溫度敏感型細胞培養裝置及制備方法、細胞培養方法
【專利摘要】本發明提供一種溫度敏感型細胞培養裝置及制備方法、細胞培養方法。本發明的溫度敏感型細胞培養裝置，包括聚苯乙烯體，所述聚苯乙烯體上接枝聚苯乙烯-聚N-異丙基丙烯酰胺嵌段聚合物。與現有技術相比，本發明的溫度敏感型細胞培養裝置在培養細胞時，經簡單的溫度變化，就可以非損傷的獲得完整的培養細胞層及其所沉積的細胞外基質，避免使用胰酶消化或者化學試劑解離，減少了細胞的死亡，降低了對細胞外基質的損傷，提高了培養細胞的質量和活性。
【專利說明】溫度敏感型細胞培養裝置及制備方法、細胞培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種細胞培養裝置及制備方法、細胞培養方法，特別涉及一種溫度敏感型細胞培養裝置及制備方法、細胞培養方法。
【背景技術】
[0002]細胞治療是以功能性細胞為主體的治療方法，既可作為一種獨立的治療方法，也可與常規的手術、化學藥物等治療方法聯合應用。其作用機理為:1)細胞的直接作用，修復受損的組織和器官或殺傷腫瘤細胞；2)細胞的間接作用，分泌相關的細胞因子或生物活性分子，調節患者自身細胞的增殖和功能。治療性細胞可以是患者自身來源的，也可以是同種異體來源的；治療方法可以是一般的輸注，也可以是移植。細胞治療廣泛用于骨髓移植、晚期肝硬化、股骨頭壞死、惡性腫瘤、心肌梗死等疾病。
[0003]細胞治療已有百年歷史，可追溯到1493-1541年，由菲律賓Auredus Paracelsus提出，1912年德國醫生將細胞治療第一次用于治療“小兒胸腺機能減退和甲狀機能低下”，1930年瑞士的代保羅.尼漢斯(Daul Niehans, 1882-1971年)成為細胞治療皮膚年輕化的著名醫師，被稱為“細胞治療之父”。1990年，Niehans報道了 6500例患者愿意接受該治療技術。并在墨西哥的Tiguaka開始應用細胞治療艾滋病(AIDS)和其他各種疾病。至2012年，國外文獻報道的自體MSCs移植治療冠心病就己超過800例。一項67例的隨機雙盲臨床試驗，以自體MSCs為試驗組，以安慰劑為對照組，治療后4個月MRI檢查，證實心肌血循環及心功能顯著改善。國內己在很多醫院有類似的臨床應用，不僅用于治療冠心病，也用于肢體缺血性疾病、促進上皮再生等治療，近期療效令人鼓舞。在MEDELINE上輸入Cell andStem Cell Therapy,可檢索到6萬多條相關文獻,表明細胞治療的基礎研究與臨床應用已成為世界各國的研究熱 點。細胞治療具有極好的應用前景，已成為世界各國科學家、臨床醫生、管理者的共識。
[0004]在組織工程學中生物支架材料是指通過提供物理和化學的信號，在形成有功能的組織的過程中能指導細胞生長，分化和形成組織而所設計出的新的生物材料。通常的觀點認為，理想的組織工程支架材料應該滿足下列要求:①良好的組織相容性生物降解性，降解速率與新組織形成速率相一致；③無毒無免疫原性；④合適的力學性能；⑤適當的三維結構(空隙和形態)，以便細胞、氣體、代謝產物、營養成分和信號分子在支架內部運輸并與周圍局部環境相交換。根據降解與否，生物支架材料可分為非可降解材料和可降解材料。根據來源，可分為天然生物材料和人工合成生物材料兩大類，每類材料又可分為有機材料和無機材料。
[0005]目前，在組織工程中脫去組織內細胞的方法基本都是應用生物學酶(如胰蛋白酶，中性蛋白酶和核酸酶等)消化法或直接細胞刮落法，其存在對細胞表面蛋白、離子通道、細胞信號等造成損傷的缺點。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種溫度敏感型細胞培養裝置，以解決現有技術中在組織工程中脫去組織內細胞的方法基本都是應用生物學酶消化法或直接細胞刮落法，該些方法對細胞表面蛋白、離子通道、細胞信號等造成損傷的技術性問題。
