專利名稱：：雨生紅球藻的蝦青素高產突變株的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種經選育的用以生產天然蝦青素的雨生紅球藻的蝦青素高產突變株。
背景技術：
：蝦青素(Astaxanthin)是一種暗棕紅色的羰基化類胡蘿卜素，其化學名為3，3'-二羥基-e，0'-胡蘿卜素-4，4'-二酮，它不但具有獨特的著色功能，還表現出超強的抗氧化特性和多種生物活性，被譽為自然界中最強的純天然抗氧化維生素，其抗氧化能力是維生素E的550倍，是其他類胡蘿卜素的10倍，在水產及家禽養殖、食品、化妝品、醫藥等領域具有廣泛的應用前景，幾十年來利用各種途徑生產天然蝦青素一直是國內外普遍關注的熱點問題。目前最好的天然蝦青素工業生產來源是雨生紅球藻(泡6v鵬"cocciApA/w'ah'W，它是一種淡水單細胞雙鞭毛綠藻，屬于團藻目(KWracaJes)、衣藻科(6WaT/Jo邁o/7a^ceae)、紅球藻屬(Wse歷aococciAS)。在國外已有幾家大公司利用雨生紅球藻進行天然蝦青素的工業化生產，但我國天然蝦青素尚未形成生產規模。全球每年對天然蟲下青素的需求量僅水產市場就高達750噸左右(按純蝦青素計)，而全球每年的天然蝦青素總產量不到4噸，僅為此需求量的0.5%。由于供貨能力有限，天然蝦青素的國際市場售價高達每噸純品200-300萬美元，每年的全球貿易金額為2億多美元。目前這個市場仍是賣方市場，預計將會持續至少5至10年。近年來，美國、日本、澳大利亞和中國等先后開展這方面的研究工作，開發雨生紅球藻生產天然蟲下青素具有極大的市場前景。雖然雨生紅球藻是目前最好的蝦青素工業生產來源，但它生長比較緩慢，培養過程中易被其他生物污染，為了優化工業生產過程，提高蝦青素的產量，需要為生產天然奸青素提供優良藻株，以提高工業產量。
發明內容本發明以雨生紅球藻的野生株系為材料，采用紫外化學復合誘變，類胡蘿卜素生物合成的抑制劑篩選的誘變育種方法，結果得到了一個蝦青素含量高達出發株1.83倍、生長速率比出發株提高14%、生理生化特性穩定、具有穩定遺傳性能的雨生紅球藻優良突變株。本發明的目的就是提供一種經上述方法誘變選育而得到的雨生紅球藻的蝦青素高產藻株，該藻株命名為雨生紅球藻(泡e鵬"cocciAs;/w/flto)El，于2007年10月19日提交中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，編號為CCTCCM207164。該藻株以下簡稱為雨生紅球藻(〃se歷afococc〃s;/wv/ato)ElCCTCCM207164。所述的雨生紅球藻(/fee鵬tococc"s//OTz'afo)ElCCTCCM207164具有典型的綠藻門團藻目的特征性結構。在無菌KM1培養液(1.2g/l醋酸鈉、2.0g/l酵母提取液、0.4g/l天冬氨酸、0.2g/l六水氯化鎂、0.01g/l七水硫酸亞鐵、0.02g/l二水氯化鈣，PH6.8)中、適宜條件下培養時，其營養細胞大小約5-25um，近橢圓形，綠色，活潑運動，前端略窄小，并有乳突狀結構，由此結構伸出兩根等長的鞭毛。細胞原生質體與細胞壁分離，在分離區具有許多輻射狀的原生質束，生長快速。Hp/m^fcFlotowNIES-144野生藻株在接種后具有明顯的延遲期，但泡柳a"cocciASp/wv/afcElCCTCCM207164則很快進入指數生長期。在營養生長后期，向藻液中分別加入45mM和450uM的醋酸鈉和亞鐵離子，并且暴露在高光強及缺氮的脅迫環境后，^ae/昭tococc"s//wv/afcElCCTCCM207164的細胞停止增殖，運動細胞迅速由綠色經黃色變成深紅色最后變成紅褐色。