS (經高壓滅菌)溶解，然后取O. 5mL溶解的抗原與O. 5mL完全福氏佐劑充分混合，乳化后供首次免疫用。初次免疫在新西蘭大白兔背部進行多點皮下注射，ImL/只。一個月后進行第一次加強免疫，采用四肢內部肌肉注射，劑量與首次免疫相同，與等量不完全福氏佐劑混合充分乳化。共加強免疫4次，每次間隔2周。具體免疫程序見表I。最后2次加強免疫前從兔耳靜脈采血，采用間接ELISA法測定抗血清的效價。效價合格后，兔頸動脈放血，將采集的血液于室溫下靜置，待血液凝集后放入37°C保溫箱靜置lh，4°C靜置過夜后，4°C、3000rpm離心20min后，得上清液即為抗血清。每只兔子的血清量大約在35mL。表I實驗動物免疫程序
權利要求
1.一種合成百草枯抗原的方法，其特征在于，以百草枯為半抗原，以4，4’_聯吡啶和碘甲烷為起始原料，首先合成N-甲基-N'-戊酸基-二吡啶二溴化物，用于制備百草枯的人工抗原。
2.權利要求I所述方法，其特征在于，具體方法如下 1)4，4_聯吡啶和碘甲烷以摩爾比1.05 I在無水丙酮中反應，4°C，磁力攪拌，于密閉三頸圓底燒瓶通氮氣保護下在暗處反應；反應混合物完全加入后，低溫攪拌過夜；過濾，用無水丙酮洗滌，抽干，得產品N-甲基-二吡啶陽離子化合物，真空干燥，得黃色針狀結晶，然后存放于真空干燥器中；將得到的N-甲基-二吡啶陽離子化合物和5-溴戊酸乙酯以摩爾比I : 2混合，120°C油浴，磁力攪拌，在新鮮蒸餾的無水二甲基甲酰胺中回流5h，然后室溫放置過夜；抽濾，用無水DMF洗滌，真空干燥，得黃色片狀結晶N-甲基-N'-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物，存放于真空干燥器中；將得到的N-甲基-N'-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物與適量濃HCl混合，加熱回流3h ;在旋轉蒸發器上蒸去過量的酸和水，保持水浴溫度不超過60°C，蒸干，得固體殘留物；冷卻后，加入少量丙酮結晶，過濾，抽干，真空干燥，得粗品，再經95%乙醇重結晶，真空干燥，得到高純度N-甲基-N'-戊酸基-二吡啶陽離子化合物； 2)43mg BSA溶于3ml水中，用O. IM的NaOH調pH至9. O ；9mg N-甲基-N '-戊酸基-二吡啶陽離子化合物溶于500 μ I 二噁烷中，進行超聲處理；加入無水三正丁胺15 μ 1，將此混合物在12°C冰浴中冷卻，并攪拌15min ;加入重蒸的氯甲酸異丁酯8 μ 1，15°C以下攪拌30min ;將攪拌后的N-甲基-N'-戊酸基-二吡啶陽離子化合物溶液逐滴加入到溶解的BSA蛋白中，并于4°C輕微攪拌4h，整個過程維持pH在9. O ;將混合物于4°C在O. IM的PBS中透析72h，每隔6h換透析液一次，冷凍干燥后于_20°C保存，獲得PQ-h-BSA免疫抗原。
3)28mg OVA溶于3ml水中，用O. IM的NaOH調pH至9. O ；9mg N-甲基-N '-戊酸基-二吡啶陽離子化合物溶于500 μ I 二噁烷中，進行超聲處理；加入無水三正丁胺15 μ 1，將此混合物在12°C冰浴中冷卻，并攪拌15min ;加入重蒸的氯甲酸異丁酯8 μ 1，15°C以下攪拌30min ;將攪拌后的N-甲基-N'-戊酸基-二吡啶陽離子化合物溶液逐滴加入到溶解的OVA中，并于4°C輕微攪拌4h，整個過程維持pH在9. O ;將混合物于4°C在O. IM的PBS中透析72h，每隔6h換透析液一次，冷凍干燥后于_20°C保存，獲得PQ-h-OVA免疫抗原。
3.一種應用權利要求I所述方法制備的ELISA試劑盒，其特征在于，組成如下百草枯酶標物、百草枯標準液、包被百草枯多克隆抗體的酶標板、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標物稀釋液和樣品稀釋液。