[0007]本發明的另一目的在于提供上述的溫度敏感型細胞培養裝置的制備方法，以解決現有技術中在組織工程中脫去組織內細胞的方法基本都是應用生物學酶消化法或直接細胞刮落法，該些方法對細胞表面蛋白、離子通道、細胞信號等造成損傷的技術性問題。
[0008]本發明的再一目的在于提供利用上述的溫度敏感型細胞培養裝置培養細胞的方法，以解決現有技術中在組織工程中脫去組織內細胞的方法基本都是應用生物學酶消化法或直接細胞刮落法，該些方法對細胞表面蛋白、離子通道、細胞信號等造成損傷的技術性問題。
[0009]本發明目的通過以下技術方案實現:
[0010]一種溫度敏感型細胞培養裝置，包括聚苯乙烯體，所述聚苯乙烯體上接枝聚苯乙烯-聚N-異丙基丙烯酰胺嵌段聚合物。
[0011]上述的溫度敏感型細胞培養裝置的制備方法，包括以下步驟:
[0012]a、制備聚苯乙烯-聚N-異丙基丙烯酰胺嵌段聚合物；
[0013]b、將制得的聚苯乙烯-聚N-異丙基丙烯酰胺嵌段聚合物接枝在聚苯乙烯體上，得到溫度敏感型細胞培養裝置。
[0014]優選地，所述步驟a進一步包括:在二氧六環中加入聚苯乙烯、異丙基丙烯酰胺單體和偶氮二異丁腈，聚苯乙烯、異丙基丙烯酰胺單體、偶氮二異丁腈的質量之比為1:1:0.01-1:2:0.5，室溫下 攪拌溶解；通氮氣-冷凍-抽排循環3-5次，70-100°C反應10_18h，旋蒸除掉二氧六環，加入四氫呋喃溶解，在乙醚中沉淀，得聚苯乙烯-聚N-異丙基丙烯酰胺嵌段聚合物。
[0015]優選地，所述聚苯乙烯由以下方法制備:在甲苯中將苯乙烯和二硫化二異丙基黃原酸酯混合攪拌均勻，室溫下加入偶氮二異丁腈，苯乙烯、二硫化二異丙基黃原酸酯和偶氮二異丁腈的質量比為(15-20):3:(1-3)，攪拌至偶氮二異丁腈完全溶解，通氮氣，70-90°C反應5-7h，旋蒸除掉甲苯，加入四氫呋喃溶解，在石油醚中沉淀，得聚苯乙烯。
[0016]優選地，所述步驟b進一步包括:將聚苯乙烯體放置到涂層機上，滴加聚苯乙烯-聚N-異丙基丙烯酰胺溶液于聚苯乙烯體上，使涂層機的轉速為2000-35000rpm，懸涂30-60s，將制備好的聚苯乙烯體放入烘箱內在80-120°C烘干2_4h，即得到溫度敏感型細胞培養裝置。
[0017]優選地，還包括以下步驟:用傅立葉紅外光譜分析或接觸角測試的檢測方法驗證是否接枝成功。
[0018]利用上述的溫度敏感型細胞培養裝置培養細胞的方法，包括以下步驟:
[0019]a、對權利要求1所述的溫度敏感型細胞培養裝置進行消毒、滅菌；
[0020]b、用上述的溫度敏感型細胞培養裝置進行細胞培養，培養溫度為35_38°C，待細胞培養結束后，使溫度敏感型細胞培養裝置的溫度降為10-28°C，細胞從溫度敏感型細胞培養裝置上自動脫落。
[0021]優選地，所述細胞包括單克隆抗體活化的免疫細胞、臍帶間充質干細胞、羊膜干細胞、成體組織間充質干細胞和人工誘導的多能干細胞。[0022]優選地，所述滅菌方法選自用苯扎溴銨溶液浸泡、酒精浸泡、EOG滅菌或Y射線滅菌的其中一種。
[0023]優選地，所述自動脫落的細胞可以成團、成片或者單獨分散。
[0024]與現有技術相比，本發明有以下有益效果:
[0025]本發明的溫度敏感型細胞培養裝置在培養細胞時，經簡單的溫度變化，就可以非損傷的獲得完整的培養細胞層及其所沉積的細胞外基質，避免使用胰酶消化或者化學試劑解離，減少了細胞的死亡，降低了對細胞外基質的損傷，提高了培養細胞的質量和活性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1為實施例一中pNIPAAm接枝片的紅外圖譜；
[0027]圖2為實施例一中干細胞在接枝片表面的脫附過程照片；