比i/.p/wWflfcFlotowNIES-144野生株更快積累色素顆粒，細胞內色素顆粒由細胞核周圍向四周擴展直至占據細胞的絕大部分區域，鞭毛消失，整個細胞要比野生株細胞大而紅。所述的雨生紅球藻(〃ae歷atococc"s;/m;/afc)ElCCTCCM207164的生理生化特征如下(1)在BBM、BG-ll等自養培養基和KM1異養培養基中均能生長，也可以混養培養。混養時生長最好。混養時最適的碳源是醋酸鹽，最好的氮源是硝酸鹽，最適生長光照強度為20nmolm虧1，紅光比藍光更有利于生長。較低的溶解氧有利于自養生長，而飽和的溶解氧有利于異養生長。適量的維生素(B1，1一2X10—5%，B12，4x10—7%)能改善其生長，且B1的促進效果更顯著。(2)在125ixmolm—V1高光照強度、氮限制、磷或硫缺乏、鹽脅迫(0.8%氯化鈉)等不利環境條件下，補給醋酸鈉和亞鐵離子，佑記/ffaz^cocciAs;/m^fcElCCTCCM207164細胞迅速變紅，積累大量蝦青素和其他類胡蘿卜素。蝦青素含量在積累三天時就可達到細胞干重的2.54%,積累8天可達到細胞干重的3.38%，高達7/^/m'atoFlotowNIES-144野生株的1.83倍。總蛋白含量和脂肪酸含量也相應增加，碳水化合物含量高達63%。(3)綠色游動細胞中，主要色素為葉綠素a、b，葉黃素以及e—胡蘿卜素。而紅色厚壁孢子則積累類胡蘿卜素，其組成為游離蝦青素2.8%，蝦青素單酯44.6%，蝦青素雙酯45.6%，^_胡蘿卜素6.5%，玉米黃質0.35%，雞油菌黃質0.15%。在蟲下青素單酯和雙酯中脂肪酸主要為C18:1。紅色細胞的細胞色素f的水平不到綠色細胞的1%，大大降低，胞內的CPI、LHCI和Rubisco的水平分別只有綠色細胞的15%、48%和80%，ATP合成酶沒有明顯變化。而積累有次生類胡蘿卜素的紅色運動細胞避光反應加強。(4)在積累蝦青素時，細胞最大光合速率逐漸降低，光合放氧中光合量子需要量和反應中心最小周轉時間上升。在厚壁孢子的形成過程中細胞的呼吸速率上升，光合速率下降。對所述的雨生紅球藻(〃aey7atococc"s//OT/ato)ElCCTCCM207164經過藻株生長速率和目標產物蝦青素的誘導及提取實驗，結果表明本發明的雨生紅球藻(他柳afococc"sp/wv/a/&)ElCCTCCM207164，其目的產物蝦青素的含量高出野生株83%，而生長狀況與出發株一致，其生長速率比野生株提高14%，是一個理想的優良突變株，應用于天然蝦青素的工業生產有一定的優勢。因此，本發明的雨生紅球藻(泡e鵬tococc〃s;/wWa/")ElCCTCCM207164是生產天然蝦青素的優良藻株，可以作為工業生產來源，進行天然蝦青素的工業化生產。具體實施例方式一、本發明的雨生紅球藻(泡e鵬tococc"sp/m^fe)ElCCTCCM207164藻株的生長速率測定(1)培養基為KM1培養基，配方1.2g/l醋酸鈉、2.0g/l酵母提取液、0.4g/l天冬氨酸、0.2g/l六水氯化鎂、0.01g/l七水硫酸亞鐵、0.02g/l二水氯化鈣，PH6.8(2)藻種按10%的接種量，接種到含100ml無菌KM1培養基的250ml三角瓶中，在12h光暗循環、溫度為22°C，光照強度為20nmolmS"的光照培養箱中靜置培養，每天搖瓶三次。(3)每12h取樣一次，用血球計數板進行細胞記數，根據3個平行樣品的細胞數目(平均值)，繪制生長曲線，以公式"=(LnNt—LnNo)/(t—10)計算生長速率(U為比生長速率，Nt為t時間的細胞數值，No為起始細胞數值。