BLyS拮抗肽、含TC-Fc融合蛋白基因的質粒及TC-Fc融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明公開了BLyS拮抗肽、含TC-Fc融合蛋白基因的質粒及TC-Fc融合蛋白，BLyS拮抗肽，是用SEQ?ID?NO.1所示，所述BLyS拮抗肽命名為TC。BLyS拮抗肽TC能夠抑制BLyS與TACI的相互作用。TC-Fc融合蛋白可以和BLyS結合，并且抑制BLyS與TACI的相互作用。TC-Fc融合蛋白保障了拮抗肽TC的空間結構和穩定性，同時又不削弱肽的活性。TC-Fc融合蛋白可以作為潛在的BLyS拮抗劑應用于自身免疫疾病和淋巴瘤的研究治療。
【專利說明】BLyS括抗肽、含TC-Fc融合蛋白基因的質粒及TC-Fc融合蛋白
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，特別是涉及命名為TC的BLyS拮抗肽、含TC-Fc融合蛋白基因的質粒及TC-Fc融合蛋白。
【背景技術】
[0002]B淋巴細胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS),又稱為B細胞激活因子(B cellactivating factor belonging to the TNF family, BAFF),是 TNF 家族中的一員。由單核細胞和巨噬細胞持續合成、分泌。BAFF能夠結合B細胞表面的三種受體，B細胞成熟抗原(B cell mature antigen, BCMA),跨膜激活物和 CAML 結合物(Transmembraneactivator and CAML-1nteractor, TACI)以及 BAFF 受體 3 (BR3)。受體結合 BAFF 后，偶聯TNF 受體相關因子(TNF receptor associated factor, TRAF),激活 NF-K B 途徑。最終,誘導抗細胞凋亡基因:Bcl-2、Bcl-XL的表達，減少成熟B細胞的凋亡。如果敲除BAFF，小鼠體內的成熟B細胞完全缺失。因此，BAFF在B細胞的發育和成熟過程中起至關重要的作用。
[0003]由于BLyS在B淋巴細胞活化、增殖中發揮重要作用，而B淋巴細胞產生的抗體所介導的體液免疫在眾多已發現的自身免疫性疾病當中處于中心地位。因此，目前認為BLyS在體內的過量表達與某些自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、口眼干燥綜合征(Siogren)等病程的發生、發展密切相關。過量表達BLyS的轉基因小鼠出現系統性紅斑狼瘡樣癥狀(13)。臨床實驗也發現，SLE和Siogren綜合征病人的血清中，可溶性BLyS明顯高于正常人。同時，作為B細胞刺激、存活因子，BLyS及其受體參與骨髓瘤和淋巴瘤的發生和發展。因此，以阻斷BLyS生物學功能為策略，探討BLyS拮抗劑治療系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節炎等自身免疫性疾病和B細胞腫瘤疾病的研究正在國外如火如荼的進行中。目前，針對BLyS的抑制劑的研究主要集中在研制具有中和BLyS作用的BLyS誘館受體(d ecoy receptor)、抗BLyS抗體和拮抗肽(1’2)。2011年3月美國FDA批準由人類基因科學公司(Human Genome Sciences)和葛蘭士-史克(GlaxoSmithKline)公司聯合研發的抗BLyS抗體BENLYSTA (Belimumab)治療系統性紅斑狼瘡。這是50年來，FDA首次批準治療該類疾病的藥物。因此，BLyS拮抗劑有著廣泛的臨床應用前景。
[0004]眾多研究已經詳細闡述BLyS與受體相互作用的可能模式及關鍵氨基酸。所以，針對BLyS與其受體結合核心區域的拮抗肽也成為BLyS抑制劑的策略。我們在前期工作中探討了 BLyS拮抗肽抑制BLyS的功能，初步結果顯示:合成的16個氨基酸肽體外能夠部分抑制BLyS的作用(3)。進一步通過計算機分子模建、優化設計BLyS拮抗肽，將有望提高其抑制BLyS生物學功能。為開發治療SLE和RA這類自身免疫性疾病和B細胞腫瘤的新藥奠定實驗研究基礎。