[0028]圖3為實施例二中人牙髓間充質干細胞原代培養形態學照片(接種后A:24h ；B:7d ；C:10d ；D:15d,40X )；
[0029]圖4為實施例二中人牙髓間充質干細胞的生長曲線圖；
[0030]圖5為接枝片脫落的細胞和胰酶消化收獲的細胞進行損傷檢測的示意圖。
【具體實施方式】
[0031]以下結合實施例，詳細說明本發明。
[0032]實施例一旋 涂法制備溫敏性聚苯乙烯培養片并培養人臍帶間充質干細胞
[0033](I)聚苯乙烯(PS)的合成:在25ml圓底單口燒瓶中，加入IOml干燥甲苯溶劑，將
7.5g苯乙烯和二硫化二異丙基黃原酸酯(DIP)L 5g加入燒瓶中攪拌均勻，室溫下加入0.5gAIBN,攪拌至AIBN完全溶解，用橡皮塞密封，通氮氣-冷凍-抽排循環三次。75°C反應6h，旋蒸除掉甲苯，加入THF溶解，在石油醚中沉淀，得聚苯乙烯(PS) 7.5g。
[0034](2) PS-PNIPAAm的合成:6ml干燥1.4 二氧六環中加入1.0g PS, 1.2g異丙基丙烯酰胺單體，IOmg AIBN，室溫下攪拌溶解。通氮氣-冷凍-抽排循環三次，80°C反應10h，旋蒸除掉1.4 二氧六環，加入THF溶解，在乙醚中沉淀，得PS-PNIPAAm嵌段聚合物1.34g。
[0035](3)將Icm2的聚苯乙烯片放在涂層機的真空吸盤上，將制得的PS-PNIPAAm嵌段聚合物溶解于四氫呋喃中，用注射器將嵌段聚合物溶液滴加到聚苯乙烯片上，3000r旋轉30s，保證懸涂均勻。得到接枝片后放入80°C烘箱中烘干4h待用。圖1給出了 pNIPAAm接枝片的紅外圖譜。其中，在1648cm-l左右位置的吸收峰由酰胺的羰基(C=O)的伸縮振動產生的，即酰胺I帶；而在1550cm-l處的譜帶為酰胺II帶，是由酰胺基團中的N-H彎曲振動和C-H伸縮振動的組合吸收產生的。波數在SOOcm-1附近出現了吸收峰，這是聚苯乙烯中的苯環特征峰。由圖1可判定通過懸涂法已成功將PS-PNIPAAm嵌段聚合物接枝到聚苯乙烯片的表面。
[0036](4)溫敏材料的滅菌處理:接枝片烘干后，于1%苯扎溴銨溶液中浸泡30min，無菌PBS沖洗2次，如此循環重復3次。75%酒精浸泡30min，無菌PBS沖洗2次，此過程也重復3次。將接枝面朝上放入超凈工作臺中，盡量使表面全部暴露在紫外燈光下，紫外照射過夜。滅菌處理后，用無菌鑷子將接枝片放入12孔板中，加新鮮培養液lmL，放入培養箱內檢菌，48h后培養液未變渾濁，即證明滅菌徹底，可用來培養細胞。[0037](5)細胞接種:取第3代DPSCs，胰蛋白酶-EDTA消化，含血清培養液中和。離心，棄上清，調整細胞密度為105個細胞/20 μ L培養液，移取20 μ L細胞懸液輕輕滴加到接枝片的中央，緩慢放入培養箱內。6h后觀察細胞80%以上貼壁，補加ImL預熱的培養液繼續培養。涉及溫敏材料的實驗組的處理過程都要在恒溫板(溫度控制在37°C左右)上進行，以防止細胞在室溫下的自發脫落。
[0038](6)降低溫度收獲細胞:將接枝片置于20°C環境下，吸出原始培養基，再加入新鮮的冷a -MEM培養基，并在細胞與材料表面的邊緣處用移液槍輕輕吹打一次，此時開始持續觀察及拍攝細胞脫附的全過程。如附圖2所示，間充質干細胞接種于溫敏表面24h后，倒置顯微鏡下觀察細胞已全部貼壁。將細胞培養孔板內培養液吸出，加入100yL25°C環境平衡的PBS，置于25°C培養箱內，記錄干細胞在適宜的溫敏表面脫附的整個過程。其中，當冷的PBS加入細胞培養板IOmin后，溫敏表面接枝的共聚物膜邊緣區域開始變厚并更具親水性，約40min之后98%以上的細胞從溫敏表面脫落。
[0039]實施例二人牙髓間充質干細胞在接枝片中培養
