一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法
【專利摘要】本發明提出了一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，屬于生物與化學工藝【技術領域】。在原料的選取上，本發明所選用的雨生紅球藻是經過雨生紅球藻細胞異樣生長、高密度藻細胞稀釋和光誘導三個階段完成的，利用超高壓提取技術對藻體進行破壁處理，然后再經過萃取、洗脫、濃縮、皂化、離心、等步驟得到蝦青素。該工藝有機溶劑消耗少，萃取劑可以循環利用，環境污染小、生產成本低，回收率高，雜質少，降低了蝦青素氧化降解可能性，提高了蝦青素的提取質量。
【專利說明】—種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蝦青素的提取方法，具體涉及一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，屬于生物與化學工藝【技術領域】。
【背景技術】
[0002]蝦青素屬于類胡蘿卜素，呈鮮紅色，是一種優質色素和超級抗氧化劑，一種具有鄰羥基酮結構的類胡蘿卜素，其化學名稱為3，3-二羥基-4，4-二酮基-β，β '-胡蘿卜素，純蝦青素是暗紅棕色晶體，熔點224°C，不溶于水，能溶于大多數有機溶劑。蝦青素具有超強的抗氧化性和清除自由基的能力，臨床及動物學實驗表明蝦青素具有良好的抗炎、抗腫瘤、抗衰老、保護皮膚、增強機體免疫、預防心血管疾病、維護眼睛健康、提高動物的繁殖力等多方面重要的生物學功能。除此之外，蝦青素還具有顯著的著色性能，目前主要作為水產品、禽蛋、觀賞動物養殖和畜牧產品的著色劑。因此蝦青素在食品、醫藥、化妝品、保健品和飼料等行業具有非常大的應用潛力，市場前景廣闊。
[0003]雨生紅球藻中蝦青素含量高，是蝦青素的最佳生物來源。它是一種單細胞生物，其厚壁孢子堅韌的細胞壁影響蝦青素提取，細胞壁不但阻礙提取溶劑向細胞內滲透，也影響細胞內蝦青素向細胞外擴散。因此，通常先對紅球藻細胞進行機械破壁，然后再用溶劑提取。目前，各種機械破壁方法中破壁率較高并可實現工業化生產的是高壓均質法，但高壓均質機磨損較快，使生產成本明顯增加。我國天然蝦青素的生產目前還處于初級階段，大量工作主要集中在實驗室研究水平。國內蝦青素粉(蝦青素含量為2~3%)的市場價格為3500元/公斤。因此蝦青素的生產具有很大的市場潛力。超高壓提取技術利用IOOMPa以上的流體靜壓力作用于料液上 ，保壓一定時間，然后迅速卸壓，可進行分離純化，達到提取目的。
[0004]CN102659652A公開了一種從雨生紅球藻中提取總蝦青素的固相萃取方法，該方法沒有經過物料溶劑預處理，以少量有機溶媒為中介，將物料中的蝦青素萃取到固體萃取劑上，通過固相萃取一步即可從含蝦青素的物料中獲得蝦青素油。
【發明內容】
[0005]為解決現有技術中存在的問題，本發明提出了一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，該方法采用高壓技術對雨生紅球藻進行破壁，提高了蝦青素的提取質量。
[0006]本發明的技術方案包括:
[0007]一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，所述方法包括以下步驟:
[0008]a藻體破壁:稱取一定量的藻體，向所述藻體中加入一定量的大豆油，所述藻體和大豆油的重量體積比為l:10g/mL，以345mL/min流量泵入高壓容器內，在壓力為100~300Mpa、溫度為4°C下進行破壁處理，將破壁液離心分離，得到蝦青素提取液及藻渣；
[0009]b萃取:將步驟a中的蝦青素提取液及藻渣與硅膠以重量比2~4:1混合均勻，然后加入乙醇和乙酸乙酯，所述乙醇和乙酸乙酯的加入量按照每IOg雨生紅球藻粉加入5~IOmL乙醇和15~20mL的乙酸乙酯來進行計算，將所述蝦青素提取液及藻渣、硅膠、乙醇和乙酸乙酯混合攪拌萃取I~3h后，將萃取混合物裝入層析柱中；
[0010]C洗脫:用乙醇洗脫，收集紅色流出液部分；
[0011]d濃縮:將所述紅色流出液減壓蒸餾，得到暗紅色蝦青素油狀液體。
[0012]上述的蝦青素油狀液體按照如下步驟精提:
[0013]e皂化:將蝦青素油狀液體與0.06mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液按體積比2~8: 1混合為皂化液，4~12°C，氮氣保護條件下，避光皂化2-4h ；
[0014]f離心:在步驟e皂化液中加入去離子蒸餾水，至紅色絮狀沉淀產生，離心得到蝦
青素沉淀。
[0015]上述的蝦青素沉淀按照如下步驟獲得結晶產品:
[0016]g純化:將蝦青素沉淀通氮氣吹干，用石油醚溶解，再通過硅膠柱層析純化，用正己烷與丙酮按體積比5:2混合作為洗脫液洗脫，收集紅色流出液；
[0017]h結晶:在步驟g紅色流出液中加入等體積去離子水混勻，置于-10°C~_6°C，育晶18~24h，4000轉/min離心，用去離子水洗滌沉淀兩次，收集晶體，氮氣吹干，獲得結晶產品。[0018]進一步的，上述的步驟b中的乙醇和乙酸乙酯可以用大豆油、氫氧化鉀-乙醇溶液、石油醚、正己烷、丙酮中的一種或幾種的混合物來代替。
[0019]上述的雨生紅球藻的培養包括三個階段:培養雨生紅球藻細胞異樣生長階段、高密度藻細胞稀釋階段和光誘導階段。
[0020]上述的雨生紅球藻細胞異樣生長階段中加入生長激素，所述生長激素為萘乙酸、6-芐基嘌呤、2，4- 二氯苯氧乙酸或赤霉素。
[0021]上述萘乙酸的質量濃度為0.5mg/L、6-芐基嘌呤的質量濃度為0.5mg/L、2，4_ 二氯苯氧乙酸的質量濃度為0.lmg/L、赤霉素的質量濃度為0.5mg/L。
[0022]本發明所帶來的有益技術效果:
[0023]本發明提出了一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，在原料的選取上，本發明所選用的雨生紅球藻是經過雨生紅球藻細胞異樣生長、高密度藻細胞稀釋和光誘導三個階段完成的，通過異樣培養可在短時間內獲得大量的可產蝦青素的微藻細胞，藻液稀釋后轉入光誘導培養，光誘導培養的藻細胞密度達到2-10g/L，而常規光自養培養藻細胞密度一般0.2-2g/L，采用光誘導培養藻體內的蝦青素含量可提高常規培養的5倍以上，并且在藻細胞異樣生長階段中加入生長激素，該方法制備得到的雨生紅球藻含有較高的蝦青素；利用超高壓提取技術對藻體進行破壁處理，然后再經過萃取、洗脫、濃縮、皂化、離心、等步驟得到蝦青素，該制備方法消耗溶劑量較少，萃取劑選用大豆油、乙醇、乙酸乙酯等溶劑，該萃取劑可以循環利用，并且環境污染小、生產成本低、回收率高、提取得到的蝦青素雜質少，該提取方法降低蝦青素氧化降解可能性，提高了蝦青素的提取質量。
【具體實施方式】
[0024]本發明提出了一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，為了使本發明的目的、技術方案以及優點更清楚、明確，以下將結合具體實施例，對本發明進一步詳細說明。
[0025]本發明所選取原料為雨生紅球藻，雨生紅球藻的簡要培養步驟如下。
[0026]雨生紅球藻的培養:雨生紅球藻細胞經異樣生長、高密度藻細胞稀釋和光誘導三個階段，并且在藻細胞異樣生長階段加入一些生產長激素萘乙酸(NAA)、6_芐基嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、赤霉素(GA3)，通過異樣培養這種方式可在短時間內獲得大量的可產蝦青素的微藻細胞，然后將藻液稀釋后轉入光誘導培養，藻體內蝦青素含量可提高、初始的5倍以上；異樣生長培養能使雨生紅球藻長期處于營養繁殖的階段，異樣生長階段細胞產率高，一天平均細胞產率有1.6g/L，異樣階段最終細胞的密度可達到24.5g/L，所以光誘導的藻細胞密度達到2-10g/L，常規光自養培養藻細胞密度一般0.2-2g/L，是常規培養的5-10倍；傳統的微藻自養培養時間約14-30天，而光誘導的時間一般約3~5天，蝦青素的生產周期縮短，產率大大提高；所選用的生長激素:萘乙酸的質量濃度為0.5mg/L、6-芐基嘌呤的質量濃度為0.5mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸的質量濃度為0.lmg/L、赤霉素的質量濃度為0.5mg/L。
[0027]實施例1:
[0028]步驟一:高壓提取對藻體進行破壁處理