4.權利要求3所述試劑盒，其特征在于，構建方法如下 一)通過新西蘭大白兔免疫制備抗體血清，稱取ImgPQ-h-BSA，用5mL O. lmol/L的PBS溶解，然后取O. 5mL溶解的抗原與O. 5mL完全福氏佐劑充分混合，對新西蘭大白兔進行注射，采用間接ELISA法測定抗血清的效價，效價合格后，兔頸動脈放血，將采集的血液于室溫下靜置，待血液凝集后放入37 °C保溫箱靜置Ih，4°C靜置過夜后，4°C、3000rpm離心20min后，得上清液即為抗體血清； 二)采用飽和硫酸銨二步沉淀法純化抗體 I)取IOmL血清于50mL離心管中，加IOmL pH 7. 0PBS，于冰上輕輕振蕩下逐滴加入4°C預冷的飽和硫酸銨20mL，于4°C冰箱中靜置過夜，此時硫酸銨的終濃度為50% ；2)于4°C4000r/min離心25min，棄上清，以6mL pH 7. OPBS溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨4mL，4°C靜置lh，此時硫酸銨的終飽和度為40% ； 3)重復步驟2)離心，用6.7mL pH 7. OPBS溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨3. 3mL，4°C靜置lh，此時硫酸銨的終飽和度為33% ； 4)重復步驟2)離心，沉淀用6mLPBS溶解，裝入透析袋中； 5)于4°C冰箱中 ，對20倍以上的PBS透析，期間換液數次，直至用萘氏試劑檢測透析液無黃色為止； 6)將透析好的溶液冷凍干燥后分裝，于_20°C保存備用。
三)間接競爭標準曲線的制作 1)取酶標板，以最佳包被濃度的PQ-h-OVA稀釋液進行包被，100u L/孔，4°C冰箱保存過夜； 2)洗液洗滌I次，每次2min，拍干； 3)以含3% BSA-PBS 溶液封閉，200 u L/ 孔，37°C溫育 I. 5h ； 4)洗液洗滌3次，每次lmin，拍干；5)力口A Ong/mL,0. OOlng/mL,0. Olng/mL,0. Ing/mL,0. 5ng/mL,Ing/mL,2. 5ng/mL,5ng/mL, I Ong/mL, 20ng/mL, 50ng/mL, lOOng/mL的PQ標準品，50 u L/孔；再加入最佳稀釋度的抗體，50 u L/孔，不設置平行，37°C溫育Ih ； 6)洗液洗滌3次，每次3min，拍干； 7)加入I 5000稀釋的酶標二抗(羊抗兔IgG-HRP)，100 u L/孔，37°C溫育0. 5h ； 8)洗漆后拍干，加入顯色液，100u L/孔,暗處反應15min ； 9)加終止液(2mol L-I硫酸)，50 ii L/孔; 10)酶標儀上測定450nm吸光值，以B/B0為縱坐標，以100倍的標準溶液濃度的對數值為橫坐標在EXCEL上作圖，即得PQ的競爭標準曲線，對標準曲線的范圍進行截取，并擬合標準曲線方程。
5.權利要求3所述ELISA試劑盒的檢測方法，包括以下步驟 1)大豆樣品前處理將大豆樣品用粉碎機粉碎，分別稱取4.Og粉碎試樣,置于15ml離心管中，分別加入50ng/mL、500ng/mL、2000ng/mL百草枯標準品及標準品稀釋液各4. Oml,每個濃度平行做3次,使樣品中百草枯濃度分別為0. 05mg/kg、0. 5mg/kg、2mg/kg和0mg/kg,混合均勻，超聲波提取20min,然后于離心15min,取上清液,用于ELISA試劑盒檢測； 2)用權利要求2所述的ELISA試劑盒檢測，向包被百草枯多抗的酶標板孔中加入標準品或樣品溶液，加入百草枯酶標物，孵育30分鐘，洗滌液洗滌，加入顯色液孵育20分鐘，終止液終止反應，用酶標儀測定吸光度值； 3)分析檢測結果測得的吸光度與樣品中的百草枯含量成反比，可通過標準曲線計算百草枯的含量。
全文摘要
本發明建立了一種合成百草枯抗原的方法和應用多克隆抗體檢測百草枯的直接競爭ELISA試劑盒的構建方法。試劑盒的組成包括百草枯酶標物、百草枯標準液、包被百草枯多克隆抗體的酶標板、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標物稀釋液及樣品稀釋液等。本發明建立了人工合成百草枯抗原的方法，以BSA為載體制備多克隆抗體；應用多克隆抗體制備的ELISA試劑盒，具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度較高、特異性強和價格低廉等諸多優點，適合工廠化生產，可對大豆等農產品中百草枯進行快速檢測。
文檔編號C07K16/06GK102633876SQ20121008139
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月26日 優先權日2012年3月26日
發明者孫秀蘭, 尤繼明, 張弓, 張銀志, 李紅梅, 田秀梅, 紀劍, 鄭佳玉 申請人:江南大學