在重組含油微生物中表達油體鈣蛋白以提高其中的油含量的制作方法
【專利摘要】本發明描述了由于油體鈣蛋白多肽的表達而具有提高的油含量的重組含油微生物。本發明所公開的重組含油微生物產生占其細胞干重至少25%的油，并且包含功能性的多不飽和脂肪酸（PUFA）生物合成途徑和至少一種編碼油體鈣蛋白多肽的遺傳構建體。還描述了提高重組含油微生物中的油的量的方法。
【專利說明】在重組含油微生物中表達油體鈣蛋白以提高其中的油含量[0001]本申請要求2011年5月26日提交的美國臨時申請61/490，337的優先權，該申請全文以引用方式并入本文。【技術領域】[0002]本發明屬于生物【技術領域】。更具體地，本發明涉及由于油體鈣蛋白多肽的表達而能夠產生更多的油的重組含油微生物。【背景技術】
[0003]微生物如絲狀真菌、酵母和藻類產生多種脂質，包括脂肪酰、甘油脂、磷脂、鞘脂、 糖脂、聚酮化合物、留醇脂和孕烯醇酮脂類。通常從微生物中提取的一類脂質是甘油脂，包括脂肪酸甘油酯(“三酰基甘油”或“TAG”)。TAG是主要的脂肪酸儲存單元，因此可含有長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)，以及較短的飽和的及不飽和的脂肪酸與較長鏈的飽和脂肪酸。對在藥物和膳食產品中包括PUFA如二十碳五烯酸[“ΕΡΑ”;ω-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”； ω-3]的興趣一直在持續地增長。有效地并高性價比地產生包含PUFA的脂質組合物的方法因此是尤其期望的。[0004]有多種商品化的PUFA來源。然而，有多種與這些使用天然來源的生產方法相關聯的缺點。第一，天然來源，例如魚和植物，趨于具有高度異質性的油組成。從這些來源獲得的油能夠需要大量地純化，以分離或富集一種或多種所期望的PUFA。魚油通常具有令人不悅的嗅味，其可以是不能被經濟地從所期望的產物分離的，并且能夠導致此類產物不能作為食品補充劑被接受。令人不悅的嗅味能夠使得基于高劑量的攝入的醫療規程不合乎期望， 并阻礙患者的依從性。[0005]魚可積聚環境污染物，并且攝入魚油膠囊作為飲食補充劑可導致攝入不合乎期望的污染物。PUFA的天然來源還受制于可用性的不可控的波動(例如，由于天氣、疾病、或者就魚類資源而言的過度捕撈)。同樣，產生PUFA的作物與被開發用于產生食物的雜交體作物相比往往并不是在經濟上有競爭力的。天然地產生PUFA的一些生物(例如，紫球藻 ^i(J}orphyridium)、^M^M(Jiortierella')')的大規模發酵還能夠是昂貴的和/或難以以商業規模培養。由于這些限制，進行了大量用于開發能夠高效地和以商業規模經濟地產生PUFA的重組含油微生物的工作(例如，美國專利申請公布2005-0136519-A1)。此外， 還報道了在重組含油微生物中用以允許所期望的PUFA的產生的脂肪酸生物合成途徑的修飾(例如，美國專利申請公布 2006-0110806-A1、2006-0115881-Al、2009-0093543-A1、和 2010-0317072-A1)。然而，仍然存在對具有相對于目前已知的菌株的油提高的油含量的重組含油微生物的需求。[0006]美國專利7，256，014公開了至少一種植物油質蛋白基因在被工程化以產生疏水的/親脂的化合物(例如類胡蘿卜素)的微生物細胞中的表達，顯著提高了該化合物的總體滴度。[0007]Froissard等人(/--? Yeast Res.9:428-438, 2009)公開了用編碼油體鈣蛋白多肽(擬南芥iAa7ia/?a)油體鈣蛋白l，AtClol)的異源性基因轉化的非含油酵母啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae ),表現出脂質體數量和大小的提高并且比親本菌株積聚了更多的脂肪酸。
[0008]然而，沒有用編碼油體鈣蛋白多肽的基因轉化重組含油微生物來提高此類重組微生物細胞的油含量的報道。
【發明內容】
[0009]在第一實施例中，本發明提供了重組含油微生物，該重組含油微生物產生占其細胞干重至少25%的油，并且該重 組含油微生物包含功能性的多不飽和脂肪酸生物合成途徑和至少一種編碼油體鈣蛋白多肽的遺傳構建體。在與由相應對照產生的油的量相比時，該實施例的重組含油微生物產生更大量的油，所述油包含至少一種多不飽和脂肪酸。
[0010]在第二實施例中，所述重組含油微生物可以是酵母、真菌、或藻類。在第三實施例中，所述重組含油微生物可以是解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)。
[0011]在第四實施例中，在由所述重組含油微生物產生的油中包含的多不飽和脂肪酸可以是ω-3多不飽和脂肪酸或ω-6多不飽和脂肪酸。在第五實施例中，所述ω-3多不飽和脂肪酸是二十碳五烯酸(ΕΡΑ)。
[0012]在第六實施例中，由遺傳構建體編碼的油體鈣蛋白多肽具有的氨基酸序列基于Clustal W 比對方法與 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、38、40、42、或 51 具有至少 90% 的同一性。該實施例的油體鈣蛋白多肽具有油體鈣蛋白功能。
[0013]在第七實施例中，將由遺傳構建體編碼的油體鈣蛋白多肽連接到催化二酰基甘油酰化的酶。在第八實施例中，催化二酰基甘油酰化的酶是磷脂:二酰基甘油酰基轉移酶(PDAT)。
