一種利用黃腐酸促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體設及一種利用黃腐酸促進雨生紅球藻生產郵 青素的方法。
【背景技術】
[0002] 天然郵青素（3,3'-二哲基-4,4'-二酬基-e，e'-胡蘿h素）是目前自然 界發現的最強的抗氧化劑。天然郵青素來源自發夫酵母、蛙魚、郵殼及雨生紅球藻中，而雨 生紅球藻中含有豐富的郵青素，可達其干重的4%，被譽為天然郵青素的濃縮品。郵青素的 抗氧化活性主要體現在一方面它是類胡蘿h素的最高級衍生物；另一方面其共輛雙鍵末端 具有不飽和的酬基和哲基，由此基團構成a-哲基酬，因此它要強于一般的類胡蘿h素的 抗氧化性。天然郵青素對人體無任何毒副作用，郵青素的抗氧化活性使得其在醫藥、化妝品 和保健品等有很大的應用潛力，另外郵青素也可W作為水產動物的飼料添加劑W及食品添 加劑。
[0003] 雨生紅球藻屬于一種單細胞綠藻，它只有在脅迫條件下，比如高溫、強光照、氮饑 餓等，能夠大量的積累郵青素。而關于刺激雨生紅球藻產郵青素的誘導大多集中在物理和 化學因子上，較少有關于植物激素的研究。黃腐酸作為一種植物生長調節劑，能夠促進植物 生長，具有很強的抗逆作用，而雨生紅球藻正是在該種脅迫下才大量積累郵青素。外援添加 黃腐酸能激發植物防御基因的表達，誘導植物的化學防御，與機械損傷和昆蟲取食相似的 效果。因此黃腐酸可能會誘導雨生紅球藻大量積累郵青素。
[0004] 目前國內已經有規模化生產郵青素的公司，也已有了一些相關的技術和專利，比 如"雨生紅球藻的培養生產方法"（201210295602)公開了一種利用光生物反應器培養雨 生紅球藻的方法，包括不同L邸光源的和二氧化碳調節抑值培養綠色細胞的方法。湖北 師范學院的"一種雨生紅球藻高密度培養的氣升式光生物反應器"（CN200510018203. 4)， 公開了一種雨生紅球藻高密度培養的氣升式光生物反應器，包括養殖罐、水處理裝置、照明 裝置、氣體供應裝置，通過調控反應條件實現全天候高密度養殖，并將藻的養殖和郵青素 積累結合在同一反應器中完成。天津大學的"用酵母發酵殘液培養藻類生產郵青素的方 法"（CN1480524A)，公開了一種利用酵母發酵殘液生產郵青素的方法，是向酵母發酵殘液中 加入無機鹽配成培養基，在特定的容器內培養雨生紅球藻或綠球藻，經過分離提取郵青素。 上述相關專利技術雖然先進，但是工藝較為復雜，設備要求高，操作較為繁瑣，該就增加了 生產的成本和技術推廣的難度。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種利用黃腐酸促進雨生紅球藻生產郵青素的方法，該方法 的不僅操作簡單、成本低，而且可很大程度上縮短積累郵青素的周期及提高郵青素的產率。
[0006] 本發明所采用的技術方案是，一種利用黃腐酸促進雨生紅球藻生產郵青素的方 法，包括W下步驟：
[0007] 步驟1、藻液的制備；培養雨生紅球藻到對數生長期后期，用缺氮的BG-11培養基 稀釋藻液并獲得誘導的藻液；
[000引步驟2、誘導雨生紅球藻積累郵青素：用純水配成lOg。的黃腐酸母液，將黃腐酸 母液添加到已經稀釋好的誘導的藻液中使黃腐酸濃度達到4. 95-5. 05mg然后將上述藻 液進行培養，待藻體細胞完全變紅后，收集藻細胞；
[0009] 步驟3、利用有機溶劑提取藻細胞的郵青素。
[0010] 本發明的特點還在于：
[OO^M] 雨生紅球藻為雨生紅球藻菌株化ematococ州SpluvialisLUGU。
[0012] 步驟1中藻液的制備具體為：在24-26°C、光強2900-30001X，持續光照條件下培 養，培養雨生紅球藻到達對數生長期后期，此時細胞濃度達到l〇6cellsml/i，利用缺氮的 BG-11培養基稀釋到2X105cellsmL-i作為誘導藻液。
[0013] 步驟2中誘導雨生紅球藻積累郵青素中的培養條件為；26-28 °C、光強 9500-100001X、冷光燈連續光照及饑餓營養鹽的復合脅迫。
[0014] 步驟3中利用有機溶劑提取藻細胞的郵青素具體為：取5ml上述藻液，400化/min 離屯、5min，棄上清得藻細胞沉淀；分別向藻細胞沉淀中加入2mL30%甲醇和5%K0H混合 液，60°C水浴15min，4000r/min離屯、lOmin，除上清，沉淀加入純水洗漆2次，除堿液殘留； 然后加入5mLDMS0,200w超聲破壁15min，其中，超聲Imin，10s間歇，于45°C水浴20min，抽 提至藻體發白，離屯、收集上清測0D490;并按照公式(4.SAXV3) /Vfc計算得出郵 青素的含量，其中C為郵青素含量，A為490nm下0D值，Va為DMS0體積，Vb為藻液體積。
[0015] 本發明的有益效果是；（1)本發明操作簡單易行、成本低，原材料為自己篩選的雨 生紅球藻菌株可按常規方法培養。
[0016] (2)本發明大幅提高了郵青素的產率，實驗證明，添加4. 95-5. 05mg。的黃腐 酸的誘導組比對照組積累郵青素的周期縮短了 20-30%，郵青素的產量比對照組提高了 82. 3-86. 9%，達到 20. 3-20. 817mg[1。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0018] 本發明提供一種利用黃腐酸促進雨生紅球藻生產郵青素的方法，包括W下步驟：
[0019] 步驟1、藻液的制備；雨生紅球藻采用雨生紅球藻菌株化ematococ州Spluvialis LUGU(NCBI:KM115647)，利用BG-11 培養基，在 24-26°C、光強 2900-30001X，持續光照條件下 培養，培養雨生紅球藻到達對數生長期后期，此時藻細胞濃度達到l〇6cellsml/i，利用缺氮 的BG-11培養基稀釋到2X105cellsmL-1作為誘導藻液；
[0020] 步驟2、誘導雨生紅球藻積累郵青素：用純水配成lOg。的黃腐酸母液，將黃腐酸 母液添加到已經稀釋好的誘導藻液中使黃腐酸濃度達到4. 95-5. 05mg然后將上述藻液 在26-28°C、光強9500-100001X、冷光燈連續光照及饑餓營養鹽的復合脅迫下進行培養，待 藻體細胞完全變紅后，收集藻細胞；
[0021] 步驟3、利用有機溶劑提取藻細胞的郵青素，郵青素的提取方法：
[0022] 每兩天取5ml上述藻液，400化/min離屯、5min，棄上清得藻細胞沉淀；分別向藻細 胞沉淀中加入2血30%甲醇和5%KOH混合液，60°C水浴15min，4000r/min離屯、lOmin，除 上清，沉淀加入純水洗漆2次，除堿液殘留；然后加入5mLD