[0029]藻體破壁:稱取IOg藻體，向藻體中加入IOOmL大豆油，在345mL/min流量泵入高壓容器內，在壓力為lOOMpa、溫度為4°C下進行破壁處理，將破壁液離心分離，得到蝦青素提取液及藻渣；
[0030]步驟二:快速分離蝦青素
[0031]萃取:將蝦青素提取液及藻渣與硅膠以重量比2:1混合均勻，然后加入5mL乙醇和15mL的乙酸乙酯，攪拌萃取Ih后，將萃取混合物裝入層析柱中；
[0032]洗脫:用乙醇洗脫，收集紅色流出液部分； [0033]濃縮:將所述紅色流出液減壓蒸餾，得到暗紅色蝦青素油狀液體。
[0034]步驟三:蝦青素油狀液體的粗提
[0035]皂化:將蝦青素油狀液體與0.06mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液按體積比2: I混合為皂化液，4°C，氮氣保護條件下，避光皂化2h ；
[0036]離心:在皂化液中加入去離子蒸餾水，至紅色絮狀沉淀產生，離心得到蝦青素沉淀。
[0037]步驟四:蝦青素結晶
[0038]純化:將蝦青素沉淀通氮氣吹干，用石油醚溶解，再通過硅膠柱層析純化，用正己烷與丙酮按體積比5:2混合作為洗脫液洗脫，收集紅色流出液；
[0039]結晶:在紅色流出液中加入等體積去離子水混勻，置于-10°C，育晶18h，4000轉/min離心，用去離子水洗滌沉淀兩次，收集晶體，氮氣吹干，獲得結晶產品。
[0040]實施例2:
[0041 ] 步驟一:高壓提取對藻體進行破壁處理
[0042]藻體破壁:稱取IOg藻體，向藻體中加入IOOmL大豆油，在345mL/min流量泵入高壓容器內，在壓力為200Mpa、溫度為4°C下進行破壁處理，將破壁液離心分離，得到蝦青素提取液及藻渣；
[0043]步驟二:快速分離蝦青素
[0044]萃取:將蝦青素提取液及藻渣與硅膠以重量比3:1混合均勻，然后加入SmL乙醇和ISmL的乙酸乙酯，攪拌萃取2h后，將萃取混合物裝入層析柱中；
[0045]洗脫:用乙醇洗脫，收集紅色流出液部分；[0046]濃縮:將所述紅色流出液減壓蒸餾，得到暗紅色蝦青素油狀液體。
[0047]步驟三:蝦青素油狀液體的粗提
[0048]皂化:將蝦青素油狀液體與0.06mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液按體積比4: I混合為皂化液，8°C，氮氣保護條件下，避光皂化3h ；
[0049]離心:在皂化液中加入去離子蒸餾水，至紅色絮狀沉淀產生，離心得到蝦青素沉淀。
[0050]步驟四:蝦青素結晶
[0051]純化:將蝦青素沉淀通氮氣吹干，用石油醚溶解，再通過硅膠柱層析純化，用正己烷與丙酮按體積比5:2混合作為洗脫液洗脫，收集紅色流出液；
[0052]結晶:在紅色流出液中加入等體積去離子水混勻，置于_8°C，育晶20h，4000轉/min離心，用去離子水洗滌沉淀兩次，收集晶體，氮氣吹干，獲得結晶產品。
[0053]實施例3:
[0054]步驟一:高壓提取對藻體進行破壁處理
[0055]藻體破壁:稱取IOg藻體，向藻體中加入IOOmL大豆油，在345mL/min流量泵入高壓容器內，在壓力為300Mpa、溫度為4°C下進行破壁處理，將破壁液離心分離，得到蝦青素提取液及藻渣；
[0056]步驟二:快速分離蝦青素
[0057]萃取:將蝦青素提取液及藻渣與硅膠以重量比3:1混合均勻，然后加入IOmL乙醇和20mL的乙酸乙酯，攪拌萃取3h后，將萃取混合物裝入層析柱中；
[0058]洗脫:用乙醇洗脫，收集紅色流出液部分；
[0059]濃縮:將所述紅色流出液減壓蒸餾，得到暗紅色蝦青素油狀液體。
[0060]步驟三:蝦青素油狀液體的粗提
[0061]皂化:將蝦青素油狀液體與0.06mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液按體積比6: I混合為皂化液，10°c，氮氣保護條件下，避光皂化4h ；
[0062]離心:在皂化液中加入去離子蒸餾水，至紅色絮狀沉淀產生，離心得到蝦青素沉淀。
[0063]步驟四:蝦青素結晶
[0064]純化:將蝦青素沉淀通氮氣吹干，用石油醚溶解，再通過硅膠柱層析純化，用正己烷與丙酮按體積比5:2混合作為洗脫液洗脫，收集紅色流出液；
[0065]結晶:在紅色流出液中加入等體積去離子水混勻，置于_6°C，育晶24h，4000轉/min離心，用去離子水洗滌沉淀兩次，收集晶體，氮氣吹干，獲得結晶產品。