[0014]在第九實施例中，相對于所述油體鈣蛋白多肽的野生型氨基酸序列，所述油體鈣蛋白多肽包含添加的半胱氨酸殘基。所述添加的半胱氨酸殘基能夠散布在所述油體鈣蛋白多肽的N末端和C末端區域內。
[0015]在第十實施例中，本發明提供了提高重組含油微生物中包含的油的量的方法，所述方法包括以下步驟:
a)提供本發明的重組含油微生物；
b)使步驟(a)的重組含油微生物在其中產生油的條件下生長，所述油包含至少一種多不飽和脂肪酸；以及
c)任選地,回收步驟(b)的油。
[0016]在所述方法的一個方面，所述重組含油微生物可以是酵母、真菌、或藻類。在另一方面，所述重組含油微生物可以是解脂耶氏酵母。
[0017]在所述方法的另一方面，在由所述重組含油微生物產生的油中包含的多不飽和脂肪酸可以是ω-3多不飽和脂肪酸或ω-6多不飽和脂肪酸。在另一方面，所述ω-3多不飽和脂肪酸是二十碳五烯酸(ΕΡΑ)。
[0018]在所述方法的又一個方面，由遺傳構建體編碼的油體鈣蛋白多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal W 比對方法與 SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、38、40、42、或51 具有至少 90%的同一性。該方面的油體鈣蛋白多肽具有油體鈣蛋白功能。[0019]【專利附圖】
【附圖說明】和序列表圖1是PYRH55的質粒圖譜，其被描述于本文的實例I中。[0020]圖2顯示了 AtClols和cys-AtClols的氨基酸序列之間的比對。添加至AtClols 以產生cys-AtClols的半胱氨酸殘基帶有下劃線。[0021]表14
【權利要求】
1.重組含油微生物,所述重組含油微生物產生占其細胞干重至少25%的油，其中所述重組含油微生物包含功能性的多不飽和脂肪酸生物合成途徑和至少一種編碼油體鈣蛋白多肽的遺傳構建體； 進一步地，其中在與由相應對照產生的油的量相比時，所述重組含油微生物產生更大量的油，所述油包含至少一種多不飽和脂肪酸。
2.根據權利要求1所述的重組含油微生物，其中所述微生物選自酵母、真菌、和藻類。
3.根據權利要求1所述的重組含油微生物，其中所述微生物是解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica )。
4.根據權利要求1所述的重組含油微生物， 其中所述多不飽和脂肪酸選自ω-3多不飽和脂肪酸和ω-6多不飽和脂肪酸。
5.根據權利要求4所述的重組含油微生物，其中所述ω-3多不飽和脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)。
6.根據權利要求1所述的重組含油微生物，其中所述油體鈣蛋白多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal W 比對方法與選自 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、38、40、42 和 51 的氨基酸序列具有至少90%的同一性，其中所述油體鈣蛋白多肽具有油體鈣蛋白功能。
7.根據權利要求1所述的重組含油微生物，其中將所述油體鈣蛋白多肽連接到催化二酰基甘油酰化的酶。
8.根據權利要求7所述的重組含油微生物，其中所述酶是磷脂:二酰基甘油酰基轉移BI(PDAT)0
9.根據權利要求1所述的重組含油微生物，其中相對于所述油體鈣蛋白多肽的野生型氨基酸序列，所述油體鈣蛋白多肽包含添加的半胱氨酸殘基，其中所述添加的半胱氨酸殘基散布在所述油體鈣蛋白多肽的N末端和C末端區域內。
10.提高重組含油微生物中包含的油的量的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供根據權利要求1所述的重組含油微生物； b)使步驟(a)的重組含油微生物在其中產生油的條件下生長，所述油包含至少一種多不飽和脂肪酸；以及 c)任選地，回收步驟(b)的油。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述重組含油微生物選自酵母、真菌、和藻類。
12.根據權利要求10所述的方法，其中所述微生物是解脂耶氏酵母。
13.根據權利要求10所述的方法，其中所述多不飽和脂肪酸選自ω-3多不飽和脂肪酸和ω-6多不飽和脂肪酸。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述ω-3多不飽和脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)0
15.根據權利要求10所述的方法，其中所述油體鈣蛋白多肽具有的氨基酸序列基于Clustal W 比對方法與選自 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 和32的氨基酸序列具有至少90%的同一性，其中所述油體鈣蛋白多肽具有油體鈣蛋白功能。
【文檔編號】C07K14/37GK103562217SQ201280025445
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年5月23日 優先權日:2011年5月26日
【發明者】S-P.洪, Q.Q.朱 申請人:納幕爾杜邦公司