(4)測得此突變株比生長速率為0.024±0.0018h"，比野生株提高14°/。，并且顯微鏡觀察其生長初期細胞形態結構與野生株相似，沒有延遲期，很快地進入指數生長期。誘導蝦青素積累后，細胞相比野生株更快地變大變紅。二、本發明的雨生紅球藻(泡aws"cocc^/)/m^afo)ElCCTCCM207164藻株的目標產物蝦青素的誘導及提取測定(1)在處于對數期末期的藻液中分別加入醋酸鈉和亞鐵離子至終濃度為45mM和450PM，同時轉移到25'C、125ymolm'、—"強光照條件下持續光照靜置培養，誘導蝦青素產生。(2)在誘導培養3天藻液已經由綠色變為紅色時，取200ml藻液，用去離子水3000g低溫離心洗滌2次，去除上清，藻泥沉淀進行真空冷凍干燥處理48h，得到干藻粉。(3)稱取上述干藻粉200mg，加液氮研磨，用丙酮反復提取至無色，色素提取液于4r、12000g條件下離心15分鐘，收集上清，0.45pm的微孔濾膜過濾分裝，-20T:凍存。在色素提取液中加入現配的含0.107M氫氧化鈉的甲醇溶液，5'C皂化反應8h，將樣品中的蟲下青素酯分解成游離蝦青素以便測定。(4)利用反相高壓液相色譜法(HPLC)測定上述色素提取液及皂化反應液。色譜條件為WatersSymmetryshieldCl8柱(5|_im;4.6醒x250mm);流動相A為二氯甲烷甲醇乙腈水(5:85:5.5:4.5,v/v);流動相B為二氯甲烷甲醇乙腈水(22:28:45.5:4.5，v/v);線性梯度洗脫08min:B為0%;814min:B由0%升至100%;B維持在100%40分鐘再降為0°/。；流速1.0ml/min;檢測波長480nm:波長范圍210700nm:進樣量20^1;柱溫25'C。根據各組分的色譜行為和光譜特征進行定性分析，根據不同濃度的蝦青素標準品所繪制的標準曲線方程計算樣品中的蝦青素含量。同時也測定其他色素的含(5)上述測定結果顯示本發明中雨生紅球藻的蝦青素高產突變株E1的蝦青素及其他色素含量如下表l-表1突變株ElCCTCCM207164與出發株誘導蝦青素三天時各色素含量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、本發明的雨生紅球藻(〃ae鵬tococctAp/ww'afo)ElCCTCCM207164在擴種繼代培養不同代數時其蝦青素和生長速率與野生株的比較如下表2:表2突變株El纟坐代培養時蝦青素和生長速率與蜀;生株的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1.一種雨生紅球藻的蝦青素高產藻株，其特征在于該藻株是經誘變選育的雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)E1CCTCCM207164。全文摘要本發明提供一種命名為雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)E1CCTCCM207164的雨生紅球藻的蝦青素高產突變株，該藻株是以雨生紅球藻的野生株系為材料，采用紫外化學復合誘變，類胡蘿卜素生物合成的抑制劑篩選的誘變選育而得。該藻株的蝦青素含量高達出發株1.83倍、生長速率比出發株提高14％、生理生化特性穩定、具有穩定遺傳性能，是生產天然蝦青素的優良藻株，可以作為工業生產來源，進行天然蝦青素的工業化生產。文檔編號C12N1/12GK101173214SQ20071003114公開日2008年5月7日申請日期2007年10月30日優先權日2007年10月30日發明者慧何,向文洲,娟彭,峰陳申請人:中國科學院南海海洋研究所