[0066]上述三個實施例中萃取步驟中選用的乙醇和乙酸乙酯也可以用大豆油、氫氧化鉀-乙醇溶液、石油醚、正己烷、丙酮中的一種或幾種的混合物來代替。
[0067]應當理解的是，上述針對較佳實施例的描述較為詳細，并不能因此而認為是對本發明專利保護范圍的限制，本領域的普通技術人員在本發明的啟示下，在不脫離本發明權利要求所保護的范圍情況下，還可以做出替換、簡單組合等多種變形，本發明的請求保護范圍應以所附權利要求為準。
【權利要求】
1.一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，其特征在于包括以下步驟: a藻體破壁:稱取一定量的藻體，向所述藻體中加入一定量的大豆油，所述藻體和大豆油的重量體積比為l:10g/mL，以345mL/min流量泵入高壓容器內，在壓力為100~300Mpa、溫度為4°C下進行破壁處理，將破壁液離心分離，得到蝦青素提取液及藻渣； b萃取:將步驟a中的蝦青素提取液及藻渣與硅膠以重量比2~4:1混合均勻，然后加入乙醇和乙酸乙酯，所述乙醇和乙酸乙酯的加入量按照每IOg雨生紅球藻粉加入5~IOmL乙醇和15~20mL的乙酸乙酯來進行計算，將所述蝦青素提取液及藻渣、硅膠、乙醇和乙酸乙酯混合攪拌萃取I~3h后，將萃取混合物裝入層析柱中；c洗脫:用乙醇洗脫，收集紅色流出液部分；d濃縮:將所述紅色流出液減壓蒸餾，得到暗紅色蝦青素油狀液體。
2.根據權利要求1所述一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，其特征在于:所述蝦青素油狀液體按照如下步驟精提: e皂化:將蝦青 素油狀液體與0.06mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液按體積比2~8: I混合為皂化液，4~12°C，氮氣保護條件下，避光皂化2-4h ； f離心:在步驟e皂化液中加入去離子蒸餾水，至紅色絮狀沉淀產生，離心得到蝦青素沉淀。
3.根據權利要求2所述一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，其特征在于:所述蝦青素沉淀按照如下步驟獲得結晶產品: g純化:將蝦青素沉淀通氮氣吹干，用石油醚溶解，再通過硅膠柱層析純化，用正己烷與丙酮按體積比5:2混合作為洗脫液洗脫，收集紅色流出液； h結晶:在步驟g紅色流出液中加入等體積去離子水混勻，置于-10°C~_6°C，育晶18~24h，4000轉/min離心，用去離子水洗滌沉淀兩次，收集晶體，氮氣吹干，獲得結晶產品O
4.根據權利要求3所述的一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，其特征在于:所述步驟b中的乙醇和乙酸乙酯可以用大豆油、氫氧化鉀-乙醇溶液、石油醚、正己烷、丙酮中的一種或幾種的混合物來代替。
5.根據權利要求4所述的一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，其特征在于:所述雨生紅球藻的培養包括三個階段:培養雨生紅球藻細胞異樣生長階段、高密度藻細胞稀釋階段和光誘導階段。
6.根據權利要求5所述的一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，其特征在于:所述雨生紅球藻細胞異樣生長階段中加入生長激素，所述生長激素為萘乙酸、6-芐基嘌呤、2，4- 二氯苯氧乙酸或赤霉素。
7.根據權利要求6所述的一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法，其特征在于:所述萘乙酸的質量濃度為0.5mg/L、6-芐基嘌呤的質量濃度為0.5mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸的質量濃度為0.lmg/L、赤霉素的質量濃度為0.5mg/L。
【文檔編號】C07C403/24GK103787941SQ201410020938
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】李悅明, 管斌, 李元廣, 徐建春, 夏修巒, 王道會 申請人:青島科海生物有限公司