[0005]1.Sun J (孫劍)，Lin Z, Feng J, Li Y and Shen B (2008) BAFF-targetingtherapy, a promising strategy for treating autoimmune diseases.Eur JPharmaco1597:1 - 5.[0006]2.Sun J (孫劍)，Lin Z, Feng J, Li Y and Shen B (2008) B lymphocytestimulator, a new target for treating B cell malignancies.Chinese MedicalJ121(14):1319-1323.[0007]3.Sun J (孫劍)，Feng J, Li Y and Shen B (2006) A novel BLyS antagonistpeptide designed based on the3_D complex structure of BCMA and BLyS.BiochemBiophys Res Commun346(4): 1158-1162.[0008]與抗體和誘餌蛋白等大分子拮抗劑相比，多肽具有分子量小、滲透性強、人工合成簡單、免疫原性低，毒性低和副作用少的優點。然而，多肽也存在不穩定、效率低和半衰期短的缺點。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是提供一種能抑制BLyS與TACI的相互作用的BLyS拮抗肽。
[0010]本發明的第二個目的是提供一種含TC-Fc融合蛋白基因的質粒。
[0011]本發明的第三個目的是克服現有技術的不足，提供一種保障拮抗肽的空間結構和穩定性，同時又不削弱肽的活性的TC-Fc融合蛋白。
[0012]本發明的技術方案概述如下:
[0013]BLyS拮抗肽，是用SEQ ID N0.1所示，所述BLyS拮抗肽命名為TC。
[0014]含TC-Fc融合蛋白基因的質粒，是用下述方法構建:
[0015](I)用 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 所示的 DNA 引物合成 SEQ ID N0.5 所示 TC 基因，所述TC基因的5’端含有黏性末端NdeI，3’端含有黏性末端EcoRI ；
[0016](2)將經限制性內切酶EcoRI和Hind III酶切的人IgGlFc片段與TC基因，一起連接在經NdeI和Hind III酶切過的載體pET30a上，得到連接體系，構建策略見圖1，將連接體系轉化入大腸桿菌JM109感受態細胞中，Kana篩選，菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定，送公司測序后，，獲得命名為TC-Fc-PET30a的含TC-Fc融合蛋白基因的質粒。TC-Fc融合蛋白，是用SEQ ID N0.2所示。
[0017]本發明的優點:
[0018]BLyS拮抗肽TC能夠抑制BLyS與TACI的相互作用。TC-Fc融合蛋白可以和BLyS結合，并且抑制BLyS與TACI的相互作用。TC-Fc融合蛋白保障了拮抗肽TC的空間結構和穩定性，同時又不削弱肽的活性。TC-Fc融合蛋白可以作為潛在的BLyS拮抗劑應用于自身免疫疾病和淋巴瘤的研究治療。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為TC-Fc_PET30a重組質粒構建策略圖。
[0020]圖2為拮抗肽TC顯著抑制BLyS與TACI的相互作用的Elisa試驗。
[0021]圖3 為 TC 雙鏈 DNA 梯度電泳，其中，1-5:1.6pmol/L，0.8pmol/L，0.4pmol/L,
0.2pmol/L, 0.lpmol/L ；M:marker。
[0022]圖4為菌落PCR篩選，其中，M，Marker ;1，2，陽性菌落。
[0023]圖5為重組質粒的雙酶切鑒定.其中，M，marker ;1，Nde I和Hind III酶切；2，EcoR I 和 Hind III酶切。[0024]圖6為TC-Fc融合蛋白SDS-PAGE電泳圖。
[0025]圖7為融合蛋白TC-Fc與BLyS結合的Elisa試驗。
[0026]圖8為融合蛋白TC-Fc顯著抑制BLyS與TACI相互作用的Elisa試驗。