[0040](I)在IOml圓底單口燒瓶中，加入5ml干燥甲苯溶劑，將12g苯乙烯和二硫化二異丙基黃原酸酯(DIP) 2.4g加入燒瓶中攪拌均勻，室溫下加入0.8gAIBN，攪拌至AIBN完全溶解，用橡皮塞密封，通氮氣-冷凍-抽排循環三次。75°C反應5h，旋蒸除掉甲苯，加入THF溶解，在石油醚中沉淀，得聚苯乙烯(PS )。
[0041](2) PS-PNIPAAm的合成:10ml干燥1.4 二氧六環中加入3.0g PS，6.0g異丙基丙烯酰胺單體，150mg AIBN,室溫下攪拌溶解。通氮氣-冷凍-抽排循環五次，90°C反應15h，旋蒸除掉1.4 二氧六環，加入THF溶解，在乙醚中沉淀，得PS-PNIPAAm嵌段聚合物。
[0042](3)將制得的PS-PNIPAAm嵌段聚合物溶解于四氫呋喃中。Icm2聚苯乙烯片放在涂層機的真空吸盤上，用注 射器將嵌段聚合物溶液滴加到聚苯乙烯片上，5000rpm旋轉60s，保證懸涂均勻。得到接枝片后放入100°C烘箱中烘干3h待用。
[0043](4)將接枝片于75%酒精中放置lh，然后無菌條件下烘干，紫外線照射5h，備用。
[0044](5)消化人牙髓間充質干細胞，按照15*5/ml的密度接種于接枝片中，放置于24孔板進行培養，每隔3天換液，培養8天后，將接枝片放置于25攝氏度無菌環境，觀察細胞的脫附情況。請參閱圖3，細胞傳代后，貼壁速度增快，生長迅速。當細胞傳至第4代時仍然維持較快的生長速度，培養4天左右，細胞鋪滿皿底，融合成片，細胞排列整齊，分布均勻，生長一致。請參閱圖4，所示的DPSCs的生長曲線呈S形，接種后第O?2天為潛伏適應期，細胞無明顯增殖從第3天起細胞開始增殖并進入對數生長期，第6天達到高峰，以后進入平臺期。根據生長曲線可知DPSCs的群體倍增時間為33.8h。
[0045]實施例三人羊膜間充質干細胞在接枝片表面生長與脫附
[0046](I)PS-PNIPAAm嵌段共聚物的合成:50ml干燥1.4 二氧六環中加入5.0gPS，IOg異丙基丙烯酰胺單體，80mg AIBN，室溫下攪拌溶解。通氮氣-冷凍-抽排循環三次，100°C反應12h，旋蒸除掉1.4 二氧六環，加入THF溶解，在乙醚中沉淀，得PS-PNIPAAm嵌段聚合物。
[0047](2)將制得的PS-PNIPAAm嵌段聚合物溶解于四氫呋喃中。聚苯乙烯材料切割成5cm2的面積，將聚苯乙烯片放在涂層機的真空吸盤上，用注射器將嵌段聚合物溶液滴加到聚苯乙烯片上，8000rpm旋轉40s,保證懸涂均勻。得到接枝片后放入100°C烘箱中烘干3h待用。[0048](3)溫敏材料的滅菌處理:接枝片烘干后，于1%苯扎溴銨溶液中浸泡30min，無菌PBS沖洗2次，75%酒精浸泡30min，無菌PBS沖洗2次，重復3次。紫外照射過夜。
[0049](4)細胞接種:取第3代人羊膜間充質干細胞，調整細胞密度為106個細胞/100 μ L培養液，移取100 μ L細胞懸液輕輕滴加到PS片的中央，5h之后，添加培養基培養。將細胞接種于接枝片表面，置于培養箱內進行培養，5h后倒置顯微鏡下觀察，可看到90%以上的細胞附著于溫敏材料的表面，呈現半貼壁的狀態。待細胞接種24h時觀察到細胞所有細胞均已完全貼壁生長。
[0050](5)降低溫度收獲細胞:細胞在37°C培養7天之后，將接枝片置于20°C環境下，吸出原始培養基，再加入新鮮的冷a -MEM培養基，并在細胞與材料表面的邊緣處用移液槍輕輕吹打一次，此時開始持續觀察及拍攝細胞脫附的全過程。對從接枝片脫落的細胞和胰酶消化收獲的細胞進行損傷檢測，檢測結果如圖5所示，可以看出完全裂解的細胞、胰酶消化收獲的細胞和降低溫度收獲的細胞釋放的乳酸脫氫酶含量依次降低，且存在顯著性差異。說明降低溫度相較于胰酶消化可以降低對收獲質細胞的損傷。