【具體實施方式】
[0027]下面的實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，但并不對本發明作任何限制。
[0028]將BLyS拮抗肽命名為TC僅是為了方便描述，但并不對此進行限定。
[0029]BLyS蛋白:孫劍，黎燕，馮建男，孫瑛勛，胡美茹，沈倍奮，.人可溶性B淋巴細胞刺激因子基因的克隆及在大腸桿菌中的表達[J].細胞與分子免疫學雜志，2006，(2) SEQID N0.8 所示。
[0030]TAC1-Fc蛋白:冀麗軍，白烏仁圖雅，柴琳，孫劍，.TAC1-Fc融合蛋白的基因構建、原核表達及生物活性鑒定[J].生物技術，2013，(3).SEQ ID N0.9所示。
[0031]Fe蛋白:吳真.BCMA-Fc作為潛在藥物的研究[D].天津大學，2012SEQ ID N0.10所示。
[0032]無關肽NP:我們委托生物公司制備，其氨基酸序列為SEQ ID N0.7。
[0033]包被液:稱量出33.6g碳酸氫鈉和63.6g無水碳酸鈉，將其放如燒杯中，向內加入600ml蒸餾水，攪拌至溶質全部溶解，再加入蒸餾水中定容到I 了 L。將其放在4°C下保存。
[0034]PBST 的配制:在取250 μ I吐溫-20加入500ml的I XPBS中，混合均勻至完全融
合。在室溫下保存
[0035]5%脫脂奶粉的配制:稱取脫脂奶粉lg，攪拌下溶解于IOml0.01M PBS中，加PBS定容至20ml，于4°C保存
[0036]TMB顯色液:取4.95ml底物緩沖液，0.05ml 1%TMB儲液，臨用前加入5 μ 130%過氧化氫。
[0037]1%ΤΜΒ儲液:稱取Ig ΤΜΒ，攪拌下充分溶解于80ml DMSO中，加DMSO定容至100ml，
保存于4°C。
[0038]底物緩沖液(pH5.0):取24.3ml0.1M檸檬酸，25.7ml0.2M磷酸氫二鈉，加入約40ml水，調pH至5.0，再加水定容至100ml，保存于室溫。TMB工作液(現配現用)
[0039]本發明基于BLyS和其受體TACI的晶體結構，通過計算機模建，模擬BLyS與TACI的相互作用模式和條件優化，輔助設計理論上拮抗BLyS與TACI相互作用的拮抗肽。進一步通過生物實驗驗證拮抗肽的功能活性。之后，為了保障拮抗肽的空間結構和穩定性，通過基因工程的方法，將有抑制活性的拮抗肽基因與人IgG1Fc序列連接，最終得到性質穩定的BLyS拮抗肽-Fe融合蛋白，進一步通過生物實驗驗證BLyS拮抗肽-Fe融合蛋白的功能活性。為開發有臨床應用前景的新藥先導藥物奠定了實驗研究基礎。
[0040]實施例1
[0041]BLyS與其受體相互作用的結構信息和新型靶向BLyS拮抗肽的設計
[0042]利用計算機輔助分子對接及動力學模擬探討了 BLyS與其受體TACI相互作用模式，借助計算機圖形學、距離幾何學分析了 BLyS與其受體相互識別的關鍵氨基酸殘基。
[0043]通過計算機輔助分子設計以及高通量虛擬篩選技術從頭設計能夠模擬受體關鍵氨基酸構象的短肽，進而借助從頭搭建、分子對接、動力學模擬從理論上評價BLyS與拮抗肽的作用；利用計算機圖形學技術、距離幾何學以及分子間氫鍵作用評價拮抗肽潛在的生物學效應。經過理論篩選得到BLyS拮抗肽，命名為TC，序列為:DTSKLASTGYSSDPY (SEQ IDN0.1)。
[0044]實施例2
[0045]BLyS拮抗肽的化學合成
[0046]根據計算機輔助設計的結果。我們委托生物公司制備BLyS拮抗肽(TC)，其純度達95%以上。
[0047]Sample Id:TC, Sequence:YAFTNYLGGSSGTNYN (SEQ ID N0.1), MolecularWeight:1728.81, HPLC Analysis:Peptide Purity>95%0
[0048]實施例3
[0049]ELISA實驗驗證拮抗肽TC的抑制活性
[0050]用包被液稀釋BLyS蛋白至終濃度為10 μ g/ml，取50 μ L于酶標板中，4°C，18h。用PBST洗滌酶標板3次，每次5min。每孔加150 μ 15%脫脂奶粉，37 °C，溫育2h。用PBST洗滌酶標板3次，每次5min。將固定濃度的TAC1-Fc蛋白(終濃度為10 μ g/ml)與不同濃度梯度的拮抗肽TC (終濃度分別為0、10、50和100 μ g/ml)混合，每個濃度3個平行，每孔加5(^1^，371:，溫育111。無關肽NP作為對照。用PBST洗滌酶標板3次，每次5min。每孔加1:5000倍稀釋的!11^標記羊抗人抗體5(^1^，371:，111。用PBST洗滌3次，每次5min。每孔加入50 μ L TMB顯色液，37°C避光顯色lOmin。每孔加50 μ Llmol/L H2S04終止反應，酶標儀檢測0D450值。拮抗肽TC對BLyS與TACI的相互作用的抑制效果用下述公式計算:抑制率％=(對照組0D450—實驗組0D450) /對照組0D450
[0051]競爭ELISA實驗結果表明:TC濃度在10 μ g/ml時能夠抑制20.03%BLyS與TACI的結合；在50 μ g/ml時能夠抑制28.12%BLyS與TACI的結合；在100 μ g/ml時能夠抑制36.3%BLyS與TACI的結合。抑制作用與拮抗肽的濃度呈正相關(見圖2)。
[0052]無關肽對BLyS與TACI的相互作用沒有明顯抑制作用、且沒有劑量依賴關系。證明TC的抑制作用是特異和有效的。
[0053]實施例4
[0054]構建含TC-Fc融合蛋白基因的質粒TC-Fc_PET30a
[0055]依據TC序列，我們設計了兩條編碼短肽的DNA引物，并委托生物公司制備。TC兩序列分別是:
[0056]5，-TATGTACGCATTCACCAACTACCTGGGTGGTTCTTCTGGTACCAACTACAACGGTGGAGGTGGATCTG-3’ (68bp) (SEQ ID N0.3)和
[0057]5' -AATTCAGATCCACCTCCACCGTTGTAGTTGGTACCAGAAGAACCACCCAGGTAGTTGGTGA ATGCGTACA-3’ (70bp) (SEQ ID N0.4)。
[0058]合成的DNA 引物加入 200 μ IlOmM Tris_Hcl(pH8.5)溶解(終濃度為 16ρπιο1/μ I)。各取TC基因的正鏈和負鏈20 μ 1，混合在EP管中，100°C水浴煮沸3min，逐漸冷卻至室溫。用2%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察退火結果。電泳結果顯示65bp處有明顯條帶，證明TC基因合成成功(見圖3)，TC基因是SEQ ID N0.5所示。
[0059]人IgGlFc片段由PCR技術獲得，Fe片段(已知序列)經過限制性內切酶EcoRI和Hind III酶切之后，與TC基因一起連接在被NdeI和Hind III酶切過的載體pET30a上，得到連接體系(見圖1)，同時制備空質粒陰性對照組。
[0060]將連接體系轉化進入JM109大腸桿菌中。菌落PCR結果顯示I號、2號菌種為陽性(見圖4)。對I號、2號菌種提取質粒酶切，結果750b處有目的條帶(見圖5)。菌落PCR和雙酶切結果表明了構建的TC-Fc-pET30a重組質粒的正確性。將I號、2號菌種送生物公司測序，測序結果進行序列比對，正確率100%，表明TC-Fc-pET30a重組質粒構建成功。
[0061]實施例5
[0062]TC-Fc融合蛋白的誘導和表達
[0063]將測序正確的重組質粒TC-Fc-pET30a轉化表達宿主菌BL21進行高表達菌株篩選，發現在IPTG濃度0.5mM, 16°C慢速振搖的條件下誘導，能夠誘導出目的蛋白。選取菌株進行大量表達，經蛋白A凝膠親和層析柱純化，洗脫組分SDS-PAGE電泳，發現1、3、5、7號泳道有目的條帶。說明I至7號EP管中有目的蛋白。將I至7號洗脫液在IXPBS中透析，收集，用紫外分光光度計測量計算蛋白濃度為200ng / μ I。取透析后的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳，發現，目的蛋白的大小為32KD，和TC-Fc大小一致，并且具有較高純度(見圖6)是用SEQ ID N0.2所示。[0064]實施例6
[0065]ELISA實驗驗證TC-Fc融合蛋白的結合活性