[0051]本發明的溫度敏感型細胞培養裝置在培養細胞時，經簡單的溫度變化，就可以非損傷的獲得完整的培養細胞層及其所沉積的細胞外基質，避免使用胰酶消化或者化學試劑解離，減少了細胞的死亡，降低了對細胞外基質的損傷，提高了培養細胞的質量和活性。
[0052]以上公開的僅為本申請的幾個具體實施例，但本申請并非局限于此，任何本領域的技術人員能思之的變 化，都應落在本申請的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種溫度敏感型細胞培養裝置，其特征在于，包括聚苯乙烯體，所述聚苯乙烯體上接枝聚苯乙烯-聚N-異丙基丙烯酰胺嵌段聚合物。
2.如權利要求1所述的溫度敏感型細胞培養裝置的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: a、制備聚苯乙烯-聚N-異丙基丙烯酰胺嵌段聚合物； b、將制得的聚苯乙烯-聚N-異丙基丙烯酰胺嵌段聚合物接枝在聚苯乙烯體上，得到溫度敏感型細胞培養裝置。
3.如權利要求2所述的溫度敏感型細胞培養裝置的制備方法，其特征在于，所述步驟a進一步包括:在二氧六環中加入聚苯乙烯、異丙基丙烯酰胺單體和偶氮二異丁腈，聚苯乙烯、異丙基丙烯酰胺單體、偶氮二異丁腈的質量之比為1:1:0.01-1:2:0.5，室溫下攪拌溶解；通氮氣-冷凍-抽排循環3-5次，70-100°C反應10-18h，旋蒸除掉二氧六環，加入四氫呋喃溶解，在乙醚中沉淀，得聚苯乙烯-聚N-異丙基丙烯酰胺嵌段聚合物。
4.如權利要求3所述的溫度敏感型細胞培養裝置的制備方法，其特征在于，所述聚苯乙烯由以下方法制備:在甲苯中將苯乙烯和二硫化二異丙基黃原酸酯混合攪拌均勻，室溫下加入偶氮二異丁腈，苯乙烯、二硫化二異丙基黃原酸酯和偶氮二異丁腈的質量比為(15-20):3:(1-3)，攪拌至偶氮二異丁腈完全溶解，通氮氣，70-901:反應5_7h，旋蒸除掉甲苯，加入四氫呋喃溶解，在石油醚中沉淀，得聚苯乙烯。
5.如權利要求2所述的溫度敏感型細胞培養裝置的制備方法，其特征在于，所述步驟b進一步包括:將聚苯乙烯體放置到涂層機上，滴加聚苯乙烯-聚N-異丙基丙烯酰胺溶液于聚苯乙烯體上，使涂層機的轉速為2000-35000rpm，懸涂30_60s，將制備好的聚苯乙烯體放入烘箱內在80-120°C烘干2-4h，即得到溫度敏感型細胞培養裝置。
6.如權利要求2所述的 溫度敏感型細胞培養裝置的制備方法，其特征在于，還包括以下步驟:用傅立葉紅外光譜分析或接觸角測試的檢測方法驗證是否接枝成功。
7.一種利用權利要求1所述的溫度敏感型細胞培養裝置培養細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟: a、對權利要求1所述的溫度敏感型細胞培養裝置進行消毒、滅菌； b、用上述的溫度敏感型細胞培養裝置進行細胞培養，培養溫度為35-38°C，待細胞培養結束后，使溫度敏感型細胞培養裝置的溫度降為10-28°C，細胞從溫度敏感型細胞培養裝置上自動脫落。
8.如權利要求7所述的培養細胞的方法，其特征在于，所述細胞包括單克隆抗體活化的免疫細胞、臍帶間充質干細胞、羊膜干細胞、成體組織間充質干細胞和人工誘導的多能干細胞。
9.如權利要求7所述的培養細胞的方法，其特征在于，所述滅菌方法選自用苯扎溴銨溶液浸泡、酒精浸泡、EOG滅菌或Y射線滅菌的其中一種。
10.如權利要求7所述的培養細胞的方法，其特征在于，所述自動脫落的細胞可以成團、成片或者單獨分散。
【文檔編號】C08J7/12GK103436444SQ201310321123
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月26日 優先權日:2013年7月26日
【發明者】齊念民, 杜明明, 馮見, 陳彥田 申請人:上海瀚正生物技術服務有限公司