[0066]用包被液稀釋BLyS蛋白至終濃度為10 μ g/ml，取50 μ L于酶標板中，4°C，18h。用PBST洗滌酶標板3次，每次5min。每孔加150 μ 15%脫脂奶粉，37 °C，溫育2h。用PBST洗滌酶標板3次，每次5min。加O、12.5、25、50和100 μ g/ml五個濃度梯度的TC-Fc蛋白溶液，每個濃度3個平行，每孔50yL，37°C，溫育lh。Fe蛋白作為對照。用PBST洗滌酶標板3次，每次5min。每孔加1:5000倍稀釋的!11^標記羊抗人抗體5(^1^，371:，111。用PBST洗漆3次,每次5min。每孔加入50 μ L TMB顯色液,37°C避光顯色IOmin0每孔加50 μ Llmol/L H2S04終止反應，酶標儀檢測0D450值。TC-Fc融合蛋白結合BLyS蛋白的活性由下述公式計算:結合率％=實驗組0D450 /對照組0D450。
[0067]Elisa實驗結果表明，TC-Fc濃度在12.5μ g/ml時與BLyS結合率為14.5%%;25 μ g/ml 時與 BLyS 結合率為 23.47% ；50 μ g/ml 時與 BLyS 結合率為 58.7% ；100 μ g/ml 時與BLyS結合率為100%。結合程度與融合蛋白的濃度呈正相關(見圖7)。
[0068]Fe蛋白與BLyS沒有明顯的結合作用、且沒有劑量依賴關系。證明TC-Fc的結合作用是特異和有效的。
[0069]實施例7
[0070]ELISA實驗驗證TC-Fc融合蛋白的抑制活性
[0071]用包被液稀釋BLyS蛋白至終濃度為10 μ g/ml，取50 μ L于酶標板中，4°C，18h。用PBST洗滌酶標板3次，每次5min。每孔加150 μ 15%脫脂奶粉，37 °C，溫育2h。用PBST洗滌酶標板3次,每次5min。將固定濃度的TAC1-Fc-myc蛋白(終濃度為2μ g/ml )(TAC1-Fc-myc的序列為SEQ ID N0.6所示)與不同濃度梯度的TC-Fc融合蛋白(終濃度分別為O、10、50和100 μ g/ml)混合，每個濃度3個平行，每孔加50 μ L，37°C，溫育lh。Fe蛋白作為對照。用PBST洗滌酶標板3次，每次5min。每孔加1:1000倍稀釋的小鼠抗myc抗體50 μ L，37°C，溫育lh。用PBST洗滌3次，每次5min。每孔加1:5000倍稀釋的山羊抗小鼠抗體50 μ L，37°C，溫育lh。每孔加入50yL TMB顯色液，37°C避光顯色lOmin。每孔加50 μ Llmol/LH2S04終止反應，酶標儀檢測0D450值。TC-Fc融合蛋白對BLyS與TACI的相互作用的抑制效果用下述公式計算:抑制率％=(對照組0D450—實驗組0D450) /對照組0D450
[0072]競爭ELISA實驗結果表明:TC_Fc濃度在10 μ g/ml時能夠抑制7.03%BLyS與TACI的結合；在50 μ g/ml時能夠抑制12.9%BLyS與TACI的結合；在100 μ g/ml時能夠抑制24%BLyS與TACI的結合。抑制作用與融合蛋白的濃度呈正相關(見圖8)。
[0073]Fe蛋白對BLyS與TACI的相互作用沒有明顯抑制作用、且沒有劑量依賴關系。證明TC-Fc的抑制作 用是特異和有效的。
【權利要求】
1.BLyS拮抗肽，其特征是用SEQ ID N0.1所示，所述BLyS拮抗肽命名為TC。
2.含TC-Fc融合蛋白基因的質粒，其特征是用下述方法構建: (1)用SEQID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA引物合成SEQ ID N0.5所示TC基因，所述TC基因的5’端含有黏性末端NdeI，3’端含有黏性末端EcoRI ； (2)將經限制性內切酶EcoRI和HindIII酶切的人IgGlFc片段與TC基因，一起連接在經NdeI和Hind III酶切過的載體pET30a上，得到連接體系，將連接體系轉化入大腸桿菌JM109感受態細胞中，經鑒定，獲得命名為TC-Fc-PET30a的含TC-Fc融合蛋白基因的質粒。
3.TC-Fc融合蛋白，其特征是用SEQ ID N0.2所示。
【文檔編號】C07K7/08GK103936833SQ201410158687
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月18日 優先權日:2014年4月18日
【發明者】孫劍, 馮建男, 沈倍奮, 趙亞璁, 白烏仁圖雅, 冀麗軍, 郝霞飛 申請人:天津大學